生物化學實驗-紙層析法分析氨基酸

生物化學實驗——紙層析法分析氨基酸第1頁/共13頁

紙上層析法是分配層析法中的一種，常以濾紙為惰性支持物。紙上層析法是分離、鑒定和定量測定氨基酸、糖類、抗生素等有機物質(zhì)的一項重要而簡便的分析方法。所用設備簡單、操作方便，使用樣品少，分離效果好，為近代生物化學分析中重要技術之一。此法廣泛地應用于科研和生產(chǎn)分析工作中。

二、實驗原理第2頁/共13頁

常以水和有機溶劑作為展層劑；水和有機溶劑互溶后形成兩個相：一個是飽和了有機溶劑后的水相,一個是飽和了水后的有機溶劑相。由于濾紙纖維素上的羥基和水分子有較大的親和力,其吸附的水相為固定相,有機溶劑相為移動相。由于物質(zhì)的極性大小不同,在兩相中分配比例有所差異。極性小的物質(zhì)在有機相中分配較多,隨有機相移動較快；而極性大的物質(zhì)在水相中分配較多,移動相對較慢,從而將極性不同的物質(zhì)分開紙上層析的原理第3頁/共13頁

在相同的條件下，每種物質(zhì)都有其固定的Rf值。

Rf值的定義為：原點到層析斑點中心的距離

Rf=

原點到溶劑前沿的距離第4頁/共13頁影響Rf值的因素有：

①物質(zhì)本身的化學結構；②展層所用溶劑系統(tǒng)；③展層劑pH值；④展層時的溫度；⑤展層所用濾紙；⑥展層的方向(橫向，上行或下行)。用紙層析鑒定樣品時，一般都與標準品相比較。若沒有標準品，可選擇文獻記載的該物質(zhì)層析條件，根據(jù)文獻Rf值進行鑒定。第5頁/共13頁

三、實驗操作

1、紙的處理取18cm長、18cm寬的濾紙一張，離底邊2cm處用鉛筆輕輕劃一條與底邊平行的線，并等距離的在線上定點樣點(原點)劃圈，使圈的直徑小于0.4cm。

2、點樣用毛細管點樣，中間點混合氨基酸，兩側點三種標準氨基酸；每個點樣點重復點2-3次，每點一次用電吹風吹干后再點下次（此時，用冷風吹干，防止氨基酸變性降解），點樣點的直徑應控制在2-4mm左右，點樣完畢用大頭針線將濾紙做成筒形，點樣面向里。

第6頁/共13頁圖1.點樣2cm第7頁/共13頁展層劑展層劑圖2.濾紙的縫合第8頁/共13頁3、平衡點樣以后將濾紙與層析缸用配好的溶劑系統(tǒng)蒸汽來飽和，這個過程稱為平衡(30min),否則，濾紙會從溶劑中吸收水分，溶劑也會從濾紙表面揮發(fā)，使溶劑系統(tǒng)的組分發(fā)生改變，嚴重時紙上會出現(xiàn)不同水平的溶劑前沿，影響層析效果。4、展層向?qū)游龈字屑尤雽游鋈軇ǜ呒s1.5cm），液層不要超過點樣線，將濾紙點樣點朝下放入層析溶劑中，將層析缸密閉，待溶劑到達濾紙上邊線1-2cm時取出冷風吹干。

第9頁/共13頁5、顯色用噴霧器向濾紙上均勻噴灑0.1%茚三酮，熱風吹干(加快反應)反應顯色(或晾干后，將濾紙放入烘箱中80-100℃，烘烤5分鐘后)，濾紙上即顯出紫紅色或黃色的氨基酸斑點。四、結果處理

1、用鉛筆將層析色譜輪廓和中心點描出來。

2、測量原點至色譜中心和至溶劑前沿的距離，計算各種已知氨基酸和未知氨基酸色譜的Rf值。

3、分析混合樣品中未知氨基酸的組分。第10頁/共13頁圖3.層析譜

1．原點；2．層析點；3．溶劑前沿第11頁/共13頁五、注意事項

(1)在整個操作過程中，手只能接觸濾紙邊緣，否則手指上的氨基酸會造成濾紙上眾多斑點。

(2)在點樣時，不要將毛細管插錯了試劑瓶。

(3)點樣斑點不能太大（其直徑應小于0.5cm），防止氨基酸斑點重疊。(4)展層劑接觸濾紙時一定要均勻、保持前沿線