非細胞微生物病毒

非細胞微生物病毒第1頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二第四章非細胞微生物—病毒acellularorganization－Viruses

第一節(jié)概述第二節(jié)病毒的形態(tài)結構第三節(jié)病毒的復制第四節(jié)病毒的檢出與定量第五節(jié)病毒與實踐第2頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)概述一、病毒的發(fā)現(xiàn)和研究歷史1886年，A.Mayer發(fā)現(xiàn)具有傳染性的煙草花葉病；1892年，D.Ivanovsky煙草花葉病病原體能通過細菌濾器：一種能通過細菌濾器的”細菌毒素”或極小的細菌第3頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二1898年，MWBeijerinck對煙草花葉病病原體的研究結果：

能通過細菌濾器；可被乙醇沉淀而不失去其感染性，能在瓊脂凝膠中擴散；用培養(yǎng)細菌的方法不能被培養(yǎng)出來，推測只能在植物活細胞中生活；比細菌小的具有傳染性的活的流質(zhì)（contagiumvivumfluidum）第4頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二1900年前后，包括口蹄疫（footandmouthdisease）(Loeffer和Frosch發(fā)現(xiàn)，1989年)在內(nèi)的多種動植物疾病病原體的濾過性特性被證明。filterableviruses（濾過性病毒）viruses（病毒）FWTwort（1915年）、Fd’Herelle（1917年），分別發(fā)現(xiàn)細菌（Shigelladysenteriae）病毒bacteriophages噬菌體（phage）1935年，WMStanley首次提純并結晶了煙草花葉病毒

(tobaccomosaicvirus,TMV)；

Bawden等證明煙草花葉病毒的本質(zhì)為核蛋白；1940年，Kausche首先用電鏡觀察到煙草花葉病毒顆粒；第5頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二極大地豐富了現(xiàn)代生物學（微生物學、分子生物學、分子遺傳學）的理論與技術；病毒學（viruology）：研究病毒（virus）的本質(zhì)及其與宿主的相互作用的科學，是微生物學的重要分支學科。有效地控制和消滅人及有益生物的病毒病害；利用病毒對有害生物、特別是害蟲進行生物防治；發(fā)展以基因工程為中心的生物高新技術產(chǎn)業(yè)；第6頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二二、病毒的特點和定義1、特點1）不具有細胞結構，具有一般化學大分子的特征。2）一種病毒的毒粒內(nèi)只含有一種核酸，DNA或者RNA。3）大部分病毒沒有酶或酶系極不完全，不含催化能量代謝的酶，不能進行獨立的代謝作用。4）嚴格的活細胞內(nèi)寄生，沒有自身的核糖體，沒有個體生長，也不進行二均分裂，必須依賴宿主細胞進行自身的核酸復制，形成子代。5）個體微小，在電子顯微鏡下才能看見。6）對大多數(shù)抗生素不敏感，對干擾素敏感。第7頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二病毒是一類既具有化學大分子屬性，又具有生物體基本特征；既具有細胞外的感染性顆粒形式，又具有細胞內(nèi)的繁殖性基因形式的獨特生物類群。超顯微的、沒有細胞結構的、專性活細胞內(nèi)寄生的實體第8頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二細菌與病毒性質(zhì)的比較第9頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二2、定義病毒為具有獨立于其宿主的進化史的絕對細胞內(nèi)寄生物，它的DNA或RNA基因組被其所編碼的蛋白質(zhì)殼體化（encapsidation）。

（Fields等，1990年）非細胞生物（真）病毒：至少含核酸和蛋白質(zhì)二種組分亞病毒類病毒：只含具侵染性的RNA組分衛(wèi)星RNA：只含有不具侵染性的RNA組分朊病毒：只含蛋白質(zhì)（euvirus）（subvirus)第10頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二三、病毒的宿主范圍病毒幾乎可以感染所有的細胞生物，并具有宿主特異性噬菌體（phage）、植物病毒（plantviruses）動物病毒（animalviruses）第11頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)病毒的形態(tài)結構病毒是一類既具有化學大分子屬性，又具有生物體基本特征；既具有細胞外的感染性顆粒形式，又具有細胞內(nèi)的繁殖性基因形式的獨特生物類群。毒粒(virion)[病毒顆粒(virusparticle)]：

病毒的細胞外顆粒形式，也是病毒的感染性形式。一團能夠自主復制的遺傳物質(zhì)保護遺傳物質(zhì)免遭環(huán)境破壞，并作為將遺傳物質(zhì)從一個宿主細胞傳遞給另一個宿主細胞的載體。蛋白質(zhì)外殼

包膜第12頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二一、毒粒的形態(tài)結構1、病毒的大小和形狀個體小，必需在電鏡下觀察；不同病毒的毒粒大小差別很大；毒粒的形狀大致可分球形顆粒(或稱擬球形顆粒)、桿狀顆粒和復雜形狀顆粒（如蝌蚪狀，卵形）等少數(shù)幾類。第13頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二病毒的形狀第14頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二病毒的形體微小，只能以nm計量，一般為10~300nm。

各種毒粒的大小、形態(tài)差異很大第15頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二二、毒粒的化學組成毒粒（化學組成）核酸；蛋白質(zhì)；脂類；碳水化合物；基本化學組成第16頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二二、毒粒的化學組成1、病毒的核酸

核酸是病毒的遺傳物質(zhì)；一種病毒的毒粒只含有一種核酸：DNA或是RNA；病毒核酸單鏈DNA（ssDNA）；雙鏈DNA（dsDNA）；單鏈RNA（ssRNA）；雙鏈RNA（dsRNA）；第17頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二病毒的核酸類型動物病毒含DNA雙鏈牛痘病毒單鏈小鼠細小病毒含RNA雙鏈呼腸弧病毒單鏈脊髓灰質(zhì)炎病毒植物病毒含RNA雙鏈水稻矮縮病毒單鏈煙草花葉病毒含DNA雙鏈花椰菜花葉病毒細菌病毒含DNA雙鏈大腸桿菌T系噬菌體單鏈大腸桿菌φX174，M13含RNA單鏈大腸桿菌f2噬菌體(5群)第18頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二核酸功能：核酸功能儲存病毒的遺傳信息控制病毒的遺傳變異控制病毒的增殖控制病毒對宿主的感染性第19頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二2、病毒的蛋白質(zhì)病毒蛋白質(zhì)結構蛋白非結構蛋白病毒基因組編碼的，在病毒復制過程中產(chǎn)生并具有一定功能，但并不結合于毒粒中的蛋白質(zhì)。構成一個形態(tài)成熟的有感染性的病毒顆粒所必需的蛋白質(zhì)殼體蛋白；基質(zhì)蛋白；囊膜蛋白；酶蛋白；第20頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二病毒結構蛋白的主要生理功能：1）構成蛋白質(zhì)外殼，保護病毒核酸破壞；2）決定病毒感染的特異性；3）決定病毒的抗原性，能刺激機體產(chǎn)生相應的抗體；4）構成毒粒酶，或參與病毒對宿主細胞的入侵（如T4噬菌體的溶菌酶等），或參與病毒復制過程中所需要病毒大分子的合成（如逆轉(zhuǎn)錄酶等）；第21頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二3.其他成分：較復雜病毒中還含有:

脂類：有些病毒包膜中含有來源于宿主細胞的脂類化合物，其中50-60%為磷脂，余為膽固醇。多糖：以糖脂、糖蛋白的形式存在。有的病毒還含胺類（丁二胺，亞精胺等）、金屬離子等，它們是病毒裝配時從環(huán)境中獲得的不恒定成分。第22頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二三、毒粒的結構毒粒的結構衣殼粒(Capsomere)衣殼(Capsid)核酸核殼（nucleocapsid）包膜(envelope)刺突(spike)由一種或幾種多肽鏈折疊而成的蛋白質(zhì)亞單位。病毒的蛋白質(zhì)殼體和病毒核酸（核心）構成的復合物，又稱核衣殼。包膜或核衣殼上的突起。

第23頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二

第24頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二殼體結構類型螺旋對稱（helicalsymmetry）殼體二十面體對稱(icosahedralsymmetry)殼體復合對稱(complexsymmetry)結構第25頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二亞基有規(guī)律地沿著中心軸（核酸）呈螺旋排列，進而形成高度有序、對稱的穩(wěn)定結構。此形狀多為RNA病毒，具螺旋對稱的動物病毒多有包膜。1.螺旋對稱（helicalsymmetry）殼體：第26頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二有包膜的螺旋毒粒裸露的螺旋毒粒；第27頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二2.二十面體對稱(icosahedralsymmetry)殼體：1)球或近球形，沒有包膜，直徑70-80nm。

2)高倍電鏡下為多面體,它有12個角，20個面，30條棱。呈5（角）：3（面）：2（線）軸對稱結構。3)衣殼由252個衣殼粒組成，每個衣殼粒通常是由5個或6個蛋白質(zhì)亞基聚集形成。有12個稱做五鄰體（penton）的衣殼粒（分子量各為70000Da），位于12個角上。每個五鄰體上突出一根末端帶有頂球的蛋白纖維，稱為觸須樣纖維（也叫刺突）。有240個六鄰體（hexon）（分子量各為120000Da）位于均勻分布在20個面上。第28頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二構成對稱結構殼體的第二種方式是蛋白質(zhì)亞基圍繞具立方對稱的正多面體的角或邊排列，進而形成一個封閉的蛋白質(zhì)的鞘。第29頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二3.復合對稱(complexsymmetry)大腸桿菌的T4噬菌體是由橢圓形的二十面體頭部和螺旋對稱的尾部組合而成，是病毒中復合對稱的代表。第30頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二有尾噬菌體（tailedphage），其殼體由頭部和尾部組成。包裝有病毒核酸的頭部通常呈二十面體對稱，尾部呈螺旋對稱。第31頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二第三節(jié)病毒的復制病毒的特點：嚴格細胞內(nèi)寄生物，只能在活細胞內(nèi)繁殖。病毒感染敏感宿主細胞后，病毒核酸進入細胞，通過其復制與表達產(chǎn)生子代病毒基因組和新的蛋白質(zhì)，然后由這些新合成的病毒組分裝配（assembly）成子代毒粒，并以一定方式釋放到細胞外。病毒的這種特殊繁殖方式稱做復制（replication）。病毒的復制：第32頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二一、病毒的復制周期復制周期（replicativecircle）或稱復制循環(huán)：自病毒吸附于細胞開始，到子代病毒從感染細胞釋放到細胞外的病毒復制過程。①吸附(absorption)；②侵入(penetration)；③復制(replication)；④裝配(assembly)（成熟）；⑤釋放(release)；第33頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二烈性噬菌體的繁殖過程第34頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二①吸附：噬菌體和宿主細胞上的特異性吸附部位進行特異性結合，噬菌體以尾絲牢固吸附在受體上后，靠刺突“釘”在細胞表面上。②侵入：核酸注入細胞的過程。噬菌體尾部所含酶類物質(zhì)可使細胞壁產(chǎn)生一些小孔，然后尾鞘收縮，尾髓刺入細胞壁，并將核酸注入細胞內(nèi)，蛋白質(zhì)外殼留在細胞外。③復制：包括核酸的復制和蛋白質(zhì)合成。噬菌體核酸進入宿主細胞后，會控制宿主細胞的合成系統(tǒng)，然后以噬菌體核酸中的指令合成噬菌體所需的核酸和蛋白質(zhì)。第35頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二④裝配：主要步驟有：DNA分子的縮合——通過衣殼包裹DNA而形成頭部——尾絲及尾部的其它部件獨立裝配完成——頭部與尾部相結合——最后裝上尾絲，至此，一個個成熟的形狀、大小相同的噬菌體裝配完成。第36頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二⑤釋放：方式：裂解：多以裂解細胞的方式釋放。分泌：噬菌體穿出細胞，細胞并不裂解。通常情況下，一個噬菌體通過上述五個過程能合成100——300個噬菌體。烈性噬菌體的這種生長繁殖方式也稱為一步生長，第37頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二二、烈性噬菌體與一步生長曲線烈性噬菌體(virulentphage):能在宿主細胞內(nèi)增殖，產(chǎn)生大量子噬菌體并引起細菌裂解的噬菌體烈性噬菌體的這種生長方式稱一步生長。第38頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二一步生長曲線（onestepgrowthcurve）1939年，MaxDelbruck&EmoryEllis：E.coli/bacteriopage1、用噬菌體的稀釋液感染高濃度的宿主細胞；2、數(shù)分鐘后，加入抗噬菌體的抗血清；3、將上述混合物大量稀釋，終止抗血清的作用和防止新釋放的噬菌體感染其它細胞；4、保溫培養(yǎng)并定期檢測培養(yǎng)物中的噬菌體效價；5、以感染時間為橫坐標，病毒的感染效價為縱坐標，繪制出病毒特征性的繁殖曲線；概念：經(jīng)過一步生長實驗后,得到以培養(yǎng)時間為橫坐標,以噬菌斑數(shù)為縱坐標繪制成的有潛伏期、裂解期和穩(wěn)定期的特征性曲線。第39頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二

實驗過程:敏感菌10ml+Phage1ml混勻，5min,使之吸附離心或用抗phage血清處理,去除過量phage高倍稀釋,吸附phage的菌懸液(避免多次吸附)37℃培養(yǎng),定時取樣樣品中加入氯仿裂解細胞24-48h裂解液加入敏感菌液中適當稀釋混合液涂布于瓊脂培養(yǎng)基上計數(shù)噬菌斑人為裂解處理（每5min）第40頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二一步生長曲線（onestepgrowthcurve）噬菌體復制（繁殖）的三個階段：1、吸附期(adsorptionperiod)；游離的噬菌體吸附到宿主細胞2、潛伏期(latentperiod)；從噬菌體吸附到細胞到釋放出新噬菌體的最短時期3、裂解期(lysisperiod)；隨著菌體不斷破裂，新噬菌體數(shù)目增加，直到最高值

平穩(wěn)期（plateauphase）第41頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二潛伏期（latentperiod）：毒粒吸附于細胞到受染細胞釋放出子代毒粒所需要的最短時間。噬菌體幾分鐘，動物病毒與植物病毒以小時或天計算。裂解量（burstsize)：每個受染細胞所產(chǎn)生的子代病毒顆粒的平均數(shù)目。等于潛伏期受染細胞的數(shù)目除以穩(wěn)定期受染細胞所釋放的全部子代病毒的數(shù)目，噬菌體的裂解量一般為幾十到幾百，動植物病毒幾百到上萬個。一步生長曲線的特征性數(shù)據(jù)第42頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二三、溫和噬菌體和溶源性溫和噬菌體(temperatephage)或稱溶源性噬菌體（lysogenicphage）：侵染細菌后不產(chǎn)生子噬菌體和引起細菌裂解的噬菌體。溶源性(lysogeny)：溫和噬菌體侵染敏感細菌后不裂解它們，而與細菌共存的特性。前噬菌體(prophage)：整合于細菌染色體或以質(zhì)粒形成存在的溫和噬菌體基因組稱做原噬菌體。（一）溫和噬菌體第43頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二第44頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二溫和噬菌體的溶源性反應：在原噬菌體階段，噬菌體的復制被抑制，宿主細胞正常地生長繁殖，而噬菌體基因組與宿主細菌染色體同步復制，并隨細胞分裂而傳遞給子代細胞。第45頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二（二）溶源性細菌及其檢出溶源性感染對細胞的影響：溶源菌的特性：1.溶源性細菌（lysogenicbacteria）

細胞中含有以原噬菌體狀態(tài)存在的溫和噬菌體基因組的細菌稱做溶源性細菌。(2)裂解：自發(fā)裂解(spontaneouslysis)

誘發(fā)裂解(inductivelysis)；(1)具有遺傳的、產(chǎn)生前噬菌體的能力；(3)復愈；(4)免疫性(5)溶源轉(zhuǎn)變(6)局限性轉(zhuǎn)導第46頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二2.溶源性細菌的檢出：培養(yǎng)UV輻射（誘導裂解）復制培養(yǎng)（進入裂解周期）離心取上清與敏感菌倒平板菌落周圍出現(xiàn)透明圈即為溶源性細菌第47頁，共53頁，2023年，2月20日，星期二第48頁，共53頁，2023年，2月20日，星期