發(fā)育毒性研究中動(dòng)物胚胎肢芽培養(yǎng)技術(shù)的運(yùn)用,發(fā)育生物學(xué)論文

發(fā)育毒性研究中動(dòng)物胚胎肢芽培養(yǎng)技術(shù)的運(yùn)用,發(fā)育生物學(xué)論文隨著當(dāng)代科學(xué)技術(shù)和工業(yè)生產(chǎn)的迅速發(fā)展以及生活水平的提高，人類所面臨的各種有害化學(xué)物質(zhì)與新合成的化學(xué)物質(zhì)、居室內(nèi)外的空氣污染物及一些生物、物理因素等對(duì)人體有害的因子越來(lái)越多。因而檢測(cè)相關(guān)因子對(duì)生物個(gè)體潛在的遺傳毒性及胚胎發(fā)育毒性的技術(shù)和方式方法也日益豐富。由于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的胚胎發(fā)育時(shí)期比成年動(dòng)物對(duì)環(huán)境中有害因素的影響更敏感，故常以檢測(cè)胚胎發(fā)育毒性作為評(píng)價(jià)和篩檢外源性化學(xué)、生物等因素的主要方式方法之一，同時(shí)可以討論其致畸作用機(jī)理、染毒劑量、時(shí)間及胚齡與致畸效應(yīng)之間的量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系等，為各類物質(zhì)的發(fā)育毒性提供安全性評(píng)價(jià)根據(jù)。動(dòng)物胚胎的器官構(gòu)成期是由胚胎細(xì)胞快速分裂、增殖、分化、運(yùn)動(dòng)、聚合并構(gòu)成組織器官原形的經(jīng)過(guò)，假如進(jìn)行體外器官培養(yǎng)則能避免母體內(nèi)多種因素的干擾，且能保持其體內(nèi)所具有的細(xì)胞間互相作用及形態(tài)特征和功能，它所經(jīng)歷的器官發(fā)生階段與體內(nèi)表現(xiàn)有一致性，所以生殖毒理及胚胎發(fā)育毒理的研究大多采用大鼠與小鼠鼠胚、雞胚、兔胚、斑馬魚(yú)胚等多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎材料進(jìn)行體外全胚胎培養(yǎng)技術(shù)、或體外胚胎器官培養(yǎng)技術(shù)〔如胚胎肢芽、上頜發(fā)育等〕以及胚胎原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)〔如肢芽細(xì)胞、中腦細(xì)胞、海馬細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞〕等，但是當(dāng)下最常用仍為大鼠與小鼠的胚胎肢芽培養(yǎng)模型[1],由于此試驗(yàn)方式方法中所選擇的胚胎肢芽細(xì)胞正處于分化前期，所以只要對(duì)動(dòng)物胚胎增殖分化有毒性作用的外來(lái)化合物，都有可能抑制胚胎肢芽的構(gòu)成及軟骨的發(fā)生。因而，肢芽器官及肢芽細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，既能夠作為化學(xué)致畸物的安全評(píng)價(jià)系統(tǒng)，又可應(yīng)用于胚胎發(fā)育毒性機(jī)理的研究。本文就近15年來(lái)我們國(guó)家肢芽器官與肢芽細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用及進(jìn)展作一綜述。1動(dòng)物胚胎肢芽體外培養(yǎng)常用的技術(shù)當(dāng)下動(dòng)物肢芽體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方式方法大多項(xiàng)選擇擇以小鼠、大鼠胚胎的肢芽為體外培養(yǎng)材料，常采用兩種的技術(shù)方式方法:第一，以肢芽整體器官在體外培養(yǎng)為主的試驗(yàn)方式方法，稱肢芽器官培養(yǎng)法。是指應(yīng)用顯微解剖技術(shù)從動(dòng)物體內(nèi)分離出整體肢芽器官，在體外實(shí)驗(yàn)室里盡可能模擬體內(nèi)的生存條件進(jìn)行培養(yǎng)，使其生存、繼續(xù)生長(zhǎng)、正常發(fā)育，并保持其有正常的構(gòu)造與功能，以便在可控條件下進(jìn)行形態(tài)學(xué)、組織學(xué)等多方面的實(shí)驗(yàn)研究。如對(duì)培養(yǎng)后的大鼠或小鼠肢芽進(jìn)行阿利新藍(lán)染色，可觀察其軟骨的發(fā)育并對(duì)其發(fā)育狀態(tài)給予評(píng)價(jià)〔如Neubert評(píng)分〕[2],或肢芽整體包埋切片后觀察肢芽軟骨發(fā)育的形態(tài)學(xué)變化，或應(yīng)用免疫組化、原位雜交等方式方法檢測(cè)各種與發(fā)育相關(guān)基因、蛋白的表示出，以分析其影響發(fā)育的機(jī)制。此方式方法的特點(diǎn)是能具體表現(xiàn)出肢芽的整體發(fā)育狀況，并可與體內(nèi)相當(dāng)發(fā)育時(shí)期的肢芽作比照分析，以討論體外培養(yǎng)時(shí)檢測(cè)某單一因素對(duì)胚胎的發(fā)育毒性。第二，以胚胎肢芽制備原代肢芽細(xì)胞懸液在體外培養(yǎng)為主方式方法，稱肢芽細(xì)胞培養(yǎng)法。此方式方法可使肢芽中未分化的間充質(zhì)細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，對(duì)細(xì)胞增殖的影響進(jìn)行檢測(cè)，或者肢芽細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后能夠互相的辨別、移動(dòng)、粘附著后聚集在一起，對(duì)構(gòu)成分化后的軟骨細(xì)胞集落進(jìn)行觀察。此項(xiàng)技術(shù)最早由Flint等在80年代建立的，后來(lái)Renault等又加以改良成微團(tuán)培養(yǎng)法，一般采用正在分化的嚙齒類及鳥(niǎo)類的胚胎原代肢芽細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，模擬體內(nèi)發(fā)育經(jīng)過(guò)，研究細(xì)胞間通訊、細(xì)胞和胞外基質(zhì)的互相作用，用于分析各種暴露因子的生殖與發(fā)育毒性[3,4],在我們國(guó)家開(kāi)展此項(xiàng)技術(shù)始自上世紀(jì)80年代初期，至90年代中期開(kāi)場(chǎng)廣泛用于發(fā)育毒性物質(zhì)的檢測(cè)中。并發(fā)現(xiàn)一些化學(xué)致畸物大多也都是細(xì)胞分化抑制劑，能使微團(tuán)培養(yǎng)物中的細(xì)胞集落構(gòu)成數(shù)明顯減少，通過(guò)細(xì)胞集落數(shù)的變化研究化學(xué)物對(duì)肢芽軟骨發(fā)生的作用，判定其發(fā)育毒性。2肢芽培養(yǎng)技術(shù)在發(fā)育毒理學(xué)中的研究與應(yīng)用2.1有毒化學(xué)物質(zhì)及環(huán)境污染物對(duì)肢芽細(xì)胞增殖分化的影響近年來(lái)人們針對(duì)室內(nèi)的環(huán)境污染日益擔(dān)憂，如甲醛、二甲苯、氟等多種有毒物質(zhì)的污染對(duì)于人類發(fā)育中的嬰兒、幼兒及胚胎均有著不同程度的遺傳毒性及胚胎發(fā)育毒性。有學(xué)者選用小鼠肢芽體外培養(yǎng)方式方法分別研究了甲醛、苯、氟化物及乙醛的發(fā)育毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均可抑制小鼠胚胎肢芽的發(fā)育和分化，證實(shí)是潛在的致畸物。如吳成秋、李梓民等發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)液中苯的染毒濃度的增加，培養(yǎng)的小鼠胚胎肢芽軟骨細(xì)胞的集落數(shù)會(huì)逐步減少，肢芽細(xì)胞增殖遭到抑制，兩者均呈現(xiàn)較強(qiáng)的劑量-效應(yīng)關(guān)系[5-8].張全新、屈衛(wèi)東等則均選用了大鼠胚胎肢芽細(xì)胞體外培養(yǎng)，也證實(shí)甲醛、甲苯、二甲苯這三種污染室內(nèi)生活空氣的主要物質(zhì)具有上述研究的類似作用，且聯(lián)合染毒后毒性有相加作用[9];屈衛(wèi)東也證實(shí)了乙醛具有發(fā)育毒性作用和潛在的致畸作用[10].丙烯睛〔ACN〕、雙酚A〔BPA〕、等均為重要的有機(jī)化工原料，且有著不同程度的毒性，在其工業(yè)生產(chǎn)、加工運(yùn)輸、儲(chǔ)藏銷售等多種環(huán)節(jié)均與人類有著密切的接觸。對(duì)這些化學(xué)有機(jī)物質(zhì)的各類毒性研究范圍也在不斷拓展。如端禮榮等用大鼠胚胎肢芽細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)丙烯睛能抑制胚胎肢芽細(xì)胞增殖和分化，并經(jīng)其它檢測(cè)指標(biāo)分析，丙烯晴抑制了肢芽細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、引起脂質(zhì)過(guò)氧化而產(chǎn)生了細(xì)胞毒性[11].曾懷才等用小鼠胚胎肢芽細(xì)胞通過(guò)彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了環(huán)境污染物氯化三丁基錫〔TBTCI〕證實(shí)其具有遺傳毒性[12].李勇、龍鼎新等采用大鼠肢芽細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)技術(shù)檢測(cè)了工業(yè)污染物雙酚A、對(duì)-壬基酚，證實(shí)均具有抑制肢芽細(xì)胞增殖作用，屬于陽(yáng)性致畸物[13,14].2.2微量元素對(duì)肢芽細(xì)胞增殖分化的影響通過(guò)肢芽培養(yǎng)技術(shù)能夠檢測(cè)微量元素對(duì)肢芽細(xì)胞增殖與分化的影響。如硒、鋅等微量元素均是機(jī)體必需的，但研究證實(shí)機(jī)體內(nèi)微量元素含量太多或過(guò)少均會(huì)影響胚胎發(fā)育，并表現(xiàn)出不同程度的胚胎發(fā)育毒性。如國(guó)內(nèi)張全新等采用大鼠胚胎肢芽細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn):亞硒酸鈉在較低的適當(dāng)劑量有明顯的保衛(wèi)作用，包括抑制畸胎發(fā)生。過(guò)量就會(huì)產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性和細(xì)胞分化抑制作用，但由于實(shí)驗(yàn)結(jié)果為IP50小于ID50,所以分析過(guò)量導(dǎo)致的肢芽細(xì)胞分化抑制是一種細(xì)胞毒性物質(zhì)，具有胚胎發(fā)育毒性，而不是致畸物，為硒的安全使用和揭示硒的發(fā)育毒性提供根據(jù)[15].李小玲等通過(guò)給小鼠胚胎肢芽細(xì)胞體外培養(yǎng)液中參加不同劑量的硫酸鋅，的發(fā)現(xiàn)微量元素鋅對(duì)小鼠胚胎肢芽細(xì)胞的分化和增殖表現(xiàn)為促進(jìn)和抑制雙重作用，缺鋅及過(guò)量鋅均可抑制細(xì)胞的分化并產(chǎn)生毒性作用[16].郭衛(wèi)珍也通過(guò)小鼠肢芽細(xì)胞培養(yǎng)證實(shí)當(dāng)鋅濃度達(dá)43.0~86.0mol/L時(shí)，對(duì)胚胎肢芽發(fā)育具有明顯的促進(jìn)作用，而鋅缺乏〔0.0mol/L〕時(shí)或鋅過(guò)量〔172.0~215mol/L〕以上時(shí)均可以抑制小鼠胚胎肢芽的發(fā)育和分化[17].許遜等選則大鼠胚胎肢芽細(xì)胞培養(yǎng)，參加不同濃度的醋酸鋅，得出研究結(jié)果與上述類似，即對(duì)胚胎肢芽細(xì)胞增殖