鼠尾膠原蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)器皿的表面包被上的應(yīng)用及三維膠原制備方法

———鼠尾膠原蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)器皿的表面包被上的應(yīng)用及三維膠原制備方法

膠原蛋白是結(jié)締組織和內(nèi)臟器官細(xì)胞外基質(zhì)的主要構(gòu)造成分，在皮膚、肌腱、骨骼中分布最為廣泛。從遺傳和結(jié)構(gòu)上膠原蛋白分為許多類型。

膠原蛋白I（Collagen,TypeI）是由2個(gè)1鏈和1個(gè)2鏈組成的異源多聚體（圖1），在37℃，中性pH下自發(fā)形成三螺旋骨架，是一種優(yōu)秀的細(xì)胞培養(yǎng)用基質(zhì)，廣泛用于肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脊神經(jīng)節(jié)、肌肉細(xì)胞、施萬(wàn)細(xì)胞、胚肺細(xì)胞、上皮細(xì)胞和其他大量細(xì)胞系。還能用于研究細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、遷移以及發(fā)育過(guò)程中的組織形態(tài)發(fā)生。

圖1膠原蛋白I分子模型鼠尾膠原蛋白I是根據(jù)Birkedal-Hansen方法，通過(guò)醋酸抽提、氯化鈉沉淀、磷酸氫二鈉沉淀等步驟制備。可用于包被細(xì)胞培養(yǎng)器皿，培養(yǎng)細(xì)胞表面粘附性，特別適合那些在普通培養(yǎng)器皿表面不易貼壁的細(xì)胞，比如成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞等原代細(xì)胞。還可用于三維膠的制備，模擬真實(shí)的生長(zhǎng)環(huán)境，使得細(xì)胞在三維環(huán)境中生長(zhǎng)。

一、細(xì)胞培養(yǎng)器皿的表面包被

組織培養(yǎng)器皿的表面包被推薦濃度為1-5g/cm2，起始濃度可首選5g/cm2。建議根據(jù)具體細(xì)胞類型來(lái)優(yōu)化。

1、6mMHAc稀釋液的制備

本品以溶于6mMHAc（=0.36g/LHAc）的無(wú)菌溶液形式提供，本身不溶于中性pH，建議用6mMHAc溶液做進(jìn)一步稀釋。配制方法：取34.5l冰醋酸（17.4M）加入100ml雙蒸水，充分混勻后即得到6mMHAc溶液，0.22m濾膜過(guò)濾除菌后待用。

2、包被步驟

1）根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)體系以及優(yōu)化后的包被濃度來(lái)計(jì)算所需的膠原蛋白量，并加入相應(yīng)孔內(nèi)，確保膠原蛋白溶液完全覆蓋表面。

a.以包被濃度為5g/cm2，先用6mMHAc稀釋液將膠原蛋白（5mg/ml）稀釋到合適的中間濃度，如50g/ml，然后參考表1不同培養(yǎng)皿內(nèi)膠原蛋白加量表來(lái)加量到各孔內(nèi)；

b.以包被濃度為2g/cm2，先用6mMHAc稀釋液將膠原蛋白（5mg/ml）稀釋到合適的中間濃度，如12g/ml，然后參考表1不同培養(yǎng)皿內(nèi)膠原蛋白加量表來(lái)加量到各孔內(nèi)；表1不同培養(yǎng)皿內(nèi)膠原蛋白加量表

培養(yǎng)器皿

表面積（cm2,每孔或每皿）

當(dāng)包被濃度：2ug/cm2，中間稀釋濃度12ug/ml，加入該稀釋液體積（ul）

當(dāng)包被濃度：5ug/cm2，中間稀釋濃度50ug/ml，加入該稀釋液體積（ul）

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板

0.3

50

30

24孔細(xì)胞培養(yǎng)板

1.9

300

190

12孔細(xì)胞培養(yǎng)板

3.8

600

380

6孔細(xì)胞培養(yǎng)板

9.5

1580

950

35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿

8

1330

800

60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿

21

3500

2100

100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿

55

9170

55002）室溫孵育1h，小心吸掉多余液體，用無(wú)菌PBS清洗3~4次后直接使用?；蛘呒油昴z原蛋白溶液后，在超凈臺(tái)內(nèi)開蓋過(guò)夜晾干。無(wú)菌條件下，包被好的器皿在4-25C至少可保存3個(gè)月。

二、三維膠原的制備

當(dāng)鼠尾膠原蛋白I使用濃度1mg/ml，pH7.0左右皆可形成具有一定強(qiáng)度的三維膠，建議成膠濃度為1-2mg/ml。

由于本品是以溶于6mMHAc的無(wú)菌溶液形式提供，在成膠過(guò)程需先加入0.06倍體積的0.1MNaOH中和。

1、需要溶液準(zhǔn)備（無(wú)菌、預(yù)冷）10細(xì)胞培養(yǎng)液（依據(jù)培養(yǎng)的細(xì)胞種類而定）、0.1MNaOH、無(wú)菌水

2、三維膠原制備（不含細(xì)胞）（以配制1ml，1mg/ml三維膠為例）：

1）取200l膠原蛋白（5mg/ml）加到置于冰浴的離心管內(nèi)，加入690l無(wú)菌水。之后加到12l0.1MNaOH【注：該步驟不能反，如果反過(guò)來(lái)把12l0.1MNaOH加到膠原溶液中，會(huì)由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)】，立即混勻。再加入100l10細(xì)胞培養(yǎng)液，混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中?！咀ⅲ夯靹蚝髉H為7.0左右，如果培養(yǎng)液中沒(méi)有加酚紅，初次使用時(shí)需要用pH試紙測(cè)試】。

2）將培養(yǎng)器皿在室溫（25C左右）放置20min待膠凝固后，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱內(nèi)。

三維膠原制備（含細(xì)胞）（以配制1ml，1mg/ml三維膠為例）：

a.準(zhǔn)備好細(xì)胞懸液，并放置于冰浴中。b，將200l膠原蛋白（5mg/ml）加到12l0.1MNaOH【注：該步驟不能反，如果反過(guò)來(lái)把12l0.1MNaOH加到膠原溶液中，會(huì)由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)】，立即混勻。再加入23l10細(xì)胞培養(yǎng)液，立即混勻【注：混勻后pH為7.0左右，如果培養(yǎng)液中沒(méi)有加酚紅，初次使用時(shí)需要用pH試紙測(cè)試】。再加入760l的細(xì)胞懸浮液，混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中。

b.將培養(yǎng)器皿在室溫（25C左右）放置20min待膠凝固后，加入適當(dāng)體積細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱