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文檔簡介
———MIQE指南:RT-qPCR中的逆轉(zhuǎn)錄詳解
1、
逆轉(zhuǎn)錄是以RNA為模板合成DNA的過程,即RNA指導(dǎo)下的DNA合成。在逆轉(zhuǎn)錄過程中必不可少的逆轉(zhuǎn)錄酶,除了其依賴RNA的DNA聚合酶活性,還需要鎂離子或錳離子等輔助因子,同時包括依賴于DNA的DNA聚合酶活性和RNaseH活性,它可以降解DNA與RNA雜交鏈中的RNA鏈。與典型的DNA聚合酶不同,逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校對功能,在PCR實(shí)驗(yàn)中逆轉(zhuǎn)錄酶存在抑制Taq聚合酶活性的功能,進(jìn)而導(dǎo)致不準(zhǔn)確的測定結(jié)果。
目前,最常用的逆轉(zhuǎn)錄酶類型有兩種,一是來自禽類成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)的逆轉(zhuǎn)錄酶,二是來自莫洛尼小鼠白血病病毒(M-MLV)的逆轉(zhuǎn)錄酶。AMV逆轉(zhuǎn)錄酶相對于其他類型的逆轉(zhuǎn)錄酶,它更具有加工性,具有更高的最佳活性溫度范圍(42~48C),更適合逆轉(zhuǎn)錄具有較強(qiáng)二級結(jié)構(gòu)的RNA。然而,AMV逆轉(zhuǎn)錄酶具有相對較高的RNaseH活性,這使其在合成長轉(zhuǎn)錄本方面的作用較小。相比之下,M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶是由一個單一的亞基組成,具有較低的RNaseH活性,由于這些特性,M-MLVRT經(jīng)常被用于較長的轉(zhuǎn)錄本。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶最適活性溫度為37C。許多M-MLV變體是可用的,包括RNaseH點(diǎn)突變體,它們更耐熱,更適合復(fù)雜困難的模板。
2、工作流程和用途
逆轉(zhuǎn)錄可用于生成適合各種下游應(yīng)用的cDNA?!鴪D1RNA工作流程
在某些情況下,逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時熒光定量PCR在一個單一的反應(yīng)混合液中反應(yīng)時,稱為一步法RT-qPCR。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時PCR在不同的反應(yīng)混合液中發(fā)生時,被稱為兩步法RT-qPCR。
▲圖2兩步法RT-qPCR工作流程
當(dāng)需要大量cDNA通過PCR或qPCR研究多個轉(zhuǎn)錄本時,兩步法是首選。在一步法RT-qPCR中,目標(biāo)序列在同一反應(yīng)孔或容器中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qPCR擴(kuò)增。用隨機(jī)引物或oligo(dT)引物代替目標(biāo)特異性引物。一步法RT-qPCR相對于兩步法RT-qPCR需要的樣本更少。此外,任何技術(shù)重復(fù)之間的方差都可以用來評估這兩個酶促步驟的聯(lián)合可變性。一步法RT-qPCR經(jīng)常被用于RNA的定量和質(zhì)量控制。一步法可能的劣勢在于引物設(shè)計(jì)更復(fù)雜,因?yàn)橐锉仨氃谀孓D(zhuǎn)錄和PCR溫度下同時發(fā)揮作用。3、考量點(diǎn)
理想情況下,每一個靶向轉(zhuǎn)錄的RNA或mRNA分子都將轉(zhuǎn)化為一個cDNA分子,即所有的靶RNA都將以相同的效率轉(zhuǎn)錄。然而,RT效率的可變性,無論是由于RNA樣本質(zhì)量、引物設(shè)計(jì)、RT酶的選擇,還是其他因素,都會影響所產(chǎn)生的代表RNA分子在樣本中的分布程度的cDNA。RT效率的變化是在RT-qPCR反應(yīng)總體結(jié)果質(zhì)量中一個被嚴(yán)重低估的因素,其影響已延伸到大量已發(fā)表的基因表達(dá)研究。MIQE指南中概述的如樣本、核酸提取和逆轉(zhuǎn)錄細(xì)節(jié),均是為了可以獲得有效的RT-qPCR結(jié)果。成功的逆轉(zhuǎn)錄考量參數(shù)有以下幾點(diǎn):RNA純化和純度:
在選擇RNA提取方法時,需要考慮許多參數(shù),但理想情況下,RNA樣本應(yīng)該不受污染蛋白質(zhì),如核酸酶,這可能會干擾cDNA合成和下游應(yīng)用。產(chǎn)量是一個主要的考慮因素,然而,有效地去除基因組DNA(gDNA)同樣重要。即使是少量的gDNA污染也會導(dǎo)致qPCR結(jié)果的可變性,而大量的gDNA污染也會導(dǎo)致直接的定量錯誤。減少對gDNA污染一種方法是在RNA分離方法中加入一個DNase酶消化的步驟。此外,應(yīng)使用無逆轉(zhuǎn)錄酶對照(無RT)來確定RNA樣本中是否存在gDNA。RNA完整性:
RNA樣本的完整性對于許多下游應(yīng)用都是至關(guān)重要的。完整的真核生物的RNA一個重要特征是同時存在28S和18S核糖體RNA(rRNA)(圖3)。這些條帶的存在和整體RNA質(zhì)量可以通過瓊脂糖凝膠電泳和其他方法來評估。理想情況下,在瓊脂糖凝膠上顯示時,28S帶的亮度應(yīng)該是18S帶的兩倍,盡管大致相等的亮度也可以表明RNA在大多數(shù)應(yīng)用中具有足夠高的質(zhì)量。
▲圖3:RNA完整性電泳圖,RNA降解導(dǎo)致拖帶現(xiàn)象
逆轉(zhuǎn)錄引物:
cDNA合成通常涉及使用三種引物中的一種:Oligo(dT)引物、隨機(jī)引物(Randomprimer)或基因特異性引物。隨機(jī)引物是一種隨機(jī)序列的短寡核苷酸,對于長(4kb)或缺乏poly(A)尾巴的轉(zhuǎn)錄本,如原核mRNA的情況,它們可以在轉(zhuǎn)錄本的多個點(diǎn)上啟動逆轉(zhuǎn)錄,因此,它們對于長mRNA和具有重要二級結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄本很有用。通常使用隨機(jī)六聚體引物,使用隨機(jī)八或九聚體引物可以促進(jìn)更長的cDNA合成,因?yàn)樗鼈冸s交的頻率較低?;蛱禺愋砸锿ǔS糜谝徊剑ㄅ悸?lián))RT-PCR。這些方法通過將所有逆轉(zhuǎn)錄酶活性引導(dǎo)到特定的信息,而不是轉(zhuǎn)錄整個RNA來提高敏感性。對于目標(biāo)擴(kuò)增子長度約為100bp或以下的RT-qPCR應(yīng)用,使用更高濃度的隨機(jī)引物可能是有利的。設(shè)計(jì)跨越內(nèi)含子或內(nèi)含子-外顯子邊界的引物可以確保cDNA是由剪接的mRNA序列合成的,而不是gDNA中的親本基因序列合成。經(jīng)過生物素修飾或在5端添加序列標(biāo)簽等修飾的引物可用于純化和/或分析由特定義或反義模板鏈合成的cDNA。
RNA的二級結(jié)構(gòu):
RNA分子具有影響逆轉(zhuǎn)錄的二級結(jié)構(gòu),而高GC含量會降低逆轉(zhuǎn)錄效率。在逆轉(zhuǎn)錄或cDNA合成前高溫變性處理,可能有利于困難模板的逆轉(zhuǎn)錄。RNA可以通過在65C下變性5分鐘來打開其二級結(jié)構(gòu)。
cDNA的qPCR定量:
強(qiáng)烈建議在cDNA合成后進(jìn)行RT酶的熱失活處理。RT酶失活后,要么直接通過qPCR對cDNA進(jìn)行目標(biāo)特異性的定量分析,要么將滅活的反應(yīng)液冷凍保存,直到需要時才使用。qPCR反應(yīng)混合物通常可容納cDNA樣本體積的增加,最高可占總反應(yīng)體積的20%。cDNA可以作為未稀釋的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物直接添加到qPCR中,也可以稀釋后進(jìn)行qPCR反應(yīng)。cDNA的定量是RT-qPCR工作流程成功的關(guān)鍵。一般來說,作為模板的cDNA的量不應(yīng)超過投入100ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄后所得的量。由高度豐富的轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生的cDNA可以在不到1pg的總RNA中檢測到。
4、總結(jié)
逆轉(zhuǎn)錄是RT-qPCR和其他廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵步驟,我們必須
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