一個(gè)新型的藥物遞送系統(tǒng)-紅細(xì)胞膜仿生納米粒

一個(gè)新型的藥物遞送系一一細(xì)胞膜仿生納米粒黃際薇;姜彩云;羅宇燕;郭喆霏;張永明【期刊名稱】《《中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》》【年(卷)，期】2019(058)005【總頁(yè)數(shù)】5頁(yè)(P114-118)【關(guān)鍵詞】納米粒;紅細(xì)胞膜;仿生納米粒;藥物遞送體系【作者】黃際薇;姜彩云;羅宇燕;郭喆霏張永明【作者單位】中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院藥劑科廣東廣州510630【正文語(yǔ)種】中文【中圖分類(lèi)】R945人體內(nèi)存在大量豐富的紅細(xì)胞，紅細(xì)胞作為藥物輸送的載體已經(jīng)被人們廣泛研究［1］。它具備許多優(yōu)勢(shì)使得其成為優(yōu)良的藥物輸送載體，如良好的生物相容性、超長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間、可以延緩藥物的釋放等［2］。但是由于紅細(xì)胞的活動(dòng)范圍僅限于血管內(nèi)部，使得其眾多的優(yōu)良特性在治療中存在一定的局限性［3］。為此，近年來(lái)采用天然紅細(xì)胞膜作為外殼來(lái)包載合成的納米粒內(nèi)核，使其偽裝成內(nèi)源性物質(zhì)，制備得到核殼結(jié)構(gòu)的紅細(xì)胞膜納米載體，能夠減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的攝取和免疫識(shí)別［4-5］。本研究制備紅細(xì)胞膜仿生納米粒(redbloodcellmembranesbiomimeticnanoparticles，RBCM-NP)，具有紅細(xì)胞膜(redbloodcellmembranes，RBCM)作為藥物輸送的優(yōu)點(diǎn)，提高藥物穩(wěn)定性［6］。本研究通過(guò)調(diào)整擠壓次數(shù)、納米粒與紅細(xì)胞膜的比例來(lái)制備不同處方的RBCM-NP，優(yōu)化處方紅細(xì)胞膜能夠完全包裹住納米粒，構(gòu)建一個(gè)新型的藥物遞送系統(tǒng)——RBCM-NP遞藥體系。1材料與儀器1.1試劑與動(dòng)物聚乙二醇-聚（乳酸-乙醇酸）共聚物（PEG2000-PLGA3.8萬(wàn)，濟(jì)南岱罡生物工程有限公司）;50-60dSPF級(jí)SD雄性大鼠（120~140g,廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SCXK（粵）2013-0002）;生物素化PEG-PLGA（Biotin-PEG2000-PLGA3.8萬(wàn)，廈門(mén)研科生物技術(shù)有限公司）；鏈霉親和素（streptavidin,ST）（S9170，北京索萊寶）;其他試劑均為分析純。1.2儀器SL16/40（R）冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；92SM-202A電子天平（瑞士Precisa公司）；Mastersizer2000激光粒度儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）；透射電子顯微鏡（日本JeolJem-1230）。2方法NP體系的構(gòu)建采用反溶劑法制得NP:PEG-PLGA25mg溶于2.5mL丙酮，逐滴加入5mL泊洛沙姆溶液（w=0.25%）中，減壓除去有機(jī)溶劑，超濾管離心收集，磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffer,PB）中再分散，即得空白NP。NP體系的表征2.2.1粒徑和Zeta電位取上述制備所得的NP于室溫下用粒度測(cè)定儀測(cè)定粒徑和Zeta電位。2.2.2透射電鏡表征NP的形態(tài)測(cè)試樣品滴至透射電鏡專(zhuān)用銅網(wǎng)，孵育后濾紙吸去殘留液體，再用2g/L磷鎢酸染色液染色。2.2.3穩(wěn)定性NP分散在4°CPB中，形成5mg/mL的質(zhì)量濃度于0,3,9d測(cè)定NP的粒徑。RBCM-NP體系的構(gòu)建RBCM的制備制備紅細(xì)胞懸液:取大鼠腹主動(dòng)脈血，收集血液，離心，525r/minx20minx4°C;吸棄血漿和白膜層。等滲PB(300mOsm/L)洗3次，等體積300mOsm/LPB重懸制成紅細(xì)胞懸液備用。溶血：取2mL紅細(xì)胞懸液加至28mL低滲PB(20mOsm/L);混勻后離心，10500r/minx40minx4C;棄上清，重復(fù)上述操作3次，得RBCM。RBCM-NP的構(gòu)建采用脂質(zhì)體擠壓法，將RBCM使用脂質(zhì)體擠壓器擠壓過(guò)400nm孔徑的膜，21次。將制備好的RBCM與NP進(jìn)行混合，使用脂質(zhì)體擠壓器擠壓過(guò)200nm孔徑的膜數(shù)次，得到RBCM-NP。RBCM-NP的表征2.4.1粒徑和Zeta電位取上述制備所得的RBCM-NP用粒度測(cè)定儀測(cè)定粒徑和Zeta電位。RBCM覆蓋程度生物素化納米粒(biotinylatednanoparticle,BTNP)，制備方法見(jiàn)2.1。RBCM仿生BTNP(redcellmembranesbiomimeticbiotinylatednanoparticle,RBCM-BTNP)，制備方法見(jiàn)2.3。利用BTNP與ST孵育會(huì)發(fā)生聚集反應(yīng)來(lái)研究紅細(xì)胞膜的覆蓋程度。BTNP和RBCM-BTNP分別與ST孵育30min后，檢測(cè)BTNP和RBCM-BTNP的粒徑。3結(jié)果3.1NP的表征采用反溶劑法制得NP，重復(fù)性良好，粒徑分布均一，為(101.80±2.55)nm,Zeta電位為((-12.87)±(-0.25))mV，多分散指數(shù)為0.045。檢測(cè)NP在0,3,9d的粒徑變化情況，沒(méi)有顯著性差異(見(jiàn)圖1和圖2)。圖1NP粒徑分布圖Fig.1DiameterdistributionofNP圖2NP的粒徑變化(NP分散在PB中，于0,3,9d測(cè)定NP的粒徑，n=3)Fig.2ChangesofsizeofNP(NParedispersedinPB,andthediametersizeismeasuredat0,3and9d,n=3)RBCM-NP的處方優(yōu)化采用脂質(zhì)體擠壓法，制備RBCM-BTNP，在透射電鏡下能夠發(fā)現(xiàn)外周包裹了一層膜結(jié)構(gòu)，而單獨(dú)NP是沒(méi)有的(見(jiàn)圖3)。圖3NP和RBCM-NP的透射電鏡圖(A:NP；B:RBCM-NP)Fig.3TEMofNPandRBCM-NP(A:NP；B:RBCM-NP)為了進(jìn)一步優(yōu)化處方，按照不同配比采用脂質(zhì)體擠壓法制備不同處方的RBCM-NP。取不同體積的血液提取RBCM，最終用0.5mL的等滲PB稀釋備用，采用脂質(zhì)體擠壓法，將0.5mLRBCM溶液使用脂質(zhì)體擠壓器擠壓過(guò)400nm孑L徑的膜，21次。同時(shí)取不同濃度的NP溶液0.1mL,將制備好的的RBCM與NP進(jìn)行混合，再使用脂質(zhì)體擠壓器擠壓過(guò)200nm孔徑的膜數(shù)次，具體配比參照表1進(jìn)行制備。表1不同處方制備紅細(xì)胞膜納米粒Table1RBCM-NPbydifferentprescriptions考察因素血液/mLp(納米粒)/(mg-mL-1)擠出次數(shù)處方11.055處方20.555處方31.0105處方41.0511在電鏡的視野下，處方1和處方2視野相對(duì)比較清晰。處方4視野比較雜亂，散亂的細(xì)胞膜比較多(見(jiàn)圖4)。同時(shí)檢測(cè)了四個(gè)處方的Zeta電位，Zeta電位的絕對(duì)值越高說(shuō)明該處方越穩(wěn)定，相對(duì)于處方1,處方4的Zeta電位的絕對(duì)值較高(P<0.05)，處方2和處方3較低(P<0.01)，見(jiàn)圖5。結(jié)合上述結(jié)果，處方1相對(duì)其他處方較好。處方1制備的RBCM-NP，粒徑分布均一(粒徑：(110.8±2.29)nm,Zeta電位：((-18.87)±(-0.67))mV，多分散指數(shù)：0.048)，為優(yōu)化處方(見(jiàn)圖6)。圖4不同處方的RBCM-NP的透射電鏡圖(A:處方1;B:處方2;C:處方3;叫"uoiieqnDuidN19:IS+dN19-uoiieqnDuiJayedNW-IAD的:is+dN19_IAID9y)ISW!MuojieqnDuijayepueajopqiuoiieinujjo^人qdN19puedN19-IAID9yPsazisaqi8-6id(s=u：io,O>'dN19i&Si-導(dǎo)旦鼬dNW也導(dǎo)旦鼬dNW-IAD的莘V暗好IS+dN197IS+dN_LflAD的)W廂風(fēng)導(dǎo)騏旦鼬IS與暗好dN19也dN19-ND9^草物草評(píng)乃W8ffl°6ffl、8國(guó)也(TOP>d)首至刑是dN19導(dǎo)騏旦鼬'首鬢刑是晉身吾四赧風(fēng)dN19-ND9^醐if郵暗好'與uiiu0E旦鼬IS與暗好dNW-IAD的風(fēng)男閽T嘗曜瞪胡dNW捋地風(fēng)獐日dN-IAD的￡￡(￡=uWo>d￥￥走'dN01pajeduuoDajesaDuaja^ipiubd^iuBisaqi)Iuoiieinujjo^AqdN-IAD8￡P(guān)|eiiuaiodeiazZ'6!d(E=u'io'O>d￥￥'dNztAXBt)①SCAZ風(fēng)dN也dN-IAD的草評(píng))草評(píng)乃W匕國(guó)Iuoiieinujjo^XqdN-IAD的PuoiwquisipjaiatueiQg'Bjd國(guó)曳好型悝T草物dN-IAD的9IS(E=UWO>d￥￥pue，s(yo>d￥1uoiiduDsajd。］pajeduuoDajes如u”叫!piubd^iuBisaqi)suoiieinujjo^luaja^ipXqdN-IAIDS^p|eiiuaiodcazS'6ij(g=u-I0'0>d￥￥7SO'O>d￥7I草評(píng)ztAXBt)①SCAZ風(fēng)dN-IAD的草評(píng)回業(yè)SIS°LBlttj'(lO'O>d)dN±WB&05}ftCRZ風(fēng)dN-IAD的’dN也dN-IAD的工男閽草評(píng)乃W貌咨(IAD的luasajdajsmojjbp|oqaqi:dN'IAIDa^luasajdajsmojjbuiqiaqi:切uoiieinujjo^:q：￡uoiieinujjo^：32uoiieinujjo^:g.uoiieinujjo^:v)suoiie|nujJO4luaja^ipXqdN-IAD的PIAIS1y6!d(IAID9y莘V玉蜴困-dN-IAD的莘V玉蜴甌-切草評(píng):QsignificantdifferencesarecomparedtoBTNP,at**P<0.01;n=3）圖9RBCM-BTNP（優(yōu)化處方：處方1）和BTNP分別與ST孵育前后的粒徑分布圖（1:BTNP孵育前;2:RBCM-BTNP孵育前;3:RBCM-BTNP與ST孵育后;4:BTNP與ST孵育后）Fig.9DiameterdistributionofRBCM-BTNPandBTNPbyformulation1beforeandafterincubationwithST（1:RBCM-BTNPbeforeincubation;2:RBCM-BTNPbeforeincubation;3:RBCM-BTNPafterincubationwithST;4:BTNPafterincubationwithST）4討論本研究構(gòu)建一個(gè)新型的藥物遞送系統(tǒng)——RBCM-NP遞藥體系。本研究采用反溶劑法制得PEG-PLGA的NP粒徑分布均一，穩(wěn)定性好。近年來(lái)以PLGA等相關(guān)材料作為載體制得的NP在具有良好生物相容性的同時(shí)，更能實(shí)現(xiàn)藥物的可控釋放，延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間，減少給藥次數(shù)，降低藥物的毒副作用，改善患者的依從性和治療效果。然而，NP的表面電荷粒徑、形狀都可影響其被單核-巨噬細(xì)胞攝取［7-8］,導(dǎo)致全身給藥時(shí)到達(dá)作用組織的藥量減少。近年來(lái)，細(xì)胞膜仿生納米粒在生物與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了極大的關(guān)注。采用天然細(xì)胞膜作為外殼來(lái)包載合成的納米粒內(nèi)核，使其偽裝成內(nèi)源性物質(zhì)，不僅減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的攝?。?］，而且能減少免疫識(shí)別［9］。細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能，尤其是細(xì)胞膜表面的特異性功能蛋白得以保留，得到的細(xì)胞膜納米粒具有合成納米材料的高度可調(diào)的物理化學(xué)性質(zhì)，及宿主細(xì)胞膜的高度復(fù)雜的功能，制備工藝也相對(duì)簡(jiǎn)單。此外，雙層膜結(jié)構(gòu)的包載為跨膜蛋白的錨定提供了絕佳的場(chǎng)所，使制備功能強(qiáng)大的仿生納米粒成為可能［10］。本研究采用脂質(zhì)體擠壓法將RBCM使用脂質(zhì)體擠壓器擠壓過(guò)400nm孔徑的膜，21次將制備好的RBCM與NP進(jìn)行混合，再使用脂質(zhì)體擠壓器擠壓過(guò)200nm孑L徑的膜數(shù)次，成功制備了RBCM-NP，在透射電鏡下，可以發(fā)現(xiàn)與NP相比，RBCM-NP外周包裹一層膜結(jié)構(gòu)。為了進(jìn)一步優(yōu)化RBCM-NP，我們改變了RBCM與NP的配比和最后擠出次數(shù)，通過(guò)透射電鏡拍攝4個(gè)不同的處方。處方4由于擠出次數(shù)變多，使細(xì)胞膜受到多次沖擊，導(dǎo)致細(xì)胞膜的破碎，因此處方4視野比較雜亂。處方1為優(yōu)化處方制備的RBCM-NP粒徑分布均一，同時(shí)包載了RBCM的NP要比沒(méi)有膜結(jié)構(gòu)的NP更穩(wěn)定。處方3由于納米粒濃度增加，部分納米粒沒(méi)有完全被細(xì)胞膜包裹，因此處方3的Zeta電位較低，穩(wěn)定性較差。本研究構(gòu)建一個(gè)新型的藥物遞送系統(tǒng)——RBCM-NP遞藥體系，NP和RBCM-NP粒徑均一，優(yōu)化處方RBCM能夠完全包裹住NP，重現(xiàn)性良好，為后期仿生納米粒的研究提供了理論基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)：【相關(guān)文獻(xiàn)】MUZYKANTOVVR.Drugdeliverybyredbloodcells:vascularcarriersdesignedbymothernature[J].ExpertOpinionDrugDelivery,2010,7(4):403-427.CHAMBERSE,MITRAGOTRIS.Prolongedcirculationoflargepolymericnanoparticlesbynon-covalentadsorptiononerythrocytes[J].JournalofControlledRelease,2004,100(1):111-119.YOOJW,IRVINEDJ,DISCHERDE,etal.Bio-inspired,bioengineeredandbiomimeticdrugdeliverycarriers[J].NatureReviewsDrugDiscovery,2011,10(7):521-535.ARYALS,HUCMJ,FANGRH,etal.Erythrocytemembrane-cloakedpolymericnanoparticlesforcontrolleddrugloadingandrelease[J].Nanomedicine-Uk,2013,8(8):1271-1280.RAOL,XUJH,CAIB,etal.Syntheticnanoparticlescamouflagedwithbiomimeticerythrocytemembranesforreducedreticuloendothelialsystemuptake[J].Nanotechnology,2016,27(8):085106.HUCMJ,ZHANGL,ARYALS,etal.Erythrocytemembrane-camouflagedpolymericnanoparticlesasabiomimeticdeliveryplatform[J].ProceedingsoftheNationa