生物分離技術綜合實驗

生物分離技術綜合實驗第1頁/共29頁實驗一、植物色素的制備五、操作1、不同浸提劑濃度對黃酮提取率的影響1.1取干粉原料15克，分成6組（2.5克每組），用8倍體積（指料液比v/m為8：1）即20ml的40%、70%，95%的乙醇浸提（溫度70℃，時間1.5h），浸提時每隔15min用手輕搖2min。浸提所得粗液進行離心（4500r/min20min），得浸提上清液。1.2

精密吸取上清液1.0mL，分別置于10mL容量瓶中，加質(zhì)量分數(shù)5％亞硝酸鈉0.4mL，放置6min后，加質(zhì)量分數(shù)10％硝酸鋁0.4mL，放置6min，再加質(zhì)量分數(shù)4.3％氫氧化鈉4mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15min，在510nm波長下測得其吸光度值，得出最優(yōu)的浸提劑濃度。（按三個水平，每個水平做兩組操作，即每個單因素條件得六個數(shù)據(jù)。）第2頁/共29頁實驗一、植物色素的制備2、不同浸提時間對黃酮提取率的影響2.1

取干粉原料15克，分成6組（2.5克每組），用按8：1（指料液比v/m）的70%乙醇浸提（溫度70℃），浸提時間分別為90min、120min，150min，浸提時每隔15分鐘用手輕搖2min。浸提所得粗液進行離心（4500r/min20min），得浸提上清液。2.2

精密吸取上清液1.0mL，分別置于10mL容量瓶中，加質(zhì)量分數(shù)5％亞硝酸鈉0.4mL，放置6min后，加質(zhì)量分數(shù)10％硝酸鋁0.4mL，放置6min，再加質(zhì)量分數(shù)4.3％氫氧化鈉4mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15min，在510nm波長下測得其吸光度值，得出最優(yōu)的浸提時間。（按三個水平，每個水平做兩組操作每個水平做兩組操作，即每個單因素條件做六個數(shù)據(jù)。）第3頁/共29頁實驗一、植物色素的制備3、不同料液比對黃酮提取率的影響3.1

取干粉原料15克，分成6組（2.5克每組），用按6：1，8：1，10：1（指料液比v/m，即ml/克）的70%乙醇浸提（溫度70℃，時間1.5h），浸提時每隔15分鐘用手輕搖2min。浸提所得粗液進行離心（4500r/min20min），得浸提上清液。3.2

精密吸取上清液1.0mL，分別置于10mL容量瓶中，加質(zhì)量分數(shù)5％亞硝酸鈉0.4mL，放置6min后，加質(zhì)量分數(shù)10％硝酸鋁0.4mL，放置6min，再加質(zhì)量分數(shù)4.3％氫氧化鈉4mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15min，在510nm波長下測得其吸光度值，按V*A值的大小比較得出最優(yōu)的料液比。選做部分：若出現(xiàn)從6：1→8：1→10：1的（V*A）持續(xù)平穩(wěn)增加，則可以繼續(xù)加大料液比（可以為12：1，14：1,……）,直到找到拐點位置的最佳料液比。

第4頁/共29頁實驗一、植物色素的制備六、實驗注意事項1、將本實驗中所有的乙醇提取的浸提液集中起來（一定要記下這些浸提液所對應的原料質(zhì)量M），量取其總體積V，將提取液分出50ml，將這50ml和其余色素液分置于兩個燒杯中，然后將兩個燒杯在4℃左右的低溫下并用保鮮膜封閉保存（按現(xiàn)在的溫度，放在臺子上避光保存即可），以供后面純化實驗使用。2、在色素提取過程中，每隔一段時間要進行輕搖，搖晃時幅度要小，以免使提取原料粘在壁上，造成原料損失。3、在做不同料液比對色素提取影響實驗時，比較結果優(yōu)劣要用V*A,即：體積*吸光度值。第5頁/共29頁實驗一、植物色素的制備六、實驗注意事項4、離心前一定要認真平衡好，兩管質(zhì)量平衡誤差應在0.1克以內(nèi)。同時，在離心過程中，一定要有專人看護以免發(fā)生事故。5、實驗當中的提取液一定要全部從磨口錐形瓶和離心管中倒出，在將離心好的色素倒出時，一定要小心，不要將底部的沉降物倒出來。6、色素提取過程中一定要在錐形瓶上加上塞子，若乙醇蒸發(fā)較快時（如：80%以上的高濃度乙醇提取時），可以考慮在磨口錐形瓶上加一蛇形管，但低濃度乙醇提取時沒有必要加蛇形管。第6頁/共29頁實驗一、植物色素的制備7、上樣液的制備（該步驟亦可以在實驗二中完成）將實驗一中所得的所有浸提液用燒杯放在100℃水浴中濃縮到20ml，將所得濃縮液置于50ml（或更大的）分液漏斗中，按等量體積加入石油醚后塞上塞子并充分搖勻，棄石油醚層，得下層黃酮液，放在90℃水浴中濃縮，濃縮至10ml（具體操作時，可先用大燒杯進行濃縮，待溶液約50ml左右時，改用50ml小燒杯進行濃縮，這樣便于進行定量），備用。第7頁/共29頁實驗一、植物色素的制備8、測量吸光度時，一定要設空白對照（即把除1ml樣液以外的其余9ml亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、蒸餾水+1ml乙醇）9、由于各提取液濃度較大，在測量吸光度前，一定要將待測液取出1mL，稀釋到10mL后，再按前面A值測定方法進行測定。第8頁/共29頁實驗一、植物色素的制備—附錄1、實驗前面準備（同學們不需要做）：（1）、原料的制備用高速干粉粉碎機將銀杏葉粉碎，過40目以上，40-60目，60-70目，70-80目，80-90目，90-100目，100目以上，篩后備用。（2）、標準曲線的繪制：精密稱取蘆丁對照品200mg，用體積分數(shù)(下同)70％乙醇溶解，定容至100mL容量瓶中搖勻。精密移取10mL蘆丁乙醇液于25mL容量瓶中，用蒸餾水定容，得到0.8mg／mL標準溶液。精密吸取標準溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于10mL容量瓶中，加質(zhì)量分數(shù)5％亞硝酸鈉0.4mL，放置6min后，加質(zhì)量分數(shù)10％硝酸鋁0.4mL，放置6min，再加質(zhì)量分數(shù)4.3％氫氧化鈉4mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15min，進行測量，在510nm處有最大吸收波長。以測定結果得蘆丁濃度與吸光度的標準曲線：Y=0.1035Ad-0.0016(Y：蘆丁濃度，mg／ml；A：吸光值)，R=0.9999。第9頁/共29頁實驗二、植物色素的分離純化一、目的學習掌握柱層析法分離純化目的物質(zhì)（植物色素）的方法和操作。二、原理柱層析是比較理想的分離黃酮類色素的方法,其原理是通過基質(zhì)分子與黃酮類化合物分子上的酚羥基形成氫鍵締合物而產(chǎn)生作用,其作用力強弱取決于黃酮類化合物分子上羥基的數(shù)目與位置以及洗脫劑與黃酮類化合物和基質(zhì)之間形成氫鍵締合能力的大小。常用不同比例的水和醇混合溶劑作為洗脫劑，能成功分離各種類型的黃酮。第10頁/共29頁實驗二、植物色素的分離純化三、器材與試劑1、實驗儀器層析柱、試管、燒杯、量筒、烘箱。2、實驗試劑石油醚、40%乙醇200ml/組、70%乙醇300ml/組、95%乙醇200ml/組、基質(zhì)。3、實驗材料銀杏葉提取液第11頁/共29頁實驗二、植物色素的分離純化四、操作1、上樣液的制備（該步驟亦可以在實驗一中完成）將實驗一中所得的所有浸提液用燒杯放在100℃水浴中濃縮到20ml，將所得濃縮液置于50ml（或更大的）分液漏斗中，按等量體積加入石油醚后塞上塞子并充分搖勻，棄石油醚層，得下層黃酮液，放在90℃水浴中濃縮，濃縮至10ml（具體操作時，可先用大燒杯進行濃縮，待溶液約50ml左右時，改用50ml小燒杯進行濃縮，這樣便于進行定量），備用。2、基質(zhì)的的預處理：稱取所需的大孔吸附樹脂(濕重)，以95％乙醇浸泡24h，充分溶脹后用乙醇濕法裝柱，第12頁/共29頁實驗二、植物色素的分離純化3裝柱：將酒精浸泡好的基質(zhì)約40ml（指混勻狀態(tài)下取樣），通過漏斗緩慢倒入柱中（柱中已經(jīng)裝好10ml95%乙醇），邊加邊用木夾子輕敲柱子，同時用竹簽輕輕壓實。流速應控制在20滴/min，待裝至20cm柱高，再加與柱壁完全吻合的濾紙片，接著加入1.0cm高海沙（或石英砂）。（注意，在整個裝柱過程中，樹脂應浸泡在溶液中，否則會出現(xiàn)斷痕，氣泡等。若柱子無砂芯，要在裝柱前加一小團（大拇指指甲大小的）棉花封住柱子，以防基質(zhì)漏出。）4、平衡：用95%乙醇洗柱，不時檢查流出的乙醇液，待流出的乙醇液與去離子水以1：3的體積比混合，振搖不顯白色渾濁時結束洗柱（已洗好，不必做），用純化水將柱中樹脂洗至無醇味后備用。（注意，所有醇洗液需回收到大的燒杯里，水洗液不必回收）5、上樣與吸附：取濃縮液10ml上柱，吸附20min（流速20滴/min），等樣品液完全流入基質(zhì)中后，用3倍柱體積（約150ml）去離子水洗脫。第13頁/共29頁實驗二、植物色素的分離純化6、洗脫（解吸附）：6.1

依次用40%200ml（流速約30滴/min）、70%300ml（流速約20滴/min）、95%200ml（流速約40滴/min）乙醇分別進行洗脫，將試管放在試管架上按序接收洗脫液，每管收集8ml左右洗脫液6.2

從第一管起，每接收3管，則精密吸取第1、4、7、10…等管中的洗脫液1.0mL，置于10mL容量瓶中，加質(zhì)量分數(shù)5％亞硝酸鈉0.4mL，放置6min后，加質(zhì)量分數(shù)10％硝酸鋁0.4mL，放置6min，再加質(zhì)量分數(shù)4.3％氫氧化鈉4mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15min，在510nm波長下測得其吸光度值；第14頁/共29頁實驗二、植物色素的分離純化6、洗脫（解吸附）：6.3

確定黃酮所在的主要流分后，將吸光度值在0.1以上（含0.1）的所有管中的洗脫液集中起來，測出其總體積V純化（接著，可直接測定純化液的A值），預留50ml純化液，用保鮮膜封閉后放在4℃中低溫保存，并將其余的純化液置于90℃水浴中濃縮至10ml，用保鮮膜封閉后放在4℃中低溫避光保存，備用。第15頁/共29頁實驗二、植物色素的分離純化五、實驗注意事項1、裝柱前在柱子底部加一小棉花球。2、裝柱時，邊加樹脂邊用木質(zhì)棒（或橡膠棒）輕敲柱子，使基質(zhì)緩緩下沉。3、裝柱要求連續(xù)、均勻、無紋格、無氣泡，表面平整，整個層析過程中液面一定不得低于樹脂表面。4、要注意及時開啟和關閉旋紐，即在上一種液體剛好沒入基質(zhì)時，才開始加入下一種液體，且一定要用玻棒引流。第16頁/共29頁實驗二、植物色素的分離純化五、實驗注意事項5、要注意控制流速，不宜過快。6、在加入好樣品后（在洗壁前）就要接收洗脫液。7、柱子預處理時的流出液用三角瓶或燒杯接收，而上樣后的色素洗脫液則用試管接收。8、所預留的純化液50ml和10ml，必須是在所有洗脫下來的A值大于0.1的純化液混勻后才能取液。第17頁/共29頁實驗三、植物色素的定量與初步鑒定一、目的

用化學方法鑒定上面所純化的提取液中有黃酮存在，同時測定黃酮的含量和最后的得率。二、原理黃酮化合物分子結構中具有C5、C6位的酚羥基或鄰二酚羥基可與金屬鹽試劑鋁鹽生成有色絡合物，黃酮絡合物在510nm處有較大的吸收峰，可由分光光度法測出黃酮含量。根據(jù)黃酮的一些特性，利用黃酮與一些試劑發(fā)生特殊的發(fā)色反應來檢測黃酮。第18頁/共29頁實驗三、植物色素的定量與初步鑒定三、實驗器材1、實驗儀器：分光光度計，烘箱，電子天平，10ml容量瓶1支/組，100m容量瓶1支/組，移液管若干。2、實驗試劑：

80%的氫氧化鈉（質(zhì)量分數(shù)）溶液，10%的FeCl3，10%的FeCl2溶液，2%NaBH4溶液，甲醇。3、實驗材料：實驗二中所得的洗脫液的濃縮液（總體積為10ml）。

第19頁/共29頁實驗三、植物色素的定量與初步鑒定四、實驗步驟（一）物質(zhì)初步鑒定操作（樣液是實驗二中純化液濃縮而來的10ml）：1、在所純化的提取液2ml中加入10%的氫氧化鈉（質(zhì)量分數(shù)）溶液2ml，若色素液馬上由黃色變?yōu)樯铧S色；則認定黃酮化合物的存在。2、在所純化的提取液兩份，各為2ml，分別加入10%的FeCl3，F(xiàn)eCl2；若發(fā)現(xiàn)兩種離子都使色素溶液變?yōu)樗{綠色，則可認定黃酮化合物的存在。3、硼酸氫鈉反應：取黃酮純化液2ml，再加等量的2%NaBH4的甲醇溶液1min后加濃鹽酸（買來即用，不需調(diào)配）數(shù)滴，若有紫色或紫紅色出現(xiàn)，則說明此黃酮純化液中有二氫黃酮存在。第20頁/共29頁實驗三、植物色素的定量與初步鑒定（二）目的物質(zhì)得率的確定：1、標準曲線及方程和最佳吸收波長用實驗一的結果。2、從實驗二所得的預留在冰箱中的10ml純化液中精密吸取1ml，（注意，若儲存液有沉降現(xiàn)象，則可進行40℃加熱，待其澄清后再進行光度測定，但若是連續(xù)實驗，就不必在冰箱中保存而是在實驗二中直接測定其A值），放置于10mL容量瓶中，冰箱中取出放置一定時間，使之達到室溫后，按前面方法，在510nm波長下測得其吸光度值A。此步驟亦可在實驗二中直接測定。第21頁/共29頁實驗三、植物色素的定量與初步鑒定（二）目的物質(zhì)得率的確定：將A樣品代入標準曲線方程Y=KA+b(Y：黃酮濃度，g／L；A：吸光值，用各組自己測得的方程)，可以得到待測樣品的黃酮濃度，C純化（單位為mg/ml）。C純化=Y*10*n（由于測定濃度過程中，待測液由1ml定容到10ml，n為實驗過程中待測液的稀釋倍數(shù)）黃酮得率%=測得的黃酮含量（mg）/原料總質(zhì)量×100%=（C純化×V純化）mg÷（M×1000）mg×100%M代表V所對應的原料的總質(zhì)量。將書本公式中的“V提取液/200”去掉，因為實驗二中10ml濃縮液對應的是所有提取液。第22頁/共29頁實驗三、植物色素的定量與初步鑒定（三）目的物質(zhì)的純度測定：取實驗一中所得的提取液50ml，放置在已經(jīng)烘干，并已經(jīng)稱好質(zhì)量為m1的小燒杯中，放在真空干燥箱中干燥，干燥到恒重后，稱其重量m2，得色素浸膏重量為（m2－m1），再根據(jù)上面第（二）中的公式算出總黃酮含量m總，則其純度為：目的物質(zhì)的純化前純度=C純化×50×100%m2－m1第23頁/共29頁實驗三、植物色素的定量與初步鑒定（三）目的物質(zhì)的純度測定：取實驗二中所得的純化液50ml，放置在已經(jīng)烘干，并已經(jīng)稱好質(zhì)量為m3的小燒杯中，放在真空干燥箱中干燥，干燥到恒重后，稱其重量m4，得色素浸膏重量為（m4－m3），再根據(jù)上面第（二）中的公式算出總黃酮含量m總，則其純度為：目的物質(zhì)的純化后純度=C純化×50×100%