生物化學　DNA復制　RNA轉(zhuǎn)錄

生物化學DNA復制RNA轉(zhuǎn)錄第1頁/共111頁教學大綱了解:真核細胞與原核細胞DNA復制的不同：DNA損傷的類型及損傷后的修復；原核生物轉(zhuǎn)錄的基本過程；轉(zhuǎn)錄后加工、反轉(zhuǎn)錄和核酶的概念；RNA干擾技術及基因治療相關內(nèi)容(加)掌握：DNA合成的方式------半保留復制；合成特點：半不連續(xù)復制；DNA復制的過程所需要的物質(zhì)(酶，尤其是原核生物-大腸桿菌DNA聚合酶的種類及作用，掌握其他(復制所需要的)酶或蛋白需要名稱及種類，了解其功能)；掌握原核生物轉(zhuǎn)錄的基本過程、概念和特點；重點、難點：DNA合成的方式—半保留復制；DNA復制的過程(前導鏈與滯后鏈的合成異同點及所需要的酶)；掌握轉(zhuǎn)錄與復制的異同點。RNA剪接及加工過程(以前是了解內(nèi)容)第2頁/共111頁單擊畫面繼續(xù)DNA轉(zhuǎn)錄翻譯復制逆轉(zhuǎn)錄RNA復制RNA蛋白質(zhì)為什么子女與父母非常相象？基因就是指DNA中能編碼蛋白質(zhì)和功能RNA的特定核苷酸序列。第3頁/共111頁第一節(jié)DNA的生物合成一、DNA復制方式二、參與DNA復制的因子三、DNA復制過程四、逆轉(zhuǎn)錄五、DNA損傷的修復單擊畫面繼續(xù)第4頁/共111頁一、DNA的復制方式單擊畫面繼續(xù)

半保留復制(semiconservativereplication)----在DNA復制過程中，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而成為單鏈，分別以DNA雙螺旋中的一條鏈為模板，按堿基互補配對的原則合成兩條新的互補鏈。這樣新合成的DNA雙鏈中一股單鏈是從親代完整地接受過來的，另一股單鏈完全重新合成。第5頁/共111頁DNA半保留復制的證據(jù)

單擊畫面繼續(xù)第6頁/共111頁幾個相關概念：

1.復制起始點

(origin,ori)

原核生物只有一個復制起始點； 真核生物染色體DNA有多個復制起始點，同時形成多個復制單位，兩個起始點之間的DNA片段稱為復制子(replicon)。第7頁/共111頁

復制子第8頁/共111頁

2.復制叉

(replicationfork)

復制時雙鏈打開，分開成兩股，新鏈沿 著張開的模板生成，復制中形成的這種Y

字形的結(jié)構(gòu)稱為復制叉。第9頁/共111頁二、原核生物DNA復制的參與因子1.底物

dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)2.聚合酶DNA聚合酶I、II、III3.模板單鏈的DNA母鏈4.引物寡核苷酸引物（RNA)5.其他酶和蛋白質(zhì)因子解鏈酶，解旋酶,單鏈結(jié)合蛋白，連接酶

單擊畫面繼續(xù)第10頁/共111頁（一）DNA聚合酶的活性5′至3′的聚合活性5′→3′方向核酸外切酶活性5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性單擊畫面繼續(xù)第11頁/共111頁5′至3′的聚合活性（5′→3′）單擊畫面繼續(xù)第12頁/共111頁

核酸外切酶活性

3′→5′外切酶活性5′→3′外切酶活性單擊畫面繼續(xù)第13頁/共111頁大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的結(jié)構(gòu)和功能延長因子DNA聚合酶Ⅲ兩個亞基夾住DNADNA聚合酶Ⅲ異二聚體核心酶校對引物的結(jié)合和識別促使核心酶二聚化第14頁/共111頁（二）DNA拓撲異構(gòu)酶(解旋酶）既能水解，又能打斷堿基互補配對的氫鍵拓撲酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中的一股拓撲酶Ⅱ切斷DNA雙鏈

（三）解鏈酶使復制差前方的雙鏈截開一小段（四）單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）維持模板處于單鏈狀態(tài)保護單鏈的完整(五)引物酶是RNA聚合酶，合成一段RNA引物

單擊畫面繼續(xù)第15頁/共111頁（六）DNA連接酶（ligase）催化兩段DNA之間的連接單擊畫面繼續(xù)第16頁/共111頁三、DNA的復制過程（一）復制的起始單擊畫面繼續(xù)（二）復制的延伸

（三）復制的終止

第17頁/共111頁

1.DNA復制的起點

原核生物從一個固定的起始點開始，同時向兩個方向進行的，稱為雙向復制單擊畫面繼續(xù)θ復制原核生物DNA的復制（一）復制的起始第18頁/共111頁

2.復制叉的形成復制叉----復制開始后由于DNA雙鏈解開，在兩股單鏈上進行復制，形成在顯微鏡下可看到的叉狀結(jié)構(gòu)。單擊畫面繼續(xù)第19頁/共111頁3.起始的過程打開DNA超螺旋打開雙螺旋防止復螺旋單鏈結(jié)合蛋白解鏈酶引物復合體引物酶拓撲異構(gòu)酶合成單擊畫面繼續(xù)第20頁/共111頁DNA復制起始的過程拓撲異構(gòu)酶解鏈酶單鏈結(jié)合蛋白DNA聚合酶引物酶及引發(fā)體DNA連接酶引物DNA雙鏈′5′3′5′3單擊畫面繼續(xù)第21頁/共111頁拓撲異構(gòu)酶解鏈酶單鏈結(jié)合蛋白DNA聚合酶引物酶及引發(fā)體DNA連接酶引物DNA復制起始的過程拓撲異構(gòu)酶與DNA雙鏈結(jié)合，解開超螺旋?！?′3′5′3單擊畫面繼續(xù)第22頁/共111頁拓撲異構(gòu)酶解鏈酶單鏈結(jié)合蛋白DNA聚合酶引物酶及引發(fā)體DNA連接酶引物DNA復制起始的過程解鏈酶解開DNA雙螺旋′5′3′5′3單擊畫面繼續(xù)第23頁/共111頁拓撲異構(gòu)酶解鏈酶單鏈結(jié)合蛋白DNA聚合酶引物酶及引發(fā)體DNA連接酶引物單鏈結(jié)合蛋白防止復螺旋′5′3′5′3單擊畫面繼續(xù)DNA復制起始的過程第24頁/共111頁拓撲異構(gòu)酶解鏈酶單鏈結(jié)合蛋白DNA聚合酶引物酶及引發(fā)體DNA連接酶引物DNA復制起始的過程引物酶合成引物′5′3′5′3單擊畫面繼續(xù)第25頁/共111頁二、DNA復制的延伸單擊畫面繼續(xù)1.DNA聚合酶把新生鏈的第一個脫氧核苷酸加到引物的3′-OH上，開始新生鏈的合成過程。AG

T

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DNA聚合酶ACGACGTT引物第26頁/共111頁AG

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AGCGACGGTTTT

組成

DNA的脫氧核糖核苷酸一個個連接起來單擊畫面繼續(xù)3′,5′-磷酸二酯鍵引物第27頁/共111頁AG

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GCGACGGTTTTA單擊畫面繼續(xù)引物第28頁/共111頁AG

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GCGACGTTGTTA單擊畫面繼續(xù)引物第29頁/共111頁AG

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GCGACGGTTAAT單擊畫面繼續(xù)引物第31頁/共111頁AG

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GCGCGGTTAATAT單擊畫面繼續(xù)引物第33頁/共111頁AG

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GGCGGTTAATATCDNA模板鏈單擊畫面繼續(xù)DNA新鏈引物第35頁/共111頁單擊畫面繼續(xù)DNA聚合酶DNA聚合酶2.岡崎片段岡崎片段岡崎用電子顯微鏡看到了DNA復制過程中出現(xiàn)一些不連續(xù)片段，這些不連續(xù)片段只存在與DNA復制叉上其中的一股。后來就把這些不連續(xù)的片段稱為岡崎片段。第36頁/共111頁3.半不連續(xù)復制領頭鏈隨從鏈岡崎片段5′3′′5′3單擊畫面繼續(xù)半不連續(xù)復制

DNA復制時,一條鏈是連續(xù)的,另一條鏈是不連續(xù)的,稱為半不連續(xù)復制。第37頁/共111頁三復制的終止復制有終止信號polⅠ5′→3′外切酶活性水解引物polⅠ聚合活性填補空隙DNA連接酶連接缺口。單擊畫面繼續(xù)第38頁/共111頁大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶Ⅱ分子量每個細胞的分子統(tǒng)計數(shù)5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用轉(zhuǎn)化率DNA聚合酶Ⅰ109，000400+++1120，000100++-0.05400，00010-20++-50比較項目DNA聚合酶III切除引物修復修復復制功能

1999年發(fā)現(xiàn)聚合酶和，它們涉及DNA的錯誤傾向修復（erroounerepair）第39頁/共111頁DNA忠實性的保障1、堿基的配對規(guī)律：模板鏈與新生鏈之間的堿基配對保證堿基配錯幾率約為1/104～1/105。2、DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性的校對功能，使堿基的錯配幾率又降低100～1000倍。3、復制中的即時校讀功能。4起始時以RNA作為引物第40頁/共111頁復制的忠實性

DNA復制過程是一個高度精確的過程，據(jù)估計，大腸桿菌DNA復制5109堿基對僅出現(xiàn)一個誤差，保證復制忠實性的原因主要有以下三點:DNA聚合酶的高度專一性（嚴格遵循堿基配對原則，但錯配率為710-6

）

DNA聚合酶的校對功能（錯配堿基被3’-5’

外切酶切除）第41頁/共111頁DNA聚合酶的校對功能

5′-核酸外切酶3′-核酸外切酶裂縫聚合中心裂縫內(nèi)部第42頁/共111頁DNA聚合酶的校對功能聚合酶錯配鹼基復制方向正確核苷酸5′5′5′3′3′3′切除錯配核苷酸第43頁/共111頁起始時以RNA作為引物的作用

DNA復制為什么要合成一個RNA引物，而后又把這個引物消除呢？這是保證DNA聚合過程高度精確的又一措施。已知DNA聚合酶具有35外切酶功能校對復制過程中的核苷酸，也就是說聚合酶在開始形成一個新的磷酸二酯鍵前，總是檢查前一個堿基是否正確，這就決定了它不能從頭開始合成。因此先合成一條低忠實性的多核苷酸來開始DNA的合成，并以核糖核苷酸來表示是“暫時”的，當DNA開始聚合以后再以53外切酶的功能切除，以高忠實性的脫氧核苷酸取而代之，確保復制的忠實性。第44頁/共111頁領頭鏈隨從鏈岡崎片段5′3′′5′3拓撲異構(gòu)酶解鏈酶單鏈結(jié)合蛋白DNA聚合酶引物酶及引發(fā)體DNA連接酶引物課堂小結(jié)第45頁/共111頁三、真核DNA的復制合成真核DNA的合成的基本過程類似于原核DNA，不同之處：

多復制起點至少有五種聚合酶αβγδε

端粒的復制依賴于端粒酶真核生物DNA聚合酶

αβγδε亞基數(shù)44425分子量（KD)＞25036-38160-300170256細胞內(nèi)定位核核線粒體核核5′→3′聚合活性＋＋＋＋＋3′→5′外切活性－－－－－

功能復制、引發(fā)修復復制復制復制第46頁/共111頁第47頁/共111頁DNA復制過程第48頁/共111頁真核生物DNA復制叉結(jié)構(gòu)示意圖第49頁/共111頁端粒酶（telomerase）

DNA復制需要引物，但在線形DNA分子末端不可能通過正常的機制在引物被降解后合成相應的片段.如果沒有特殊的機制合成末端序列，染色體就會在細胞傳代中變得越來越短。這一難題是通過端粒酶的發(fā)現(xiàn)才得到了澄清，端粒酶是一種含RNA的蛋白復合物，實質(zhì)上是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，它能催化互補于RNA模板的DNA片段的合成，使復制以后的線形DNA分子的末端保持不變。

初步研究表明，人體中生殖細胞的端粒長度保持不變，而體細胞的端粒長度則隨個體的老化而逐步縮短。對此的一個推論是：人的生殖細胞具端粒酶的活力，體細胞則否。這一問題的解決無疑會有助于對生命衰老的認識。5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶第50頁/共111頁端粒合成的一種模型3′5′TTTTGGGGTTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3′5′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3′5′AATTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG整合和雜交移位和再雜交端粒合成的完成TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTT5′3′nAA3′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5′3′TTCCCCTnAA3′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5′3′TTAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTn進一步加工繼續(xù)延伸第51頁/共111頁真核和原核DNA細胞復制比較第52頁/共111頁四、逆轉(zhuǎn)錄1、逆轉(zhuǎn)錄：是以RNA為模板合成DNA的過程。2、逆轉(zhuǎn)錄酶：是一種以RNA為模板的DNA聚合酶。沒有3’5’外切酶的活性，所以沒有校對功能，逆轉(zhuǎn)錄的錯配率高。第53頁/共111頁五、DNA的損傷修復突變可分為：自發(fā)突變、人工誘變突變的意義突變是進化、分化的分子基礎只有基因型改變的突變致死性的突變突變是某些疾病的發(fā)病基礎DNA

的損傷也稱突變，是指DNA分子上堿基的改變。第54頁/共111頁二、引發(fā)突變的因素

誘變因素及突變類型第55頁/共111頁三、突變分子改變的類型錯配（點突變）一個堿基改變?nèi)笔?、插入和框移突變片段插入或缺失重排較大片段重組或重排第56頁/共111頁四、損傷的修復損傷--復制過程中發(fā)生的DNA突變光修復切除修復重組修復SOS修復第57頁/共111頁

（一）光修復紫外光照射可使相鄰的兩個T形成二聚體

光修復酶可使二聚體解聚為單體狀態(tài)，DNA完全恢復正常。光修復酶的激活需300-600μm波長的光。第58頁/共111頁（二）切除修復參與的酶有核酸內(nèi)切酶，polⅠ,DNA連接酶第59頁/共111頁

（三）重組修復重組蛋白RecA，polⅠ，連接酶參與損傷會保留下去第60頁/共111頁（四）SOS修復DNA損傷面太大，復制難以繼續(xù)。通過SOS修復，復制有可能繼續(xù)，細胞有可能存活，但SOS修復機制的特異性低，對堿基的識別、選擇能力差、錯誤多。

第61頁/共111頁第二節(jié)RNA的生物合成單擊畫面繼續(xù)定義：RNA的生物合成就是轉(zhuǎn)錄，即以DNA為模板，在依賴于DNA的RNA聚合酶的催化下，以4種NTP（ATP、CTP、GTP和UTP為原料，合成RNA的過程。合成部位：細胞核合成原料：四種NTP第62頁/共111頁轉(zhuǎn)錄特點：1、轉(zhuǎn)錄單位：啟動子終止子2、不對稱轉(zhuǎn)錄：兩條DNA鏈不同時進行轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象。編碼鏈或有意義鏈；模板鏈或反意義鏈3、RNA聚合酶：

全酶：有αα‘ββ’σ5個亞基組成作用識別啟動子，引發(fā)RNA的合成。

核心酶：不含σ亞基，延長RNA鏈第63頁/共111頁(二)轉(zhuǎn)錄過程1.起始第64頁/共111頁第65頁/共111頁2.延長σ因子循環(huán)

第66頁/共111頁3.終止

不依賴r

-因子的終止子：第67頁/共111頁依賴r

-因子的終止子的終止反應：

r

-因子：含六聚體的寡聚蛋白，具有依賴RNA的NTP酶活性，它結(jié)合于新生RNA上，借助于水解NTP產(chǎn)生能量推動RNA聚合酶向前移動，當酶遭遇終止子時暫停前進，r

-因子追上酶，與酶相互作用釋放RNA。還具有RNA-DNA解螺旋酶活性。第68頁/共111頁轉(zhuǎn)錄過程：轉(zhuǎn)錄的起始：RNA的延長：5′3′識別解鏈磷酸二酯鍵的形成（ATP、GTP）轉(zhuǎn)錄的終止：遇到終止子，RNA鏈停止延長，核心酶脫離，新RNA釋放。第69頁/共111頁第70頁/共111頁第71頁/共111頁AG

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DNA的一條鏈AGCUGACGGUUU游離的核糖核苷酸

(原料）DNA解旋，以一條鏈為模板合成RNA細胞核中單擊畫面繼續(xù)第72頁/共111頁AG

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A

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AGCUGACGGUUU

DNA與RNA的堿基互補配對：A——U；T——A；C——G；G—CRNA聚合酶細胞核中單擊畫面繼續(xù)第73頁/共111頁AG

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AGCGACGGUUUU

組成

RNA的核糖核苷酸一個個連接起來細胞核中單擊畫面繼續(xù)第74頁/共111頁AG

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GCGACGGUUUUA細胞核中單擊畫面繼續(xù)第75頁/共111頁AG

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GCGACGUUGUUA細胞核中單擊畫面繼續(xù)第76頁/共111頁AG

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GCGACGUGUUAA細胞核中單擊畫面繼續(xù)第77頁/共111頁AG

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GCGACGGUUAAU細胞核中單擊畫面繼續(xù)第78頁/共111頁AG

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GCGACGGUUAAUA細胞核中單擊畫面繼續(xù)第79頁/共111頁AG

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GCGCGGUUAAUAU細胞核中單擊畫面繼續(xù)第80頁/共111頁AG

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GGCGGUUAAUAUC細胞核中單擊畫面繼續(xù)第81頁/共111頁AG

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GGCGGUUAAUAUCDNA上的遺傳信息就傳遞到mRNA上mRNADNA細胞核中單擊畫面繼續(xù)第82頁/共111頁AG

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UCAUGAUUAmRNA

細胞質(zhì)

細胞核

核孔DNAmRNA在細胞核中合成單擊畫面繼續(xù)第83頁/共111頁AG

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UCAUGAUUAmRNA

細胞質(zhì)

細胞核mRNA通過核孔進入細胞質(zhì)UCAUGAUUAmRNA單擊畫面繼續(xù)第84頁/共111頁AG

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UCAUGAUUAmRNA

細胞質(zhì)

細胞核mRNA通過核孔進入細胞質(zhì)UCAUGAUUAmRNA單擊畫面繼續(xù)第85頁/共111頁DNA和RNA合成的比較第86頁/共111頁第三節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄后的加工原核生物RNA的加工真核生物RNA的加工第87頁/共111頁轉(zhuǎn)錄后加工：指在細胞內(nèi)，由RNA聚合酶合成的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物需要經(jīng)過一系列的變化才能轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腞NA分子的過程。第88頁/共111頁（一）、rRNA前體的加工甲基化6500個核苷酸核酸內(nèi)切酶RNaseⅢ、P核酸外切酶一、原核生物RNA的加工第89頁/共111頁（二）tRNA的加工第90頁/共111頁三、真核生物RNA的一般加工轉(zhuǎn)錄初始產(chǎn)物（hnRNA）（一）mRNA前體的加工第91頁/共111頁真核mRNA前體的加工步驟:（1）hnRNA被剪接，把內(nèi)含子（DNA上非編碼序列）轉(zhuǎn)錄序列剪掉，把外顯子（DNA上的編碼序列）轉(zhuǎn)錄序列）拼接上，真核生物一般為不連續(xù)基因。加工包括：（4）分子內(nèi)部的核苷酸甲基化修飾。（3）5’端連接“帽子”結(jié)構(gòu)（m7G5ppp5NmpNp-）；（2）3’端添加polyA“尾巴”；第92頁/共111頁第93頁/共111頁真核mRNA的5’－“帽子”加工第94頁/共111頁多聚腺苷酸聚合酶

真核生物mRNA

3’-“尾巴”的加工內(nèi)切酶加尾信號第95頁/共111頁因發(fā)現(xiàn)斷裂基因而獲1993年諾

貝爾生理學獎的RichardJ

RobertandPhllipASharp第96頁/共111頁（二）真核rRNA前體的加工第97頁/共111頁（三）真核tRNA前體的加工第98頁/共111頁四、RNA的拼接機理大多真核生物基因是斷裂基因，即含有內(nèi)含子。斷裂基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物必需通過拼接，去除插入部分（內(nèi)含子,intron），使編碼區(qū)（外顯子,exon）成為連續(xù)序列。這是基因表達的重要環(huán)節(jié)。內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)多種多樣，拼接機制也是多種多樣的。RNA的拼接方式類型Ⅰ內(nèi)含子的自我拼接：核酶的作用類型Ⅱ內(nèi)含子的自我拼接：核酶的作用hnRNA的拼接：核內(nèi)小RNA(SnRNA)與蛋白質(zhì)組成核糖核蛋白體（snRNP）的作用(類型Ⅲ內(nèi)含子的切除）。核tRNA的拼接：酶促拼接第99頁/共111頁核酶的發(fā)現(xiàn)：

1981年CechT在研究四膜蟲(Tetrahymenathermophila)rRNA前體拼接過程中發(fā)現(xiàn)，此類的拼接無需蛋白質(zhì)的酶參與作用，它可自我催化完成。Cech稱具有催化功能的RNA為核酶（ribozyme）。1989年cechT和AltmanS共同獲諾貝爾化學獎，AltmanS的貢獻是發(fā)現(xiàn)RnaseP中的M1RNA單獨也具有催化功能。核酶的發(fā)現(xiàn)改變了酶的化學本質(zhì)是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念，被認為是近二十年來生物化學領域中最令人鼓舞的成就之一。第100頁/共111頁TheM1RNAinribonucleasePiscatalyticTheintroninthepre-rRNAofTetrahemenaisself-spliced因發(fā)現(xiàn)核酶而獲諾貝爾獎的兩位科學家：第101頁/共111頁第四節(jié)基因工程及分子生物學技術簡介

一、基因工程二、體細胞克隆技術三、聚合酶鍵式反應（polymerasechainreaction,PCR）第102頁/共111頁一、基因工程簡介

基因工程亦稱遺傳工程，即利用DNA重組技術的方法，把DNA作為組件，在細胞外將一種外源DNA（目的基因）和載體DNA重新組合連接（重組），最后將重組體轉(zhuǎn)入宿主細胞，使外源基因DNA在宿主細胞中，隨細胞的繁殖而增殖（cloning，克?。?，或最后得到表達，最終獲得基因表達產(chǎn)物或改變生物原有的遺傳性狀。

基因工程的操作技術

基因工程的應用與前景第103頁/共111頁基因工程的操作技術

ForeignDNAtobeinser