蛋白質(zhì)純化技術(shù)上

蛋白質(zhì)純化技術(shù)上第1頁，共24頁，2023年，2月20日，星期二概述

蛋白質(zhì)的分離純化是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成和生物功能的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)在自然界中存在于復(fù)雜的混合體系中，而且許多重要的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的含量極低。要把蛋白質(zhì)從復(fù)雜的體系中分離出來，同時又要防止其組成、結(jié)構(gòu)的改變和生物活性的喪失，顯然是有相當(dāng)難度的。第2頁，共24頁，2023年，2月20日，星期二概述細(xì)胞破碎蛋白溶解酸、堿醇去垢劑尿素……粗提沉淀相分離分子篩……精提各種色譜電泳分離差速離心……研磨超聲滲透壓酶……保存預(yù)處理原材料的獲取濃縮保存狀態(tài)保存條件保存期限……第3頁，共24頁，2023年，2月20日，星期二原材料的獲取動物植物培養(yǎng)物第4頁，共24頁，2023年，2月20日，星期二預(yù)處理材料的收集過濾離心顆?；幚砑羟醒心サ?頁，共24頁，2023年，2月20日，星期二預(yù)處理離心A19thcenturyhandcrankedlaboratorycentrifuge.

離心是利用離心力，分離液體與固體顆?；蛞后w與液體的混合物中各組分的方法。

第6頁，共24頁，2023年，2月20日，星期二預(yù)處理粒子在離心場中的運動速度：離心加速度：離心分離因數(shù)：Fr≤3500常速離心Fr=3500~50000高速離心Fr>50000超速離心第7頁，共24頁，2023年，2月20日，星期二預(yù)處理rpm與g的換算（r,旋轉(zhuǎn)半徑，cm;N，轉(zhuǎn)速，rpm）沉降系數(shù)每單位離心場的速度1S=10-13s第8頁，共24頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞破碎機械方法非機械方法攪拌、振動研磨壓濾超聲勻漿干燥滲透壓凍融酶第9頁，共24頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞破碎超聲破碎頻率高于20000HZ的聲波稱為“超聲波”。超聲破碎的原理——空化作用當(dāng)超聲波在液體中傳播時，由于液體微粒的劇烈振動，會在液體內(nèi)部產(chǎn)生小空洞。這些小空洞迅速脹大和閉合，會使液體微粒之間發(fā)生猛烈的撞擊作用，從而產(chǎn)生幾千到上萬個大氣壓的壓強。微粒間這種劇烈的相互作用，會使液體的溫度驟然升高，起到了很好的攪拌作用，從而使兩種不相溶的液體（如水和油）發(fā)生乳化，并且加速溶質(zhì)的溶解，加速化學(xué)反應(yīng)。這種由超聲波作用在液體中所引起的各種效應(yīng)稱為超聲波的空化作用。

第10頁，共24頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞破碎超聲破碎影響超聲破碎的因素-超聲波強度：對于一般液體超聲波強度增加時，空化強度增大，但達(dá)到一定值后，空化趨于飽和。-超聲波振幅：振幅越大，效率越高。-超聲波頻率：頻率越低，在液體中產(chǎn)生空化越容易。-液體的表面張力與黏滯系數(shù)：液體的表面張力越大，越不易于產(chǎn)生空化，黏滯系數(shù)大的液體難以產(chǎn)生空化泡。-液體的溫度：液體溫度越高，對空化的產(chǎn)生越有利，但是溫度過高時，氣泡中蒸汽壓增大，因此氣泡閉合時增強了緩沖作用而使空化減弱。

-探頭的材料與形狀

功率恒定時，探頭的振幅與面積成反比。鈦是最好的探頭材料。-處理量

大體積的處理對象需要更大的功率。第11頁，共24頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞破碎超聲破碎利用超聲波進(jìn)行細(xì)胞破碎時，體系中會產(chǎn)生自由基，它可能破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，因此進(jìn)行超聲破碎之前，需可以添加自由基清除劑，如還原型的GSH，也可以用氫氣預(yù)吹細(xì)胞懸浮液來緩和。第12頁，共24頁，2023年，2月20日，星期二滲透壓

溶液滲透壓，簡單的說，是指溶液中溶質(zhì)微粒對水的吸引力。溶液滲透壓的大小取決于單位體積溶液中溶質(zhì)微粒的數(shù)目：溶質(zhì)微粒越多，即溶液濃度越高，對水的吸引力越大，溶液滲透壓越高；反過來，溶質(zhì)微粒越少，滲透壓就低。滲透壓與無機鹽、蛋白質(zhì)的含量有關(guān)。在組成細(xì)胞外液的各種無機鹽離子中，含量上占有明顯優(yōu)勢的是Na+和Cl-，細(xì)胞外液滲透壓的90%以上來源于Na+和Cl-。細(xì)胞破碎第13頁，共24頁，2023年，2月20日，星期二滲透壓細(xì)胞破碎第14頁，共24頁，2023年，2月20日，星期二滲透壓細(xì)胞破碎直接低滲溶液處理化學(xué)滲透有機溶劑（Benzene、Methylbenzene）抗生素（Penicillin）表面活性劑（Triton)金屬螯合劑(EDTA)變性劑(Urea)改變細(xì)胞壁或者細(xì)胞膜通透性第15頁，共24頁，2023年，2月20日，星期二酶破碎法細(xì)胞破碎第16頁，共24頁，2023年，2月20日，星期二蛋白的溶解

為了方便提取與分離目的蛋白，通常需要把所有的蛋白（目的蛋白和雜蛋白）都溶解在同一體系中，然后再根據(jù)它們在液相中的不同性質(zhì)而將它們進(jìn)行分離與純化。第17頁，共24頁，2023年，2月20日，星期二蛋白的溶解

清蛋白可溶于稀鹽、稀酸、稀堿。可被飽和硫酸銨沉淀。eg:白蛋白，卵清蛋白

球蛋白不溶于水但溶于稀鹽，可以被半飽和的硫酸銨沉淀。eg:IgG，肌球蛋白

谷蛋白不溶于水、醇和中性鹽溶液，但溶于稀酸或稀堿。eg:米谷蛋白

谷醇溶蛋白不溶于水及無水乙醇，但溶于70-80%乙醇中。非極性側(cè)鏈多eg:小麥醇溶蛋白

組蛋白溶于水和稀酸，但可被稀氨水沉淀，分子中含His、Lys多。eg:小牛胸腺組蛋白

魚精蛋白溶于水及稀酸，不溶于氨水，分子呈堿性。eg:鮭精蛋白

硬蛋白不溶于水、稀酸、稀堿、鹽。有較強機械強度。eg:角蛋白，膠原第18頁，共24頁，2023年，2月20日，星期二蛋白的溶解面對的問題雜質(zhì)的去除蛋白的穩(wěn)定溶解體系與條件第19頁，共24頁，2023年，2月20日，星期二蛋白的溶解雜質(zhì)的去除脂類：離心：吸去浮在表面的脂類；SiO2：待蛋白全部溶解完后吸附，再離心除去。石油醚：比較適合固態(tài)蛋白中脂雜質(zhì)的去除。核酸：核酸酶：將核酸直接分解為核苷酸。鏈霉素：與DNA結(jié)合形成沉淀。硫酸魚精蛋白：帶正電，可與DNA結(jié)合，主要用于生產(chǎn)疫苗中除去NDA，也用于蛋白純化中除去DNA，尤其是純化DNA結(jié)合蛋白。MnCl2：可與核酸一起形成核酸錳，但可以加強DNA與組蛋白結(jié)合。第20頁，共24頁，2023年，2月20日，星期二蛋白的溶解蛋白的穩(wěn)定天冬氨酸蛋白酶抑制劑碘乙酸，PMSF，Pepstatin，云芝發(fā)酵物巰基蛋白酶抑制劑PMSF，TLCK，N-乙基順丁烯二酰亞胺

TPCK，Antipain-HCL

絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF，AEBSF-HClAprotinin，ChymostatinLeupeptin蘇氨酸蛋白酶抑制劑Unknown金屬離子螯合劑EDTA，EGTA，塔羅肽（馬組鏈霉菌）蛋白酶第21頁，共24頁，2023年，2月20日，星期二蛋白的溶解溶解體系與條件>>>離子條件

不同蛋白溶解所需要的離子條件是不相同的，一般根據(jù)需要選擇合適的離子種類及濃度。大部分水溶性蛋白均可溶在0.02～0.05M磷酸鹽緩沖液或碳酸鹽緩沖液，也可溶于0.15MNaCl溶液中。但是少數(shù)蛋白溶解對離子濃度依賴性比較強，這些性質(zhì)也可以用來作為粗提的理論依據(jù)。如肌球蛋白在0.6MKCl中溶解度最大，偏離這一濃度則溶解度下降，利用這一性質(zhì)可將其與其它蛋白分開。膠原蛋白多在1MNaCl溶液中有較大溶解度，NaCl濃度大于2.4M時，立即形成沉淀。第22頁，共24頁，2023年，2月20日，星期二蛋白的溶解溶解體系與條件>>>體系的兼容

在選擇溶解體系時，要充分地考慮到所采用的離子之間是否兼容，離子的種類以及離子濃度是否和體系后來要加入的物質(zhì)兼容。常見不兼容體系可考慮以下因素：1、二價及以上陽離子在堿性體系中不能穩(wěn)定存在，尤其是Fe2+、Mn2+、Ni2+等過渡金屬離子。2、如果體系中嚴(yán)格不能有二價離子影響，則調(diào)pH時不能選用KOH、NaOH?？捎肨ris。3、磷酸鹽、碳酸鹽可以與二價及以上金屬離子形成沉淀。4、Tris、EDTA可以與二價金屬離子形成絡(luò)合物。檸檬酸鹽可以與蛋白質(zhì)形成金屬復(fù)合物。5、有的酶需要金屬離子存在才能有活性，有些酶則在特定金屬離子存在下完全失活。6、有些特殊的離子需要用特殊的螯合劑才能絡(luò)合，如鄰二氮雜菲可以用來螯合Zn2+。7、一些離子存在與去垢劑不兼容的情況，長鏈脂肪酸與二價陽離子可形成沉淀，如脫氧膽酸鈉在Ca2+、Mg2+溶液中就不能溶解，但其?；撬嵫苌锊粫c二價陽離子形成沉淀。8、當(dāng)pH>8時，鈉離子的存在會使脫氧膽酸鈉CMC值變小。9、Hepes等具有哌嗪基的試劑在溶液中會形成自由基，會干擾氧化還原緩沖體系。10、有些離子或去垢劑會對蛋白質(zhì)定量實驗產(chǎn)生較大干擾，如TritonX-100在280nm處有吸收峰，Hepes會干擾Lowry法定量，大部分去垢劑都會干擾Bradford測定。第23頁，共24頁，2023年，2月20日，星期