載體的選擇與構(gòu)建

載體的選擇與構(gòu)建第1頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二主要內(nèi)容1.細(xì)菌質(zhì)粒載體2.噬菌體載體3.酵母細(xì)胞載體及大容量載體4.動、植物載體第2頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二基因工程載體：

攜帶外源目的基因或DNA片段進入宿主細(xì)胞進行復(fù)制和表達(dá)的工具。

★★載體的一般特性：在宿主中能自我復(fù)制或借助宿主染色體進行復(fù)制容易從宿主細(xì)胞中分離純化具有容納外源DNA分子的能力有限制性內(nèi)切酶位點，便于基因組裝有對載體進行篩選的標(biāo)記或報告基因第3頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二1.1質(zhì)粒的定義質(zhì)粒是染雜色體外能進行自主復(fù)制的遺傳單位，由J.萊德伯格在1952年提出。共生生物、真核生物的細(xì)胞器DNA和細(xì)菌染色體以外的單純的DNA分子某些既能獨立地存在于細(xì)胞質(zhì)中又能整合在染色體上的質(zhì)粒稱為附加體。酵母的殺傷質(zhì)粒(killerplasmid)已知是RNA分子。

1.質(zhì)粒載體1.2質(zhì)粒的分類1.2.1按照復(fù)制性質(zhì)：嚴(yán)緊型質(zhì)粒:帶有與分配有關(guān)的基因，由DNA聚合酶Ⅲ復(fù)制，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時，質(zhì)粒也復(fù)制一次，1～2個/細(xì)胞；松弛型質(zhì)粒:由DNA聚合酶Ⅰ復(fù)制，當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，數(shù)十～數(shù)百個/細(xì)胞一般分子量較大的質(zhì)粒屬嚴(yán)緊型。分子量較小的質(zhì)粒屬松弛型。質(zhì)粒的復(fù)制有時和它們的宿主細(xì)胞有關(guān)，例如某些質(zhì)粒在大腸桿菌內(nèi)的復(fù)制屬嚴(yán)緊型，而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。★★★第4頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二1.2.2按照構(gòu)型：環(huán)形雙鏈DNA分子共價閉合環(huán)狀：兩條鏈都保持完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通常呈超螺旋構(gòu)型開環(huán)DNA：一條保持完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，另一條單鏈上有一到幾個切口線狀DNA：這種質(zhì)粒的雙鏈斷裂，由環(huán)狀變?yōu)槌示€狀這三種構(gòu)型的同一種質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠中電泳時，出現(xiàn)不同的遷移速率，超螺旋構(gòu)型最快，其次是線性構(gòu)型，開環(huán)構(gòu)型最慢。線性質(zhì)粒

發(fā)卡線性質(zhì)粒：在兩端均有反向重復(fù)序列，形成共價閉合的發(fā)卡環(huán)多肽結(jié)合質(zhì)粒：5’端與多肽連接，同時兩末端還具有反向重復(fù)序列，多為放線菌質(zhì)粒這些結(jié)構(gòu)可以防止質(zhì)粒被降解1.2.3按照接合能力:

接合型質(zhì)粒（F質(zhì)粒）非接合型質(zhì)粒第5頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二1.2.4按照宿主范圍:

廣宿主質(zhì)粒（以及穿梭質(zhì)粒）單一宿主質(zhì)粒1.2.5按照宿主中的存在形式:

游離型質(zhì)粒整合型質(zhì)粒（復(fù)制子不能被宿主識別，帶有同源片段）1.2.6按照功能：基因克隆質(zhì)粒（篩選系統(tǒng)，MCS）基因表達(dá)質(zhì)粒(篩選系統(tǒng)，MCS，啟動子，RBS，融合tag）基因敲除質(zhì)粒（篩選系統(tǒng)，目的基因的同源片段）輔助性質(zhì)粒（例如提供位點特異性重組酶）

第6頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二1.3質(zhì)粒的復(fù)制1.3.1復(fù)制子(replicon)包括復(fù)制起點(ori)、復(fù)制控制元件、復(fù)制蛋白編碼基因的遺傳單元質(zhì)粒一般只帶有少量復(fù)制需要的基因，其它由宿主提供。廣宿主質(zhì)粒一般攜帶復(fù)制所需的所有或大部分基因，而且啟動子、RBS位點都可以被多種宿主識別。質(zhì)粒中除了復(fù)制子之外的序列都不是必須序列，可以用其它序列替換來進行基因克隆或表達(dá)。pMB1,colE1replicon拷貝數(shù)15～20宿主范圍?。耗c細(xì)菌修飾的pMB1replicon拷貝數(shù)500～700宿主范圍小：腸細(xì)菌（pUC系列)pSC101replicon拷貝數(shù)5宿主范圍廣多種革蘭氏陰性菌pUB11050廣多種革蘭氏陽性菌pE1945廣多種革蘭氏陽性菌★第7頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二1.3.2拷貝數(shù)控制機理反義RNA對拷貝數(shù)的調(diào)控colE1repliconRNAII被RNaseH切割后充當(dāng)復(fù)制引物鏈（前導(dǎo)鏈的引物），而RNAI與其結(jié)合后阻止RNaseH的切割質(zhì)粒編碼的Rop蛋白二聚體可提高兩種RNA結(jié)合復(fù)合物的穩(wěn)定性質(zhì)粒拷貝數(shù)越高，Rop、RNAI濃度越大，最終終止復(fù)制細(xì)胞分裂后，Rop及RNAI濃度變小，開始進行復(fù)制第8頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二RepA調(diào)控Iteronsaredirectlyrepeatedsequences（17～22bp)whichplayanimportantroleinregulationofplasmidcopynumberinbacterialcells（重復(fù)子）Ori附近的repA基因編碼RepA蛋白，其對自身的表達(dá)具有負(fù)調(diào)節(jié)作用RepA蛋白可以和Iterons結(jié)合，促進復(fù)制復(fù)合物的形成，從而開始質(zhì)粒的復(fù)制質(zhì)?？截悢?shù)高時，RepA蛋白濃度高，形成二聚體，兩個質(zhì)粒聚集連在一起，復(fù)制停止。細(xì)胞分裂后重新復(fù)制pSC101replicon第9頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二1.4質(zhì)粒的不穩(wěn)定性

分離不穩(wěn)定性：在細(xì)胞分裂過程中，有一個子細(xì)胞沒有獲得質(zhì)粒DNΑ拷貝，并最終增殖成為無質(zhì)粒的優(yōu)勢群體；結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性：由轉(zhuǎn)位作用和重組作用所引起的質(zhì)粒DNA的重排與缺失質(zhì)粒的分配方式：主動分配平均分配:每個子細(xì)胞剛好獲得一半數(shù)目的質(zhì)粒拷貝配對位點分配:只有一對質(zhì)粒呈主動分配，其余的是隨機分配。主動分配存在著有效的質(zhì)?？截悢?shù)控制系統(tǒng)，從而保證了質(zhì)粒的高度穩(wěn)定性隨機分配分配不穩(wěn)定，部分子細(xì)胞沒有質(zhì)粒，并在生長過程中具有優(yōu)勢而逐漸使含質(zhì)粒細(xì)胞比例越來越少★第10頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二第11頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二質(zhì)粒上的par區(qū)段編碼分配蛋白，質(zhì)粒上還有par蛋白的結(jié)合序列（inc區(qū)）負(fù)超螺旋密度的增加可以使質(zhì)粒分配更穩(wěn)定，par區(qū)可以增加負(fù)超螺旋密度，DNA促旋酶則降低分配穩(wěn)定性。(partitionregion）第12頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二質(zhì)粒多聚體也導(dǎo)致分配不穩(wěn)定：質(zhì)粒多聚體含有多個復(fù)制起點，其復(fù)制速度是單體的數(shù)倍，將導(dǎo)致大量細(xì)胞只含有多聚體質(zhì)粒而影響分配穩(wěn)定性有的質(zhì)粒具有宿主致死功能，殺死丟失質(zhì)粒的細(xì)胞，如F質(zhì)粒的ccdA(編碼解毒劑）,ccdB（編碼毒性蛋白）第13頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二

用同一復(fù)制系統(tǒng)的兩種質(zhì)粒會在復(fù)制和隨后向子細(xì)胞的分配過程中彼此竟?fàn)?，這樣的質(zhì)粒在同一個細(xì)胞中不能和平共處。這種現(xiàn)象稱之為不相容性1.5質(zhì)粒的不相容性若兩種質(zhì)粒拷貝數(shù)不一樣，分配有利于高拷貝數(shù)質(zhì)?！锊幌嗳萑褐改切┚哂胁幌嗳菪缘馁|(zhì)粒組成的一個群體，一般具有相同的復(fù)制子第14頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二

細(xì)菌種類

質(zhì)粒不相容群

代表性質(zhì)粒

革蘭氏陰性細(xì)菌IncFⅠF,R386,R455,ColV

IncFⅡR1,R100

IncFⅢCol1B-K98

IncFⅣR124

IncARA1

IncCR40a,R55

IncHR27,R726

IncIColIb-P9,R144,R483,R64,R621a

IncMR69,R466b

IncNR46,R15,N3,pKM101

IncOR16,R723

IncPRP1,RP4,R68,R751,R690,RK2

IncQRSF1010,pKT212,pKT230,pGSS

IncWR7K,R388,pSA747

IncXR6K

革蘭氏陽性細(xì)菌pT181pT181,pC221,pS194,pC223,pUB112,pE194

pUB110pBC110,pBC16

pSN2pSN2,pE12,pIM13第15頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二（1）θ型復(fù)制單向復(fù)制

雙向復(fù)制革蘭氏陰性細(xì)菌中多數(shù)質(zhì)粒是以θ型方式復(fù)制，R1，R100等是單向復(fù)制，F(xiàn)，R6k等是雙向復(fù)制類型。1.6質(zhì)粒的復(fù)制方式第16頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二在革蘭氏陽性細(xì)菌中大多數(shù)質(zhì)粒是以滾環(huán)方式復(fù)制，如pC194,pE194等，這種方式會造成質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，存在大量的單鏈質(zhì)粒DNA（2）滾環(huán)復(fù)制

第17頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二質(zhì)粒轉(zhuǎn)移性：是指質(zhì)粒能自動地從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞，甚至還能帶動供體細(xì)胞的染色體DNA向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移。質(zhì)粒在細(xì)菌間的轉(zhuǎn)移，需要供體和受體細(xì)胞間的直接接觸才能進行，即接合作用(conjugation)，這類質(zhì)粒被稱為自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(self-transmissibleplasmid)或接合質(zhì)粒(conjugativeplasmid)。有些質(zhì)粒雖然不能自主轉(zhuǎn)移，但能被其他一些自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒所轉(zhuǎn)移，這類質(zhì)粒又被叫做可移動質(zhì)粒(mobilizableplasmid)，可以借助這種方式將重組質(zhì)粒導(dǎo)入難于轉(zhuǎn)化的宿主中。1.7質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性第18頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二質(zhì)?？截悢?shù)轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒拷貝數(shù)轉(zhuǎn)移性ColE110-18不能R6k1-2能ColE210-18不能RP44-7能ColE310-18不能pBR322約20不能F因子1-2能pBR325約20不能R1001-2能E.coli

質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性第19頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二

G-菌中質(zhì)粒分子量較大，而G+菌中質(zhì)粒較??；

已知大腸桿菌的F質(zhì)粒、R1、R100、ColV、Collb-P9、R6k、RP4等均屬于自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，它們是低拷貝的大質(zhì)粒，其中較小的R6k質(zhì)粒也有38kb。G+細(xì)菌如鏈霉菌中的自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，除SCPl是巨大質(zhì)粒外，很多都是10kb左右的小質(zhì)粒，而與轉(zhuǎn)移有關(guān)的區(qū)域只有2kb左右。自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的大小差異可能是因為它們的轉(zhuǎn)移機制不同，G+細(xì)菌中質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移不需要性菌毛，因此質(zhì)粒分子量較小。（1）自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的特點第20頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二大多數(shù)自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒都有tra基因和oriT位點，它們在質(zhì)粒自主轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。

自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒能誘導(dǎo)含有與自己相同或相似的oriT位點的非自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)移，如將自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒整合到染色體上后，帶動染色體轉(zhuǎn)移也是從質(zhì)粒的oriT位點開始的。

tra基因：大多數(shù)tra基因的產(chǎn)物與性菌毛的形成(F、RP4和pKMl01都編碼一根性菌毛)、雜交對的形成有關(guān)；有些tra基因編碼作用于oriT位點的內(nèi)切酶，使質(zhì)粒中的一條DNA鏈產(chǎn)生切口，從而開始轉(zhuǎn)移；有些tra基因則與質(zhì)粒轉(zhuǎn)移調(diào)控等有關(guān)。oriT位點：oriT位點不僅是質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的起始位點，也是質(zhì)粒轉(zhuǎn)移后DNA末端再環(huán)化的位點，因此質(zhì)粒必須具有oriT位點才能進行自主轉(zhuǎn)移。第21頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二（2）

可移動質(zhì)粒的特點

不能在菌株間形成接合通道：G-細(xì)菌中可移動質(zhì)粒缺少與性菌毛合成有關(guān)的基因(約10個左右)。因此，在進行轉(zhuǎn)移時，必須利用位于同一細(xì)胞內(nèi)的自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒編碼合成的性菌毛才能進行。具有特殊的轉(zhuǎn)移起始位點和切割功能基因：如ColEl具有獨特的bom位點和負(fù)責(zé)DNA轉(zhuǎn)移的mob基因。ColEl的bom位點類似于F質(zhì)粒的oriT。mob基因的功能類似于tra基因，mob基因也能編碼特異的核酸內(nèi)切酶，在bom位點進行切割，但沒有編碼性菌毛的tra基因，所以它不能自主轉(zhuǎn)移。第22頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二F質(zhì)粒誘動ColEl轉(zhuǎn)移的模型圖

mob產(chǎn)物bomF-mobF+mobbomF+mob-F+mob+bom-不能轉(zhuǎn)移性菌毛轉(zhuǎn)移不能轉(zhuǎn)移不能轉(zhuǎn)移F質(zhì)粒第23頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二1.8報告基因抗生素抗性基因：

kan,cat,bla,spc,em,tet等組織化學(xué)顯色基因：

E.coli

lacZ，-galactosidase（半乳糖苷酶）

E.coli

gusA（uidA)，

-glucuronidase(GUS，葡萄糖苷醛酸酶）熒光蛋白基因：

rfp，gfp，..熒光素酶基因：luc

熒光素酶在氧化底物熒光素（luciferin）的過程中，會發(fā)出生物熒光，可以通過熒光測定儀或液閃儀測定熒光強度?？梢詷O其靈敏、高效地檢測基因的表達(dá)。是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用的一種檢測方法。

報告基因：是為基因表達(dá)強度、蛋白定位等提供可測信號的一類基因。標(biāo)記基因：為重組提供篩選標(biāo)記的一類基因★第24頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二藍(lán)白斑篩選(互補篩選）原理

載體攜帶大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個氨基酸（N端，稱為肽）的編碼信息。宿主菌缺失lacZ基因的起始氨基酸（met),導(dǎo)致翻譯在后續(xù)met處開始，其產(chǎn)物為β-半乳糖苷酶的C端，稱為ω肽）肽段無催化能力，但可使ω肽段正確折疊并形成穩(wěn)定的四聚體；ω肽段單獨無法正確折疊，因此兩個肽段在一起才具有催化活性，這稱為互補。載體的肽編碼序列中還插入一個不破壞閱讀框的多克隆位點（MCS），由MCS編碼的少數(shù)十幾個氨基酸插入到肽的氨基端不會影響其功能，然而，當(dāng)外源DNA插入MCS后，幾乎不可避免地導(dǎo)致其功能喪失?？蛰d體進入宿主后在IPTG誘導(dǎo)下實現(xiàn)互補，β-半乳糖苷酶分解X-Gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，菌落為藍(lán)色；連接有插入片段的載體在IPTG誘導(dǎo)下無互補作用，X-Gal不被分解，菌落為白色X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷IPTG:異丙基-β-D-硫代半乳糖苷X-Gluc：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷★MCSPlac第25頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二X-galBlueX-galNoinsertInsertX-galBlueX-galNocolorNoinsertInsert第26頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二1.9質(zhì)粒的提取（1）CsCl-EtBr密度梯度離心(Radloff,1967)溴化乙錠摻入DNA導(dǎo)致密度降低線性DNA和閉環(huán)DNA結(jié)合的溴化乙錠的量有差異，前者摻入的更多質(zhì)粒純度非常高，但耗時、儀器藥品昂貴

36萬g:6h18萬g:48h溫和裂解細(xì)胞，釋放出質(zhì)粒，而染色體、蛋白及細(xì)胞殘余通過離心除去★第27頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二（2）堿裂解法（BirnboimandDoly，1979）線性DNA在pH12~12.6易變性，變性后不易復(fù)性而環(huán)狀DNA不易變性，即使有部分發(fā)生變性也容易復(fù)性溶液I:50mM葡萄糖（使菌體均勻懸浮，不易沉積結(jié)塊）

25mMTris-Cl，pH8.0；（緩沖作用）

10mMEDTA（螯合Mg2+等金屬離子，失活DNase)25：24：1酚/氯仿/異戊醇：（變性蛋白質(zhì)）溶液II:0.2NNaOH(裂解細(xì)胞、線性DNA變性)1%SDS(與蛋白質(zhì)結(jié)合）溶液III:3M醋酸鉀(置換SDS的鈉離子，形成沉淀，并與基因組DNA共沉淀）

2M醋酸（中和堿性pH，防止DNA斷裂）無水乙醇：沉淀質(zhì)粒DNA第28頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二堿裂解法流程圖對數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提離心洗滌酒精沉淀干燥溶解沉淀質(zhì)粒DNA溶液第29頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當(dāng)加熱處理DNA溶液時（40-50s)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。（3）煮沸法原理第30頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二1.10質(zhì)粒的改造對天然質(zhì)粒的改造，原則上僅需要保留其復(fù)制子的必需序列和標(biāo)記基因。盡可能減少分子量，小質(zhì)粒在提取純化時不易破壞，可容納更大的外源DNA。加入多克隆位點（MCS),便于在此處插入各種片段有1-2個可在宿主中表達(dá)的標(biāo)記基因若改造成表達(dá)質(zhì)粒，還需要加入啟動子、RBS等元件。多克隆位點：人工合成的，密集排列的，可被多種限制酶識別切割的DNA序列★第31頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二克隆片段一般插入Ap或Tc中，破壞一個抗性基因正選擇方法：分別在含有Ap或Tc的平板上對應(yīng)點接培養(yǎng)菌株負(fù)選擇方法：對于Ap,選擇培養(yǎng)基中含有淀粉，長出大菌落后倒入含有青霉素和碘的指示劑，Ap抗性菌株將青霉素轉(zhuǎn)化為青霉酮酸，后者和碘結(jié)合，四周不會變藍(lán)，而Ap敏感株為藍(lán)色。對于Tc，采用環(huán)絲氨酸富集法?？剐灾昴芎铣傻鞍踪|(zhì)，死亡；敏感株不能合成，生長受到抑制pBR322★分子量小，合適的標(biāo)記，拷貝數(shù)較多blatet克隆載體和表達(dá)載體示例第32頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二pUCFrompMB1分子量小合適的標(biāo)記拷貝數(shù)多第33頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二第34頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二主要內(nèi)容1.細(xì)菌質(zhì)粒載體定義，分類，復(fù)制機理與方式，不穩(wěn)定性與不相容性，可移動性報告基因，質(zhì)粒提取方法與原理2.噬菌體載體3.酵母細(xì)胞載體及大容量載體4.動、植物載體第35頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二2.噬菌體和噬菌體載體1951年，J.Lederberg的妻子EstherLederberg證明了J.Lederberg和Tatum用來雜交的K12中有原噬菌體，并命名為λ，經(jīng)過約10年的研究搞清了溶源化的實質(zhì)。

噬菌體是感染大腸桿菌的溶源性噬菌體，在感染宿主后可進入溶源狀態(tài)，也可進入裂解循環(huán)。噬菌體基因組為長度約為50kb的雙鏈DNA分子，實際大小為48502bp。其兩端的5'末端帶有12個堿基的互補單鏈（粘性末端），稱為COS位點；2.1

噬菌體及其生活周期Cohesiveendsite★★第36頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二λ噬菌體由頭和尾構(gòu)成，其基因組組裝在頭部蛋白質(zhì)外殼內(nèi)部，其序列已被全部測出。用感染大腸桿菌的λ噬菌體改造成的載體是應(yīng)用最為廣泛的病毒載體。T偶系列烈性噬菌體

溫和噬菌體（λ）第37頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二晚期基因第38頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二噬菌體生活周期可選擇進入裂解生長狀態(tài)（lyticgrowth），大量復(fù)制并組裝成子代噬菌體顆粒，導(dǎo)致宿主細(xì)胞裂解。經(jīng)過40～45min的生長循環(huán)，釋放出約100個感染性噬菌體顆粒（每個細(xì)胞）；或者進入溶源狀態(tài)（lysogenicstate），將噬菌體基因組DNA通過位點專一性重組整合到宿主的染色體DNA中，并隨宿主的繁殖傳給子代細(xì)胞。第39頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二當(dāng)λ噬菌體侵入新的宿主細(xì)胞時，裂解和溶原途徑以同樣的方式開始。二者都需要前早期和后早期基因的表達(dá)。但是以后它們就分道揚鑣了：如果晚期基因表達(dá)了，隨之而來的是裂解發(fā)育；如果建立起阻遏蛋白cI的大量合成，接著發(fā)生的則是溶原化N基因：編碼一個抗終止(Antitermination)因子，該因子作用在nut位點，允許轉(zhuǎn)錄繼續(xù)進入后早期基因。cro基因：有雙重功能a.阻止阻遏蛋白CI的合成(如果裂解周期繼續(xù)進行，這種作用是必須的)；b.關(guān)閉前早期基因的表達(dá)(在裂解周期后期是不需要的)。（1）前早期基因表達(dá)第40頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二后早期基因包括阻遏蛋白基因cI,兩個復(fù)制基因(裂解侵染所必須)，和7個重組基因(某些與裂解侵染時的重組有關(guān)，有兩個是溶源時將λDNA整合到細(xì)菌染色體中所必需)，還有3個編碼調(diào)控產(chǎn)物的基因，其調(diào)控產(chǎn)物有相反的功能：

cⅡ和cⅢ這對調(diào)控產(chǎn)物是啟動阻遏蛋白CI合成所必需的。（有利溶源）調(diào)控蛋白Q

是一個使宿主RNA聚合酶繼續(xù)進入晚期基因的抗終止因子(有利裂解）（2）后早期基因表達(dá)（3）晚期基因表達(dá)晚期基因是作為單獨的轉(zhuǎn)錄單位表達(dá)的，它從位于Q與S之間的啟動子PR’處起始。PR’是組成型的,在缺乏基因Q產(chǎn)物時，轉(zhuǎn)錄終止在tR3部位。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物稱為6SRNA，長194個堿基;當(dāng)存在可利用的pQ時，pQ抑制在tR3處的終止作用，使6SRNA延伸，其結(jié)果使晚期基因全部表達(dá)。第41頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二（4）cI在溶原化中的作用cⅠ基因是從啟動子PRM處轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄在該基因的左方停止。由于轉(zhuǎn)錄本缺少常見的核糖體結(jié)合位點，所以轉(zhuǎn)譯效率較差，只產(chǎn)生低含量的阻遏蛋白，此時以單體形式存在。cⅠ濃度高時形成二聚體，可獨立地與兩個操縱基因OL和OR結(jié)合：

1區(qū)比2、3區(qū)與cⅠ的親和力高約10倍，cⅠ總是先與1區(qū)結(jié)合。1區(qū)被二聚體結(jié)合后增加第二個二聚體與2區(qū)的親和力。當(dāng)1與2區(qū)都被結(jié)合時，這種相互作用不再擴大到3區(qū)在1、2區(qū)的結(jié)合阻止啟動子PR、PL的啟動,同時激活細(xì)菌RNA聚合酶在PRM的轉(zhuǎn)錄，建立了一個正的自調(diào)控回路。阻遏蛋白的濃度變得過大時將占有OR3區(qū)，PRM的啟動被阻止，

cⅠ的轉(zhuǎn)錄終止，從而降低阻遏蛋白濃度。自體正負(fù)調(diào)控系統(tǒng)★第42頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二只要阻遏蛋白cⅠ的含量充分，cⅠ基因就持續(xù)表達(dá)。結(jié)果是OL和OR無限期被占用，于是就阻遏了裂解周期，使原噬菌體維持其惰性形式。阻遏蛋白的存在解釋了超感染免疫性現(xiàn)象。如果有第二個λ噬菌體DNA進入溶原細(xì)胞，由原噬菌體基因合成的cⅠ將立即與新噬菌體的OL和OR結(jié)合，阻止第二個噬菌體進入裂解周期。cI基因區(qū)段也稱為免疫區(qū)，表示為imm。cI在溶原化中的作用人工改造的溫敏性啟動子系統(tǒng)：cITS857+(PL或PR),42℃時阻遏蛋白失活，啟動轉(zhuǎn)錄；反之31℃時無法轉(zhuǎn)錄第43頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二（5）CII和Cro的作用當(dāng)λDNA進入新的宿主細(xì)胞時，細(xì)菌的RNA聚合酶不能轉(zhuǎn)錄cⅠ，基因N和cro首先被轉(zhuǎn)錄。接著，pN使cⅢ、cⅡ、Q和其它后早期基因轉(zhuǎn)錄。CⅡ蛋白激活PRE

（在cro和cⅡ之間）、PI(插入基因int的啟動子）及Panti-Q(位于Q基因內(nèi))的轉(zhuǎn)錄：Cro蛋白（二聚體）通過與PRM作用直接阻止阻遏蛋白的合成，并可關(guān)閉早期基因的表達(dá)，間接阻止阻遏蛋白的合成。PRE的啟動產(chǎn)生了cro反義轉(zhuǎn)錄本及cI轉(zhuǎn)錄本，導(dǎo)致前者表達(dá)終止和最初CI蛋白的合成，CI蛋白啟動正自調(diào)控系統(tǒng)并終止早期基因轉(zhuǎn)錄。此后胞內(nèi)已合成的CII及CIII迅速被降解（CⅡ在體內(nèi)極端不穩(wěn)定，因為有一種HflA的宿主蛋白質(zhì)使它降解。CⅢ的作用是保護CⅡ抗拒這種降解）。Int基因產(chǎn)物使λDNA整合到宿主染色體上而溶原化Panti-Q的啟動產(chǎn)生了Q反義轉(zhuǎn)錄本，終止了裂解所需晚期基因的表達(dá)Cro對OR3的親和力比對OR2和OR1的親和力更強，它首先與3區(qū)結(jié)合。這個結(jié)合抑制了RNA聚合酶與PRM的結(jié)合，破壞了溶原維持的正負(fù)自調(diào)控系統(tǒng)Cro結(jié)合在1區(qū)或2區(qū)（約比CI與該區(qū)親和力低8倍）降低PL和PR的轉(zhuǎn)錄水平，降低早期基因(包括Cro自身)的表達(dá)水平Hfl：高頻溶源化，highfrequencyoflysogenization

★第44頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二它們之間的區(qū)別可歸結(jié)為：究竟是阻遏蛋白CI還是Cro將獲得兩個操縱基因的占用權(quán)。（6）溶原化還是裂解？建立溶原的起始活動是CI在OL1和OR1處的結(jié)合。第一個位點的結(jié)合將使另一個阻遏蛋白二聚體在OL2和OR2處的協(xié)同結(jié)合快速成功。這終止了Cro的表達(dá)及Cro與3區(qū)的結(jié)合機會，并開始經(jīng)由PRM進行阻遏蛋白的合成。進入裂解周期的起始活動是Cro在OR3處結(jié)合，阻止了溶原維持回路在PRM處的開始。接著，Cro必須與OR2或OR1，以及OL2或OL1結(jié)合，以降低早期基因的表達(dá)來停止合成CⅡ和CⅢ，已合成的CⅡ和CⅢ被降解，導(dǎo)致CI無法繼續(xù)合成。最初被合成的Q蛋白導(dǎo)致晚期基因表達(dá)（噬菌體外殼）細(xì)菌生長在豐富的培養(yǎng)基時蛋白酶活性強，CⅡ和CⅢ不能穩(wěn)定存在，所以λ噬菌體傾向于裂解；當(dāng)細(xì)胞饑餓時，它更傾向于進入溶原(CⅡ和CⅢ較穩(wěn)定)。當(dāng)溶源菌受紫外線或絲裂霉素C處理后，會發(fā)生SOS反應(yīng)，激活RecA蛋白，使CⅠ蛋白分解，可以進入裂解期第45頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二第46頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二int：整合酶基因，識別宿主細(xì)胞染色體DNA和噬菌體DNA上的att位點（PP’與BB’)

，并能催化二者的斷裂和再連接。att：附著位點，在宿主細(xì)胞DNA上稱為attB，在噬菌體DNA上稱為attP，兩者含有一段15bp的同源序列，重組酶可識別該序列而使噬菌體基因組插入到宿主的染色體DNA上。xis：切除酶基因。

int和xis基因產(chǎn)物共同作用，能使att位點發(fā)生重組（PB’與BP’)，并將原噬菌體基因組DNA從宿主染色體中切割下來，使λ噬菌體進入裂解過程。整合和切割都需要來自宿主的一種整合因子Hif協(xié)助（7）噬菌體的整合與割離★第47頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二Holliday連接結(jié)構(gòu)第48頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二2.2噬菌體載體有長度限制:(75%-105%)×48kb才能被有效包裝入蛋白外殼并形成清晰的噬菌斑，必需區(qū)長28Kb有相當(dāng)長的感染非必需序列，這些序列可以刪除，或用填補序列取代（保證總長>75%），>75%長度的限制也提供了一種正篩選方法）限制性酶切位點過多可插入的長片段DNA（長至20kb以上），且包裝的λ噬菌體感染大腸桿菌比質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌的效率高得多，凍藏后存活率高，非常適合于構(gòu)建cDNA文庫或基因組文庫。克隆操作要比質(zhì)粒載體復(fù)雜

2.2.1野生型噬菌體載體的一般特點2.2.2噬菌體載體的改造刪除多余限制性內(nèi)切酶位點中段非必需區(qū)被替換為某些報告基因或其它正篩選系統(tǒng)，以及和多克隆位點等

★★★第49頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二2.2.3噬菌體載體的類型插入型載體（如gt10等)替換型載體（如EMBL3等）插入型載體只能承受較小分子量（一般<10kb）的外源DNA片段的插入，廣泛應(yīng)用于cDNA及小片段DNA的克隆。而替換型載體則可承受較大分子量的外源DNA片段的插入，所以適用于克隆高等真核生物的染色體DNA空載體形成藍(lán)色噬菌斑，插入片段載體形成無色噬菌斑空載體形成渾濁的噬菌斑，插入片段載體形成清晰的噬菌斑Charonvector

卡隆載體★第50頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二Spi篩選

gam篩選

2.2.4其他篩選系統(tǒng)☆野生型λ噬菌體在帶有P2原噬菌體的溶源性E.coli中的生長會受到限制的表型，稱作Spi+（sensitivetoP2interference）。如果λ噬菌體缺少兩個參與重組的基因red和gam，則可以在P2溶源性E.coli中生長良好，并形成微小的噬菌斑，即Spi-。通過對λ噬菌體載體DNA上的red和gam基因的缺失或替換，可在P2噬菌體溶源性細(xì)菌中鑒別重組和非重組λ噬菌體。只有晚期的滾環(huán)復(fù)制所形成的線性多聚體λDNA能被有效包裝，gam基因是控制λ噬菌體從早期的雙向復(fù)制模式向晚期的滾環(huán)復(fù)制模式進行轉(zhuǎn)換的開關(guān)，因此gam-則不能大量形成線性多聚體λDNA，只能靠red或宿主的rec重組系統(tǒng)將環(huán)狀λDNA重組成多聚體（需要chi位點才能高效重組），然后包裝成噬菌體顆粒，形成微小的噬菌斑（沒有chi位點,crossoverhot-spotinstigator交換熱點激活區(qū)，只能形成極其微小的噬菌斑）.gam+的噬菌體可以形成清晰的大斑。第51頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二2.2.5噬菌體載體克隆一般過程★第52頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二2.2.6噬菌體載體的體外包裝如果用DNA直接轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞，效率較低:105個噬菌斑/gDNA用載體與外源片段連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)染：104~103個噬菌斑/gDNA如果包裝成噬菌體顆粒感染感受態(tài)細(xì)胞，則效率很高：高達(dá)107/gDNA，每個顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率幾乎為100%★第53頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二1.帶有互補的缺陷基因，誘導(dǎo)后不能裂解細(xì)胞（S基因缺陷），cI857。2.避免內(nèi)源噬菌體被包裝

采用刪除原噬菌體b2區(qū)而使att位點缺損,這樣原噬菌體不能從染色體上割離內(nèi)源噬菌體采用imm434，包裝采用，感染imm434溶源菌，可阻止內(nèi)源噬菌體形成噬菌斑，而帶有外源片段的噬菌體可以成斑

重組缺陷以避免內(nèi)源噬菌體與重組噬菌體之間發(fā)生重組對產(chǎn)生外殼蛋白大腸桿菌的要求：E-、S-D-,S-gene對兩種產(chǎn)生外殼蛋白內(nèi)源噬菌體的要求：434：噬菌體的近親434第54頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二2.3單鏈?zhǔn)删w載體及噬菌粒載體M13，f1,fd為大腸桿菌絲狀噬菌體，基因組為單鏈環(huán)狀DNA，長6.4Kb。M13噬菌體只感染帶有F性須大腸桿菌，但其DNA可轉(zhuǎn)染無性須的大腸桿菌2.3.1M13噬菌體載體★★第55頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二(1)M13的生活周期噬菌體顆粒中的DNA為+鏈，通過性須進入細(xì)胞以+鏈為模板合成-鏈，形成RFDNA（復(fù)制形式DNA).RFDNA進行數(shù)輪復(fù)制，+鏈被切開，以-鏈為模板進行滾環(huán)復(fù)制新的+鏈，并在復(fù)制一圈后切割下來、成環(huán)。新的+鏈環(huán)繼續(xù)變?yōu)镽FDNA，其數(shù)目達(dá)到200個拷貝，基因V蛋白同+鏈結(jié)合，使-鏈無法合成，此時只能產(chǎn)生大量+鏈環(huán)狀DNA單鏈鏈環(huán)狀DNA被包裝成新噬菌體并擠壓出細(xì)胞膜。宿主細(xì)胞不被裂解，只是生長速度變慢ReplicationFormDNA☆第56頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二第57頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二(2)M13載體特點無包裝限制制備及克隆操作方便可用于制備單鏈DNA一般插入了MCS，及標(biāo)記基因★

雖然只有500bp非必需區(qū)段（基因II和IV之間），但包裝限制方面優(yōu)于噬菌體，包裝長度可達(dá)基因組數(shù)倍。包裝長度越長越不穩(wěn)定，因此插入片段的長度有限，一般小于1.5Kb細(xì)胞內(nèi)有大量RFDNA,可以用提取質(zhì)粒的方法大量純化，進行酶切、連接等操作。重組好的DNA又能高效轉(zhuǎn)染宿主。帶有外源片段的M13載體，在宿主中復(fù)制后形成的子代噬菌體包裝單鏈DNA,因此可以制備大量單鏈DNA，用于Sanger測序或制備探針。（兩條鏈都能方便的制備單鏈）如lacZ的HindII片段（類似于肽），宿主必須為lacZM15突變株（缺第11-41個氨基酸殘基，無法形成四聚體），便于篩選重組DNA。（外源片段插入HindII片段中造成肽失活）.如果宿主為lacIq突變，則可表達(dá)超量阻遏蛋白，可以用IPTG進行誘導(dǎo)表達(dá)。（質(zhì)粒表達(dá)載體一般攜帶lacI基因來解決該問題）第58頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二lacZHindII片段M13載體示例第59頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二

為了克服M13噬菌體的缺點，開發(fā)了一類同時含有質(zhì)粒復(fù)制子和絲狀噬菌體復(fù)制起點的載體系列，稱為噬菌粒（phagemid）

兼有絲狀噬菌體和質(zhì)粒的特點：存在輔助噬菌體時：滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生單鏈DNA、包裝成噬菌體顆粒無輔助噬菌體時：質(zhì)粒復(fù)制子控制復(fù)制，可制備大量雙鏈DNA.分子量小，可穩(wěn)定容納長達(dá)10Kb外源片段，得到長的單鏈DNA,可省去外源片段從噬菌體載體轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒上的亞克隆過程?？寺∵^程：載體、DNA片段的體外酶切、連接轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞（藍(lán)白篩選）用輔助噬菌體感染含有重組噬菌粒的細(xì)胞收集噬菌體顆粒、制備單鏈DNA用于測序等后續(xù)研究2.3.2噬菌粒載體★第60頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二pBluescript噬菌粒載體藍(lán)白篩選bla基因體外轉(zhuǎn)錄功能第61頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二★第62頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二2.3.3M13展示載體噬菌體表面展示技術(shù)：在噬菌體顆粒表面表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)技術(shù)。第63頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二主要內(nèi)容1.細(xì)菌質(zhì)粒載體

定義，分類，復(fù)制機理與方式，不穩(wěn)定性與不相容性，可移動性報告基因，質(zhì)粒提取方法與原理2.噬菌體載體

噬菌體生活周期，主要調(diào)控蛋白的作用，載體特點及類型，克隆過程，體外包裝過程及注意事項M13生活周期，載體特點，噬菌粒

3.酵母細(xì)胞載體及大容量載體4.動、植物載體第64頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二3.酵母載體及大容量載體

3.1酵母載體3.2柯斯質(zhì)粒3.3人工染色體第65頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二3.1常用酵母載體酵母是研究真核生物DNA復(fù)制、重組、基因表達(dá)和調(diào)控的理想受體細(xì)胞，也是一種重要的工業(yè)微生物，因此需要開發(fā)適用于酵母的載體。酵母載體主要是質(zhì)粒載體：整合型載體（yeastintegerativeplasmid,YIp)

復(fù)制性載體（yeastreplicatingplasmid,YRp)

著絲粒載體（yeastcentromere-containingplasmid,YCp)

附加型載體（yeastepisomalplasmid,YEp)特點：具有被E.coli識別的復(fù)制子和相應(yīng)的標(biāo)記基因，可在其中復(fù)制并大量制備。含有在酵母中使用的標(biāo)記基因（與營養(yǎng)缺陷型宿主基因型互補）具有合適的限制性內(nèi)切酶位點，方便外源基因的插入?！锏?6頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二（1）整合型質(zhì)粒YIp

該類質(zhì)粒不能在酵母中自主復(fù)制，含有與酵母染色體同源的DNA區(qū)段，通過同源重組整合在酵母染色體上。轉(zhuǎn)化效率低：約10個/gDNA，轉(zhuǎn)化子非常穩(wěn)定，常用于遺傳分析。第67頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二（2）復(fù)制性載體YRp與著絲粒質(zhì)粒YCp酵母染色體總長為15,000kb,根據(jù)電鏡觀察結(jié)果預(yù)計有400個自主復(fù)制序列（ARS,autonomouslyreplicatingsequence)，該序列可用于構(gòu)建自主復(fù)制型質(zhì)粒。

轉(zhuǎn)化效率較高，104個/gDNA

拷貝數(shù)高（1~20），不易分配給子代細(xì)胞，質(zhì)粒分散不均勻轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定，質(zhì)粒容易丟失可整合到染色體中，與YIp整合過程相同若在YRp質(zhì)粒上加入酵母染色體的著絲粒序列（CEN)，則可增加質(zhì)粒的穩(wěn)定性（但拷貝數(shù)降低為1），這類質(zhì)粒為YCp，其行為類似染色體，在有絲分裂與減數(shù)分裂中可穩(wěn)定分配到子細(xì)胞。第68頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二（3)附加型載體YEp多數(shù)酵母品系中含有一種隱蔽性質(zhì)粒，稱為2m質(zhì)粒。該質(zhì)粒的復(fù)制系統(tǒng)可以用于構(gòu)建自主復(fù)制性的酵母質(zhì)粒。

轉(zhuǎn)化效率較高，105個/gDNA

拷貝數(shù)高(25~200)，轉(zhuǎn)化子比較穩(wěn)定易于同內(nèi)源性2m質(zhì)粒重組第69頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二載體類型存在方式所需DNA序列標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化頻率穩(wěn)定性

（菌落/μgDNA）無絲分裂有絲分裂

整合型整合與染色體DNAAprTcr<10+a+a

(YIp5)1-幾個拷貝同源URA3

附加體型自主復(fù)制2μ質(zhì)粒AprTcr103-105-b-(YEp13)多拷貝LEU2

復(fù)制型自主復(fù)制ARSAprTcr

103-104-b-(YRp7)多拷貝TRP1

著絲粒型染色體狀A(yù)RS,CENApr103-104+c+c(YCp19)通常單拷貝TRP1,URA3

線型染色體狀A(yù)RS，CENTRP1，HIS3103-104++(YLp21)通常單拷貝TEL

a.每次細(xì)胞分裂仍有約1%的載體DNA從染色體上脫落下來b.在選擇培養(yǎng)基中15-20代后，10-30%的轉(zhuǎn)化子丟失載體DNAc.無絲分裂時有3-14%轉(zhuǎn)化體丟失質(zhì)粒，有絲分裂時有3%轉(zhuǎn)化體質(zhì)粒不發(fā)生分離在選擇培養(yǎng)基上丟失質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體低于1%酵母質(zhì)粒的特征★第70頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二在染色體遺傳作圖、DNA文庫制備、大片段基因克隆等方面需要應(yīng)用比噬菌體容量更大的載體1978年由J.Collins和B.Bohn發(fā)展的柯斯質(zhì)粒載體可滿足上述需求噬菌體載體最大容量約23kb,實際一般<15kb3.2.柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒，cosmid,cossite-carryingplasmid,是一類人工構(gòu)建的含有噬菌體cos位點和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型質(zhì)粒?！锏?1頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二柯斯質(zhì)粒pHC79：由質(zhì)粒pBR322和噬菌體λ的cos位點的一段DNA構(gòu)成，全長4.3kb第72頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二具有噬菌體的特性可在體外包裝成噬菌體顆粒，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞后利用cos位點環(huán)化，采用質(zhì)粒復(fù)制子復(fù)制，無法在胞內(nèi)被包裝。具有質(zhì)粒載體的特性質(zhì)粒復(fù)制子和抗生素抗性基因高容量對于5kb大的柯斯質(zhì)粒，容量為30~45kb,適合于克隆大片段DNA分子具有與同源序列質(zhì)粒進行重組的能力

如果胞內(nèi)還存在含有柯斯質(zhì)粒同源片段的質(zhì)粒，很容易形成兩種質(zhì)粒的共合體（1）柯斯質(zhì)粒的特點★第73頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二（2）柯斯質(zhì)?？寺∵^程限制酶切割載體和外源片段兩種片段混合連接體外包裝感染宿主質(zhì)粒環(huán)化、復(fù)制★第74頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二大容量、低本底有效連接產(chǎn)物所占比例較少，使克隆效率較低切割后的片段可能含有多個柯斯載體而造成不穩(wěn)定可能在染色體作圖中給出錯誤結(jié)果優(yōu)缺點同噬菌體包裝原理：含有多個cos位點的多連體被末端酶割，只在兩個距離合適的cos位點處切割，相距過近（<37kb)或過遠(yuǎn)（>52kb)不切割。第75頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二（3）改良的柯斯克隆過程Ish-Horowicz和Burke方案H兩份等量柯斯載體分別單酶切（H/S)后去磷酸化,再單酶切（B）切膠分離純化左cos片段及右cos片段基因組DNA酶切處理、去磷酸化。左右cos片段和基因組片段混合連接體外包裝感染宿主細(xì)胞由于大大提高了有效連接產(chǎn)物的比例，克隆效率較高（>105/gDNA)左右cos片段收率低，操作程序繁瑣優(yōu)缺點☆第76頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二Bates和Swift方案雙cos位點的柯斯載體雙酶切（B&S)基因組DNA酶切處理、去磷酸化。載體酶切產(chǎn)物與基因組片段混合連接體外包裝感染宿主細(xì)胞第77頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二克隆位點兩端相向插入不同啟動子，可體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生插入片段的兩條鏈的轉(zhuǎn)錄本穿梭柯斯載體的構(gòu)建插入片段易于從載體上切割分離（４）柯斯載體的其它改良☆第78頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二3.3人工染色體載體根據(jù)染色體來源分為：

細(xì)菌人工染色體（BACs）

P1派生人工染色體（PACs）酵母人工染色體（YACs）哺乳動物人工染色體（MACs）人類游離人工染色體（HAECs）人工染色體為基因組圖譜制作、基因分離以及基因組序列分析提供了有用的工具★人工染色體：artificialchromosome,指人工構(gòu)建的含有天然染色體基本功能單位(包括復(fù)制起始點replicationorigin、著絲粒centromere和端粒telomere)的載體系統(tǒng)。第79頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二（1）細(xì)菌人工染色體和P1派生人工染色體（BACsand

PACs)BAC和PAC是用于原核生物大腸桿菌內(nèi)的人工染色體。BAC是以F因子為基礎(chǔ)構(gòu)建的環(huán)形質(zhì)粒，容量為～300kbPAC則以P1噬菌體(P1phage)為基礎(chǔ)構(gòu)建的環(huán)形質(zhì)粒，容量為130-150kb。它們不是嚴(yán)格意義上的人工染色體，因為它們不含著絲粒和端粒?！锏?0頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二一般結(jié)構(gòu)：攜帶一個抗生素抗性基因、來源于F因子的嚴(yán)謹(jǐn)型控制復(fù)制子oriS、一個易于DNA復(fù)制的由ATP驅(qū)動的解旋酶repE基因以及三個確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因（parA,parB,和parC）拷貝數(shù)：BAC載體的低拷貝性可以避免嵌合體的產(chǎn)生，減小外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對宿主細(xì)胞的毒副作用?？寺∧芰Γ捍蠖鄶?shù)BAC文庫中克隆的平均大小約120kb，個別的BAC重組子中含有的基因組DNA可達(dá)300kb

BACs

第81頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二第82頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二

1.易于用電擊法轉(zhuǎn)化E.coli(轉(zhuǎn)化效率比轉(zhuǎn)化酵母高10-100倍)；

2.超螺旋環(huán)狀載體，易于操作；（YAC為線狀）

3.F質(zhì)粒的復(fù)制系統(tǒng)控制復(fù)制，復(fù)制穩(wěn)定，1~2個拷貝，保證分配和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，很少發(fā)生體內(nèi)重排。

4.宿主E.coli可以構(gòu)建重組缺陷株，進一步提高BAC的穩(wěn)定性（酵母細(xì)胞無法構(gòu)建重組缺陷株）BAC的優(yōu)點：第83頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二基于P1噬菌體構(gòu)建的，與柯斯載體工作原理比較相似的一種高容量載體，含有很多P1噬菌體來源的順式作用元件，能容納70～100kb大小的基因組DNA片段。含有基因組和載體序列的線狀重組分子在體外被組裝到P1噬菌體顆粒中，包裝容量可達(dá)115kb。將重組P1噬菌體顆粒感染表達(dá)Cre重組酶的大腸桿菌，線狀DNA分子進入宿主后通過載體上兩個loxP位點之間的重組而發(fā)生環(huán)化。載體攜帶kan基因、克隆篩選系統(tǒng)（sacB系統(tǒng)）、以及一個能夠使每個細(xì)胞都含有約一個拷貝環(huán)狀重組質(zhì)粒的P1質(zhì)粒復(fù)制子。另一個P1復(fù)制子（P1裂解性復(fù)制子）在可誘導(dǎo)的lac啟動子（IPTG誘導(dǎo)）控制下，用于DNA分離前質(zhì)粒的擴增。P1噬菌體載體（BacteriophageP1vectors）第84頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二P1噬菌體載體克隆過程類似于cosmid：載體酶切、去磷酸化后產(chǎn)生長臂與短臂長、短臂同酶切去磷酸化的插入片段混合連接，形成多連體分子Pacase識別pac位點進行切割、體外包裝感染cre+宿主,在胞內(nèi)環(huán)化第85頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二2loxPsequencespacsequencepackagingP1phageparticleskanr:kanamycinresistencegeneP1plasmid-replicon:circularDNA(~1copy/cell)P1lyticreplicon:controlledbylacpromoter–forplasmidamplificationpriortoDNAisolation(controlledhighcopy)sacB:positiveselectionforcloningforeignDNA(BamHI-site)betweenSP6&T7promoter第86頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二在連接過程中產(chǎn)生的環(huán)狀重組PAC也可用電穿孔的方法導(dǎo)入大腸桿菌中，并且維持單拷貝片段范圍更寬60kb～150kbP1人工染色體（P1artificialchromosomes）sacB,positiveselectionmarkerP1plasmidlyticrepliconNOpackagingintoP1phageparticlesTransformationbyelectroporationNOcre-loxPsystemforcircularisation,circularisationusingstandardinvitroligation第87頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二（2）酵母人工染色體（YACs)YAC載體是利用釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）染色體的復(fù)制元件構(gòu)建的載體，其工作環(huán)境也是在釀酒酵母中（2.1）YAC人工染色體載體的元件YAC載體為能夠滿足自主復(fù)制、染色體在子代細(xì)胞間的分離及保持染色體穩(wěn)定的需要，必須含有以下元件：端粒重復(fù)序列（telomericrepeat，TEL）：定位于染色體末端一段序列，用于保護線狀的DNA不被胞內(nèi)的核酸酶降解，以形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。著絲粒（centromere，CEN）：有絲分裂過程中紡錘絲的結(jié)合位點，使染色體在分裂過程中能正確分配到子細(xì)胞中。在YAC中起到保證一個細(xì)胞內(nèi)只有一個人工染色體的作用。如pYAC4使用的是酵母第四條染色體的著絲粒。自主復(fù)制序列（autonomouslyreplicationsequences，ARS）:

一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA進行雙向復(fù)制所必須的信號。第88頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二YAC載體主要是用來構(gòu)建大片段DNA文庫，特別用來構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫，并不用作常規(guī)的基因克隆。用BamHⅠ切割成線狀后，就形成了一個微型酵母染色體，包含染色體復(fù)制的必要順式元件。這些元件在酵母菌中可以驅(qū)動染色體的復(fù)制和分配，從而決定這個微型染色體可以攜帶酵母染色體大小的DNA片段。對于BamHⅠ切割后形成的微型酵母染色體，當(dāng)用EcoRⅠ或SmaⅠ切割抑制基因sup4內(nèi)部的位點后形成染色體的兩條臂，與外源大片段DNA在該切點相連就形成一個大型人工酵母染色體，通過轉(zhuǎn)化進入到酵母菌后可象染色體一樣復(fù)制，并隨細(xì)胞分裂分配到子細(xì)胞中去，達(dá)到克隆大片段DNA的目的。裝載了外源DNA片段的重組子導(dǎo)致抑制基因sup4插入失活，從而形成紅色菌落；而載體自身連接后轉(zhuǎn)入到酵母細(xì)胞后形成白色菌落。這些紅色的裝載了不同外源DNA片段的重組酵母菌菌落的群體就構(gòu)成了YAC文庫。

YAC文庫裝載的DNA片段的大小一般可達(dá)200-500kb，有的可達(dá)1Mb以上，甚至達(dá)到2Mb。（2.2）YAC載體的工作原理★第89頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因帶有一個赭石突變ade2-1（氨基酸密碼子變成終止密碼子UAA）。帶有這個突變的酵母菌在基本培養(yǎng)基上形成紅色菌落，當(dāng)帶有赭石突變抑制基因sup4（Trp-tRNA的反密碼子CUA突變成UUA)的載體存在于細(xì)胞中時，可抑制ade2-1基因的突變效應(yīng)，形成正常的白色菌落。利用這一菌落顏色轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象，可用于篩選載體中含有外源DNA片段插入的重組子。

第90頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二宿主菌為營養(yǎng)缺陷型★第91頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二缺點：在YAC載體的插入片段會出現(xiàn)缺失（deletion）和基因重排（rearrangement）的現(xiàn)象。容易形成嵌合體。嵌合就是在單個YAC中的插入片段由2個或多個的獨立基因組片段連接組成。嵌合克隆約占總克隆的5%～50%。

YAC染色體與宿主細(xì)胞的染色體大小相近，影響了YAC載體的廣泛應(yīng)用。YAC染色體一旦進入釀酒酵母細(xì)胞，由于其大小與內(nèi)源的染色體的大小相近，就很難從中分離出來，不利于進一步分析。優(yōu)點：酵母細(xì)胞比大腸桿菌對不穩(wěn)定的、重復(fù)的和極端的DNA有更強的可容忍性。由于容量很大，YAC在功能基因和基因組研究中是一個非常有用的工具。由于高等真核生物的基因大多數(shù)是多外顯子結(jié)構(gòu)并且有長長的內(nèi)含子，大型基因組片段可通過YAC載體轉(zhuǎn)移到動物或動物細(xì)胞系中，進行功能研究。（2.3）YAC載體的優(yōu)缺點★第92頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二哺乳動物人工染色體（MAC，mammalartificialchromosomes

）

哺乳動物人工染色體指從哺乳動物細(xì)胞中分離出復(fù)制起始區(qū)、端粒以及著絲粒構(gòu)建而成的克隆載體。它可以克隆大于1000kb的外源DNA片段。

應(yīng)用領(lǐng)域

（1）有絲分裂和減數(shù)分裂對DNA片段大小的定量分析（2）研究哺乳動物細(xì)胞中染色體功能。（3）對復(fù)雜的基因做功能分析。（4）用于體細(xì)胞基因治療?！畹?3頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二人類游離人工染色體（HAEC）人類游離人工染色體（HAEC）是基于人類EB病毒（非洲淋巴瘤病毒）而構(gòu)建的環(huán)形DNA，含有EB病毒的復(fù)制原點(oriP)和潮霉素抗性基因。能以環(huán)形小染色體形式復(fù)制，并在有絲分裂中保持穩(wěn)定。HAEC可能會成為基因治療的重要載體?！畹?4頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二第95頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二主要內(nèi)容1.細(xì)菌質(zhì)粒載體

定義，分類，復(fù)制機理與方式，不穩(wěn)定性與不相容性，可移動性報告基因，質(zhì)粒提取方法與原理2.噬菌體載體

噬菌體生活周期，主要調(diào)控蛋白的作用，載體特點及類型，克隆過程，體外包裝過程及注意事項M13生活周期，載體特點，噬菌粒

3.酵母細(xì)胞載體及大容量載體

整合型，復(fù)制型，著絲粒型，附加型，COSMID，人工染色體（BAC,PAC,YAC)4.動、植物載體第96頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二4.動、植物基因工程載體4.1適用于動物的基因工程載體桿狀病毒載體

SV40病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體痘苗病毒載體第97頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二(1)桿狀病毒載體桿狀病毒為雙鏈環(huán)狀DNA病毒，基因組大小為80-220kb，其宿主為節(jié)肢動物，特別易感染昆蟲。適宜表達(dá)外源基因的桿狀病毒載體：真桿狀病毒亞科的核型多角體病毒屬:NPV（NuclearPolyhedrosisVirus)其中AcNPV（苜蓿銀蚊夜蛾NPV）的研究和應(yīng)用最多?！锏?8頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二生理周期：感染細(xì)胞，復(fù)制DNA進入感染早期，胞內(nèi)包裝成非閉合形式的病毒顆粒，出芽方式釋放；感染后期合成大量多角體蛋白，病毒顆粒被多角體蛋白包埋，形成病毒包涵體（閉合病毒），裂解細(xì)胞方式釋放。病毒包涵體對不利環(huán)境的耐受性更強第99頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二

多角體蛋白基因為非必需基因表達(dá)水平非常高（可達(dá)總蛋白的50%)

閉合病毒和非閉合病毒感染細(xì)胞后形成的空斑不同因此可以根據(jù)多角體蛋白的特點對病毒基因組進行改造，構(gòu)建表達(dá)載體：

直接在多角體蛋白基因中設(shè)計多克隆位點，插入外源基因：難度大構(gòu)建輔助質(zhì)粒，利用同源重組將輔助質(zhì)粒上外源基因插入AcNPV基因組的多角體蛋白基因中例如：利用pUC18，插入多角體蛋白基因，然后再將外源基因插入其中構(gòu)建輔助質(zhì)粒。AcNPV環(huán)狀基因組可在多角體蛋白基因中間切開，線性DNA感染性很低，從而降低空載體感染的幾率同源重組后的病毒無法形成包涵體，而空病毒載體可形成包涵體，通過觀察空斑平板上的形態(tài)進行篩選缺點：由于空病毒載體在感染早期不合成多角體蛋白，造成假陽性較多?？寺”磉_(dá)策略★第100頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二其他方案：AcNPV中多角體蛋白基因用lacZ替換，然后切割lacZ線性化病毒DNA，輔助質(zhì)粒也連上lacZ，并在lacZ中插入外源片段。構(gòu)建輔助質(zhì)粒AcNPV基因組切去多角體蛋白基因及其下游復(fù)制必需基因改進方案：輔助質(zhì)粒和線性化的病毒DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，通過同源重組使病毒DNA環(huán)化,只有發(fā)生重組的病毒被復(fù)活，重新獲得復(fù)制能力?！锏?01頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二桿狀病毒/昆蟲表達(dá)體系的特點：利用了病毒的強啟動子，蛋白表達(dá)水平高表達(dá)真核基因時產(chǎn)物活性高，蛋白質(zhì)能進行正確的折疊可以進行翻譯后的糖基化，一些治療蛋白表達(dá)后可以部分糖基化，有一定的保真度。昆蟲細(xì)胞具有很強的蛋白分泌能力，表達(dá)的重組蛋白可以分泌到胞外載體容納大片段的能力強，適合克隆表達(dá)大片段外源基因安全性好，桿狀病毒不感染脊椎動物，適于表達(dá)毒性蛋白或癌基因缺點：糖基化作用不完全，模式也和高等真核生物有區(qū)別★第102頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二(2)SV40載體SV40病毒:猿猴空泡病毒40（SimianVacuolatingvirus40）,是一種哺乳動物病毒，基因組為5.2kb的環(huán)狀雙鏈DNA。受納細(xì)胞：猿猴細(xì)胞，裂解釋放病毒顆粒非受納細(xì)胞：小鼠細(xì)胞，整合入宿主基因組（細(xì)胞被轉(zhuǎn)化），不能復(fù)制、包裝成病毒顆粒半受納細(xì)胞：人體細(xì)胞，部分細(xì)胞會裂解，極少數(shù)細(xì)胞被轉(zhuǎn)化。VP1、VP2、VP3為病毒衣殼蛋白T抗原和宿主細(xì)胞某些因子激活病毒復(fù)制基因組復(fù)制起點附近有一個增強子，主要功能是促進病毒DNA發(fā)生有效的早期轉(zhuǎn)錄第103頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二病毒的部分DNA序列被除去，用外源DNA取代，但根據(jù)取代序列的不同分為早期區(qū)段取代載體和晚期區(qū)段取代載體，克隆能力有限，約2.5kb為了補充被取代病毒DNA的功能，必需使用互補的輔助病毒，以便重組病毒能被正常包裝。

例如：使用溫度敏感變異病毒tsA（41℃無法合成T抗原）作為輔助病毒提供衣殼蛋白，采用晚期區(qū)段取代載體（提供T抗原），只有兩種病毒共感染的細(xì)胞才能形成空斑。對于早期區(qū)段取代載體，可以使用染色體上整合有T-抗原基因的COS細(xì)胞系做宿主,不再需要輔助病毒。SV40載體的類型用復(fù)制起點有缺陷的SV40病毒侵染的猴細(xì)胞株CV-1得到的。所以稱COS（CV-1，Origin,SV40）COS細(xì)胞★SV40存在嚴(yán)格的包裝限制，并且?guī)缀鯖]有非必需基因，只能基于該病毒構(gòu)建取代性載體：第104頁，共132頁，2023年，2月20日，星期二用病毒顆粒重新高效感染細(xì)胞晚期區(qū)段取代載體的克隆過程：第105頁，