細(xì)胞工程第三細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法

細(xì)胞工程第三細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法第1頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二一、無(wú)菌操作技術(shù)1.實(shí)驗(yàn)器具和材料的準(zhǔn)備根據(jù)使用器材不同選擇正確合適的方法進(jìn)行消毒和滅菌。2.培養(yǎng)室和超凈臺(tái)的消毒地面：0.1%新潔爾滅或2--5%來(lái)蘇爾滅菌，紫外線照射30-50min；超凈工作臺(tái)及器具：每次實(shí)驗(yàn)前95%酒精擦拭消毒，紫外線照射消毒。3.洗手和著裝：口罩、無(wú)菌服、帽子紫外線照射消毒；手部消毒。第2頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二4.無(wú)菌培養(yǎng)操作：無(wú)菌操作技術(shù)要領(lǐng)點(diǎn)燃酒精燈：加熱消毒。動(dòng)作準(zhǔn)確敏捷：不應(yīng)太快。不用手觸及已消毒物品操作面布局合理操作保持一定順序培養(yǎng)用瓶和吸管的放置防止各種用液的交叉污染不向操作者講話或咳嗽維護(hù)各種設(shè)備，保持良好工作狀態(tài)。第3頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二超凈臺(tái)內(nèi)培養(yǎng)用品布局第4頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第5頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

二、培養(yǎng)細(xì)胞的觀察（一）相差顯微鏡觀察1.原理：利用光在通過(guò)不同密度物質(zhì)時(shí)的折射率和物體厚度差別，由于折射光程不同產(chǎn)生衍射而引起的光程變化。光程的變化引起相位差變化來(lái)觀察物體結(jié)構(gòu)。一般情況下人眼不能分辨相差，而相差顯微鏡利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變?yōu)檎穹罴懊靼抵?，就可以分辨出被檢物體的結(jié)構(gòu)。第6頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

2.生長(zhǎng)良好的細(xì)胞的鏡下?tīng)顟B(tài)：A.在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓清。相差顯微鏡觀察時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞部分細(xì)微結(jié)構(gòu)。B.若細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不良，可見(jiàn)細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞折光性變?nèi)?，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物質(zhì)，細(xì)胞之間空隙增大，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，甚至失去原有細(xì)胞的特點(diǎn)，產(chǎn)生圓縮脫落，有時(shí)細(xì)胞表面及周圍出現(xiàn)絲絮狀物。發(fā)現(xiàn)這種情況應(yīng)及時(shí)處理。第7頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（二）倒置顯微鏡1.光源和聚光器位于載物臺(tái)上方。2.物鏡位于載物臺(tái)下方。3.載物臺(tái)上可放置培養(yǎng)皿，便于觀察貼服于底壁上的活細(xì)胞。4.倒置顯微鏡可裝配各種輔助設(shè)備：相差長(zhǎng)焦距聚光器、暗視野聚光器、熒光顯微鏡光源、恒溫調(diào)節(jié)器、照相機(jī)、攝影機(jī)等。5.可根據(jù)不同觀察目的選用不同的相差物鏡：正反差物鏡、PL物鏡、PLL物鏡、NH物鏡。第8頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二培養(yǎng)的CHO細(xì)胞

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞第9頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第10頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二1.用相差顯微鏡觀察細(xì)胞應(yīng)注意瓶（或皿）的厚度、均勻性、清潔度、氣溫等。2.天氣較冷時(shí)，若與顯微鏡觀察處溫差較大，由于溫差使培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)壁形成霧滴而影響觀察的清晰度，此時(shí)可輕輕將瓶?jī)A斜使瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液浸潤(rùn)內(nèi)壁，以得到好的相差像。3.若對(duì)原代細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行相差顯微照相，最好選擇換液后進(jìn)行。（三）相差顯微鏡觀察活細(xì)胞的注意事項(xiàng)第11頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞生長(zhǎng)狀況有關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)方法

1.細(xì)胞計(jì)數(shù)

（四）、培養(yǎng)細(xì)胞的觀察利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)目，以測(cè)定細(xì)胞增殖和調(diào)整細(xì)胞濃度的方法。第12頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第13頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二Cellcountingusingahaemocytometer第14頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二計(jì)算四角大方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)；每個(gè)方格容積為1×10-4ml第15頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞數(shù)/ML＝4大格細(xì)胞總數(shù)/4×10000×稀釋倍數(shù)1毫米計(jì)數(shù)原則：不數(shù)死細(xì)胞（染藍(lán)）、壓線細(xì)胞數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右，一團(tuán)細(xì)胞按一個(gè)計(jì)數(shù)！1毫升＝1立方厘米

第16頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第17頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二三、培養(yǎng)細(xì)胞的檢測(cè)指標(biāo)

2.細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：觀察細(xì)胞在一代生存期內(nèi)的增生過(guò)程的重要指標(biāo)；培養(yǎng)時(shí)間d為橫坐標(biāo)，細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)作坐標(biāo)圖。條件：具備自身穩(wěn)定生長(zhǎng)特性。第18頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二◆生長(zhǎng)曲線是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一，是測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)生長(zhǎng)數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)。◆常用于測(cè)定藥物等外來(lái)因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響！細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

第19頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二3.細(xì)胞分裂指數(shù)

細(xì)胞分裂指數(shù)是表示細(xì)胞增殖旺盛程度的指標(biāo)。它以被測(cè)1000個(gè)細(xì)胞中的分裂細(xì)胞數(shù)來(lái)計(jì)算。測(cè)定方法：用秋水仙素將細(xì)胞處理1～2小時(shí)后，按染色體制片法制片并染色，計(jì)算1000個(gè)細(xì)胞中分裂相的數(shù)目，重復(fù)4次取平均值，用百分比表示。分裂指數(shù)=分裂細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%第20頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二4.細(xì)胞貼壁率細(xì)胞貼壁率又稱細(xì)胞接種存活率。它是細(xì)胞被制成分散的懸液后，以低密度(2～5個(gè)細(xì)胞/cm2)被接種到底物上，貼壁并能存活生長(zhǎng)形成細(xì)胞小群(克隆)的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)值，用以表示細(xì)胞的生存能力和細(xì)胞群的活力。

第21頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞接種存活率只表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞數(shù)，但貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞?？寺⌒纬陕史从臣?xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，細(xì)胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱，傳代細(xì)胞系強(qiáng)；二倍體細(xì)胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng)；正常細(xì)胞克隆形成率弱，腫瘤細(xì)胞強(qiáng)。第22頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二5.細(xì)胞周期

一個(gè)細(xì)胞分裂生長(zhǎng)周期時(shí)間；與細(xì)胞群體倍增時(shí)間的區(qū)別（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)細(xì)胞數(shù)量增加一倍所用的時(shí)間）。標(biāo)記有絲分裂百分率法（percentagelabeledmitoses，PLM）：對(duì)測(cè)定細(xì)胞進(jìn)行脈沖標(biāo)記、定時(shí)取材、利用放射自顯影技術(shù)顯示標(biāo)記細(xì)胞，通過(guò)統(tǒng)計(jì)標(biāo)記有絲分裂細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的辦法來(lái)測(cè)定細(xì)胞周期。放射標(biāo)記物為3H或者14C標(biāo)記的TdR。第23頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二G1：DNA合成前期S：DNA合成期G2：DNA合成后期M：有絲分裂期第24頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第25頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二6.MTT法測(cè)定細(xì)胞活力

四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)四唑鹽比色法的原理：活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲臜（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。MTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等?；罴?xì)胞率=（細(xì)胞總數(shù)-死細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)x100%第26頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二三、細(xì)胞培養(yǎng)中常用的染色方法（一）活體染色在體外條件下用某種染色劑對(duì)活的組織或細(xì)胞進(jìn)行染色，而不影響活細(xì)胞生命活動(dòng)的方法。活體染料：堿性活體染料+酸性活體染料常用堿性活體染料，使用濃度較低，0.005%、0.01%、0.1%、0.2%，采用平衡鹽溶液、PBS、生理鹽水配制。第27頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二1.臺(tái)盼藍(lán)染色

用0.5%濃度的臺(tái)盼藍(lán)（Trypanblue）,用PBS配制，室溫保存，該染料只對(duì)死細(xì)胞著色（藍(lán)色），可測(cè)定活細(xì)胞數(shù)和計(jì)算存活百分率。

（二）染料排除檢測(cè)法第28頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二熒光染料染色觀察

2.溴化乙錠（EB）和碘化丙啶（PI）染色嵌入核酸雙鏈之間，只能標(biāo)記死細(xì)胞?。t色熒光）3.AcridineOrange（AO）丫啶橙直接染色觀察活細(xì)胞，同時(shí)標(biāo)記DNA和RNADNA：亮綠色熒光RNA：橘紅色--紅色熒光第29頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二吖啶橙(AO)能透過(guò)胞膜完整的細(xì)胞，嵌入細(xì)胞核DNA，使之發(fā)出明亮的綠色熒光。溴乙錠僅能透過(guò)胞膜受損的細(xì)胞，嵌入核DNA，發(fā)橘紅色熒光。凋亡的細(xì)胞呈現(xiàn)為染色增強(qiáng)，熒光更為明亮，均勻一致的圓狀或固縮狀、團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)。非凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)熒光深淺不一的結(jié)構(gòu)樣特征。在熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)四種細(xì)胞形態(tài)：活細(xì)胞(VN)，核染色質(zhì)著綠色并呈正常結(jié)構(gòu)；早期凋亡細(xì)胞(VA)，核染色質(zhì)著綠色呈固縮狀或圓珠狀；非凋亡的死亡細(xì)胞(NVN)，核染色質(zhì)著橘紅色并呈正常結(jié)構(gòu)；晚期凋亡細(xì)胞(NVA)，核染色質(zhì)為橘紅色呈固縮狀或圓珠狀。第30頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二1污染及途徑：細(xì)胞培養(yǎng)中，與培養(yǎng)無(wú)關(guān)的雜質(zhì)的混入培養(yǎng)系統(tǒng)統(tǒng)稱為污染?！艨諝猓鹤钪饕緩?，消毒不嚴(yán)格，季節(jié)、凈化工作臺(tái)故障、濕度、溫度、周邊環(huán)境等?！羝鞑那逑聪静粡氐住舨僮鳎夯竟Σ辉鷮?shí)、不認(rèn)真、不規(guī)范、交叉污染、器具消毒不嚴(yán)格等?！粞澹褐苽渌降停гw或病毒污染?！艚M織樣本四、細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測(cè)第31頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二最嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)-污染(contamination)

細(xì)胞培養(yǎng)的污染問(wèn)題十分重要，一旦發(fā)生污染，將導(dǎo)致前功盡棄。所以細(xì)胞培養(yǎng)一定要建立無(wú)菌觀念。遇到培養(yǎng)污染要分析原因，及時(shí)處理。培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無(wú)法挽回，加入抗生素也基本無(wú)能為力。特別是霉菌和細(xì)菌。第32頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

1.細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的污染物有細(xì)菌、酵母菌、真菌、支原體和病毒等。在出現(xiàn)以下情況時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞可能有污染：a.培養(yǎng)液的酸堿度發(fā)生異常的改變。b.培養(yǎng)液出現(xiàn)混濁。c.光鏡觀察到菌絲和顆粒。d.細(xì)胞出現(xiàn)死亡或增殖緩慢等2.常見(jiàn)污染及判斷第33頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2.細(xì)菌污染：常見(jiàn)革蘭氏陰性菌（白色葡萄球菌）、大腸桿菌、假單胞菌。現(xiàn)象：初期變化不明顯，后期培養(yǎng)液渾濁，鏡下可見(jiàn)菌體。預(yù)防：青霉素和鏈霉素可預(yù)防。第34頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二3.真菌污染：常見(jiàn)煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。特點(diǎn)：大多呈白色或淺黃色小點(diǎn)漂浮于培養(yǎng)液表面；鏡下呈絲狀、管狀或樹(shù)枝狀，縱橫交錯(cuò)，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間?？拐婢苿┛深A(yù)防和排除真菌污染。第35頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二4.支原體污染：介于細(xì)菌和病毒之間，能獨(dú)立生活的最小微生物。最常見(jiàn)、不易察覺(jué)；大小介于0.2-2μm，約1%可通過(guò)濾菌器對(duì)酸耐受性差，對(duì)熱較敏感，青霉素?zé)o效?！罢！备杏X(jué)。支原體污染細(xì)胞后，能抑制細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)，改變核酸合成，影響細(xì)胞的抗原性，引起細(xì)胞染色體改變，干擾DNA的復(fù)制，以及具有類病毒作用。在培養(yǎng)細(xì)胞初期，由于支原體對(duì)細(xì)胞的繁殖影響較小而往往被忽略。

第36頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二支原體檢測(cè)方法和處理1）熒光技術(shù)檢測(cè)：支原體含有DNA，能與一種熒光染料Hoechest33258特異性的結(jié)合，可根據(jù)細(xì)胞表面的熒光來(lái)顯示細(xì)胞是否污染有支原體。2）直接培養(yǎng)法：實(shí)驗(yàn)室常用。3）放射自顯影檢測(cè)：4）DNA分子雜交及PCR法5）電鏡檢測(cè)法6）3H-胸腺嘧啶摻入法第37頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二在Vero細(xì)胞核外與細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色螢光小點(diǎn)和絲狀點(diǎn)，表示測(cè)試樣品有支原體的污染。螢光顯微鏡下，只觀察到Vero細(xì)胞的細(xì)胞核，測(cè)試樣品沒(méi)有支原體的污染。第38頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期二支原體污染細(xì)胞的Hoechst