生物化學(xué)蛋白質(zhì)之三

生物化學(xué)蛋白質(zhì)之三第1頁/共55頁目的與要求1.充分理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系:包括一級結(jié)構(gòu)與空間構(gòu)象的關(guān)系；蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能的關(guān)系。2.掌握蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)：膠體性質(zhì)、兩性電離與等電點、沉淀作用、變性作用以及這些性質(zhì)的生理意義及實踐意義。3.了解蛋白質(zhì)分離提純的常用方法及基本原理。第2頁/共55頁（一）、一級結(jié)構(gòu)的變異與分子病分子?。╩oleculardisease）：由于基因結(jié)構(gòu)改變，蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵氨基酸發(fā)生改變，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能障礙的疾病?！窘?jīng)典舉例】鐮形細(xì)胞貧血癥：編碼珠蛋白β鏈的結(jié)構(gòu)基因第六個密碼子由CTT→CAT，相應(yīng)的多肽序列中N端的第六個氨基酸由Glu→Vla；其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)改變，喪失運輸氧的生物活性。一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系§2.4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系第3頁/共55頁第4頁/共55頁（二）、一級結(jié)構(gòu)與種屬差異

對比不同機體的同種功能蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其種屬差異明顯;親緣關(guān)系越近,其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)越相似。第5頁/共55頁

與功能相關(guān)的氨基酸是高度保守的，這說明不同種屬的生物在進(jìn)化上來自相同的祖先。不同種屬間的同源蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)上的氨基酸殘基數(shù)差別越大，其親緣關(guān)系愈遠(yuǎn)，反之，其親緣關(guān)系愈近。第6頁/共55頁（三）、一級結(jié)構(gòu)的局部斷裂與蛋白質(zhì)激活：胰島素原一級結(jié)構(gòu)與激活過程第7頁/共55頁二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系(一)核糖核酸酶的變性與復(fù)性牛核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu)第8頁/共55頁

天然狀態(tài)，有催化活性尿素、β-巰基乙醇

去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性注意:蛋白質(zhì)的功能取決于特定的天然構(gòu)象，而規(guī)定其構(gòu)象的信息包含在它的氨基酸序列中。第9頁/共55頁（二）血紅蛋白的別構(gòu)效應(yīng)第10頁/共55頁第11頁/共55頁血紅蛋白的亞基鐵卟啉第12頁/共55頁第13頁/共55頁別構(gòu)效應(yīng)(allostericeffect)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變伴隨其功能的變化，稱為別構(gòu)效應(yīng)。第14頁/共55頁*協(xié)同效應(yīng)(cooperativity)一個寡聚體蛋白質(zhì)的一個亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結(jié)合能力的現(xiàn)象，稱為協(xié)同效應(yīng)。如果是促進(jìn)作用則稱為正協(xié)同效應(yīng)

(positivecooperativity)如果是抑制作用則稱為負(fù)協(xié)同效應(yīng)

(negativecooperativity)第15頁/共55頁（三）蛋白質(zhì)構(gòu)象改變與疾病蛋白質(zhì)構(gòu)象?。喝舻鞍踪|(zhì)的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴(yán)重時可導(dǎo)致疾病發(fā)生。第16頁/共55頁蛋白質(zhì)構(gòu)象病的機理：有些蛋白質(zhì)錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨廷頓舞蹈病、瘋牛病等。第17頁/共55頁亨廷頓舞蹈病瘋牛病老年癡呆癥第18頁/共55頁瘋牛病瘋牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一種人和動物神經(jīng)退行性病變。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變成全為β-折疊的PrPsc，從而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折疊正常瘋牛病第19頁/共55頁一級結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu)

功能決定直接體現(xiàn)注意：蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能是高度統(tǒng)一的。

小結(jié)基礎(chǔ)第20頁/共55頁一、蛋白質(zhì)的兩性電離蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)?！?.5蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、純化技術(shù)第21頁/共55頁蛋白質(zhì)的等電點(isoelectricpoint,pI)

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點。利用蛋白質(zhì)兩性電離的性質(zhì)，可通過電泳、離子交換層析、等電聚焦等技術(shù)分離蛋白質(zhì)。第22頁/共55頁蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達(dá)1-100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。*蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷水化膜二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與沉淀第23頁/共55頁－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用酸堿+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)溶液中蛋白質(zhì)的聚沉第24頁/共55頁

蛋白質(zhì)沉淀方法：鹽析：

條件:高濃度的強電解質(zhì)鹽(如硫酸胺、氯化鈉、硫酸鈉等)--鹽析;

低濃度的鹽溶液--鹽溶。

機理：破壞水化膜，中和表面的凈電荷。

注意:鹽析法不會使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。第25頁/共55頁2.有機溶劑沉淀法：

條件:有機溶劑如乙醇、丙酮等。

機理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜。

注意:低溫條件下進(jìn)行，否則溶解熱會使蛋白質(zhì)變性。第26頁/共55頁3.重金屬鹽沉淀

條件：pH稍大于pI為宜;

機理：重金屬鹽加入之后，與帶負(fù)電的羧基結(jié)合。

注意:蛋白質(zhì)變性，長期從事重金屬作業(yè)的人應(yīng)多吃高蛋白食品，以防止重金屬離子被機體吸收后造成對機體的損害。第27頁/共55頁4.生物堿試劑沉淀法

條件：pH稍小于pI;生物堿試劑一般為弱酸性物質(zhì)，如單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等。

機理：在酸性條件下，蛋白質(zhì)帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結(jié)合而產(chǎn)生沉淀。

“柿石癥”的產(chǎn)生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的單寧酸，使腸胃中的蛋白質(zhì)凝固變性而成為不能被消化的“柿石”。第28頁/共55頁5.弱酸或弱堿沉淀法：條件：pH=pI

機理：破壞蛋白質(zhì)表面凈電荷。第29頁/共55頁三、蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝固*蛋白質(zhì)的變性(denaturation)在某些物理和化學(xué)因素作用下，蛋白質(zhì)分子的特定空間構(gòu)象被破壞，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。第30頁/共55頁

造成變性的因素：

1）物理因素：高溫、高壓、射線等;

2）化學(xué)因素：強酸、強堿、重金屬鹽等。

變性的本質(zhì)：——

破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。第31頁/共55頁

蛋白質(zhì)變性后的性質(zhì)改變：

溶解度降低、粘度增加、結(jié)晶能力消失、生物活性喪失及易受蛋白酶水解。

應(yīng)用舉例臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用來消毒及滅菌。防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。

第32頁/共55頁若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)性。復(fù)性(renaturation)第33頁/共55頁

天然狀態(tài)，有催化活性尿素、β-巰基乙醇

去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性第34頁/共55頁*蛋白質(zhì)變性易沉淀

在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。第35頁/共55頁*蛋白質(zhì)的凝固作用(proteincoagulation)

蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。

第36頁/共55頁由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測定。四、蛋白質(zhì)的紫外吸收第37頁/共55頁五、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)⒈茚三酮反應(yīng)(ninhydrinreaction)

蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)。⒉雙縮脲反應(yīng)(biuretreaction)蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)，雙縮脲反應(yīng)可用來檢測蛋白質(zhì)水解程度。第38頁/共55頁（一）分離純化蛋白質(zhì)的意義

研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能：要求純度高,不變性；

提取活性的酶或蛋白質(zhì)：必須保持天然活性狀態(tài)；

作為藥物或食品添加劑：純度要求一般。

（二）蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟

材料的選擇→原料的預(yù)處理→蛋白質(zhì)的抽提→從抽提液中沉淀蛋白質(zhì)→純化→蛋白質(zhì)的結(jié)晶六、蛋白質(zhì)的分離純化第39頁/共55頁1.原料的選擇：要求含待分離的蛋白質(zhì)豐富，廉價，容易收集，新鮮無腐敗。2.原料的預(yù)處理：胞外蛋白質(zhì)，材料破碎后，用適當(dāng)?shù)娜軇┲苯映樘?；胞?nèi)蛋白質(zhì)，則需要破碎細(xì)胞膜，再用適當(dāng)?shù)娜軇┏樘帷?.從抽提液中沉淀蛋白質(zhì)：常用鹽析法、低溫乙醇沉淀法、等電點沉淀法。第40頁/共55頁4.純化：將沉淀的蛋白質(zhì)溶解，再選擇適當(dāng)?shù)募兓椒ǎ玫郊兌缺容^高的蛋白質(zhì)溶液。

方法：透析或超濾、電泳法、凝膠過濾法、離子交換層析、吸附層析法、超速離心法等。5.蛋白質(zhì)的結(jié)晶：從溶液中重新沉淀蛋白質(zhì)。第41頁/共55頁（三）蛋白質(zhì)的分離和純化方法1.透析及超濾法*透析(dialysis)：利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。*超濾法：應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。第42頁/共55頁*使用丙酮沉淀時，必須在0-4℃低溫下進(jìn)行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離。*鹽析(saltprecipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。2.丙酮沉淀與鹽析第43頁/共55頁3.電泳(elctrophoresis)電泳是帶電的顆粒在電場中定向移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù),稱為電泳技術(shù)。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。

第44頁/共55頁幾種重要的蛋白質(zhì)電泳*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。*等電聚焦電泳：通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。*雙向凝膠電泳：是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。第45頁/共55頁層析(chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理待分離蛋白質(zhì)溶液由（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。（四）層析第46頁/共55頁蛋白質(zhì)分離常用的層析方法*離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。*凝膠過濾(gelfiltration)又稱分子篩層析：利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離。第47頁/共55頁第48頁/共55頁第49頁/共55頁小結(jié)1.蛋白質(zhì)分類：A：按分子形狀分；B：按生物學(xué)功能分；2.蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可分為4個層次：一級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈通過肽鍵共價連接的氨基酸序列。蛋白質(zhì)主鏈的折疊形成由氫鍵維系的重復(fù)性結(jié)構(gòu)稱為二級結(jié)構(gòu)，最常見的二級結(jié)構(gòu)有α螺旋、β折疊片、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲。三級結(jié)構(gòu)是指由二級結(jié)構(gòu)元件構(gòu)成的整個多肽鏈的三維構(gòu)象，包括相距甚遠(yuǎn)的肽段間和側(cè)鏈基團(tuán)間的相互關(guān)系。蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)是指聚集兩條或更多具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈（亞基）空間配置形成的構(gòu)象。第50頁/共55頁3.天然蛋白質(zhì)分子受某些物理因素或化學(xué)因素的影響，物理化學(xué)性質(zhì)改變，生物活性喪失的現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)變性，變性的實質(zhì)是分子中的次級鍵被破壞，引起天然構(gòu)象解體，而蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)保持不變。4.蛋白質(zhì)的生物功能取決于它的構(gòu)象，構(gòu)象是由氨基酸序列決定的。5.導(dǎo)致一個蛋白質(zhì)中氨基酸改變的基因突變能產(chǎn)生所謂分子病。第51頁/共55頁6.蛋白質(zhì)可采用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳、