第五章酶的固定化詳解演示文稿

第五章酶的固定化詳解演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有80頁\編輯于星期四優(yōu)選第五章酶的固定化現(xiàn)在是2頁\一共有80頁\編輯于星期四Contentsofchapter5概述第一節(jié)酶固定化第二節(jié)細(xì)胞固定化第三節(jié)原生質(zhì)體固定化現(xiàn)在是3頁\一共有80頁\編輯于星期四2.什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水溶性酶活化基團(tuán)固定化酶酶的固定化現(xiàn)在是4頁\一共有80頁\編輯于星期四固定化酶概念指固定在一定載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。通過吸附、偶聯(lián)、交聯(lián)、包埋等物理或化學(xué)的方法制備成的具有催化活性的水不溶性酶?，F(xiàn)在是5頁\一共有80頁\編輯于星期四2.固定化酶的制備方法吸附法離子鍵結(jié)合法共價(jià)鍵結(jié)合法交聯(lián)法凝膠包埋法半透膜包埋法固定化方法非共價(jià)結(jié)合法化學(xué)結(jié)合法包埋法熱處理法現(xiàn)在是6頁\一共有80頁\編輯于星期四吸附法1.吸附作用力2.固體吸附劑包括活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石3.優(yōu)缺點(diǎn)現(xiàn)在是7頁\一共有80頁\編輯于星期四（3）包埋法將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法。只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶。凝膠包埋法（網(wǎng)格型）半透膜包埋法（微囊型）包埋法現(xiàn)在是8頁\一共有80頁\編輯于星期四1）凝膠包埋法（網(wǎng)格型）將酶或含酶菌體包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中，制成一定形狀的固定化酶，稱為網(wǎng)格型包埋法。也稱為凝膠包埋法?，F(xiàn)在是9頁\一共有80頁\編輯于星期四首先被采用的網(wǎng)格包埋法是：固定化胰蛋白酶木瓜蛋白酶

－淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉雙丙稀酰胺,丙稀酰胺引發(fā)劑－－inactiation現(xiàn)在是10頁\一共有80頁\編輯于星期四2）半透膜包埋法（微囊型）將酶或含酶細(xì)胞包埋在高分子半透膜中的固定化方法?，F(xiàn)在是11頁\一共有80頁\編輯于星期四界面聚合法是用化學(xué)手段制備微囊的方法。利用親水性單體和疏水性單體在油水界面上發(fā)生聚合反應(yīng)形成聚合體而將酶包裹起來。現(xiàn)在是12頁\一共有80頁\編輯于星期四（3）結(jié)合法1）共價(jià)結(jié)合法☆通過共價(jià)鍵將酶與載體結(jié)合的方法。①

結(jié)合方法

ⅰ.將載體有關(guān)基團(tuán)活化，然后將酶有關(guān)基因發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)；

②

與載體共價(jià)結(jié)合的酶的功能基團(tuán)

ε-氨基，α-氨基，α,β或γ位的羧基、巰基、羥基、咪唑基、酚基等。現(xiàn)在是13頁\一共有80頁\編輯于星期四③載體天然有機(jī)載體（多糖、蛋白質(zhì)、細(xì)胞等）無機(jī)物（玻璃、陶瓷等）合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龍等）④優(yōu)缺點(diǎn)ⅰ.優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合牢固，一般不會(huì)因底物濃度高或存在鹽類等原因而輕易脫落。ⅱ.缺點(diǎn)：反應(yīng)條件苛刻，操作條件復(fù)雜；酶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)變化，破壞活性中心，活力降低。現(xiàn)在是14頁\一共有80頁\編輯于星期四⑤載體活化方法A．重氮法B．疊氮法C．烷基化反應(yīng)法D．溴化氰法現(xiàn)在是15頁\一共有80頁\編輯于星期四A．重氮法反應(yīng)示意式NH2NaNO2/HClN2+Cl-酶-TyrN=NOHCH2酶重氮鹽衍生物載體固定化酶現(xiàn)在是16頁\一共有80頁\編輯于星期四A．重氮法將含有苯氨基的不溶性載體與亞硝酸反應(yīng)，生成重氮鹽衍生物，使載體引進(jìn)活潑的重氮基團(tuán)。載體活化后，活潑的重氮基團(tuán)可與酶分子中的酚基或咪唑基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)而制得固定化酶。現(xiàn)在是17頁\一共有80頁\編輯于星期四B.疊氮法反應(yīng)示意式OCH2COOHOCH2COOCH2CH3OH/HClOCH2CONHNH2NH2NH2（肼）OCH2CON3NaNO2/HClOCH2CONH-酶酶-NH2現(xiàn)在是18頁\一共有80頁\編輯于星期四B.疊氮法對(duì)含有羧基的載體，與肼基作用生成含有酰肼基團(tuán)的載體，再與亞硝酸活化，生成疊氮化合物。最后與酶偶聯(lián)?，F(xiàn)在是19頁\一共有80頁\編輯于星期四C．烷基化反應(yīng)法含羥基的載體可用三氯三嗪等多鹵代物進(jìn)行活化，形成含有鹵素基團(tuán)的活化載體。鹵素基團(tuán)可與酶分子上的氨基、巰基、羥基等發(fā)生烷基化反應(yīng)，制備成固定化酶。OHO酶O現(xiàn)在是20頁\一共有80頁\編輯于星期四D．溴化氰法本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖類（含有羥基）物質(zhì)（如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等，其中以瓊脂糖為載體的占多數(shù)<大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)>），生成亞氨基碳酸衍生物?，F(xiàn)在是21頁\一共有80頁\編輯于星期四D．溴化氰法亞氨基碳酸基團(tuán)在微堿性條件下，可與酶分子上的氨基反應(yīng)，制成固定化酶。現(xiàn)在是22頁\一共有80頁\編輯于星期四D．溴化氰法用溴化氰法活化瓊脂糖制備得到的固定化酶目前使用很廣，特別用作親和層析，有著良好的性能。現(xiàn)在是23頁\一共有80頁\編輯于星期四共價(jià)結(jié)合法中載體的活化方法重氮法疊氮法烷基化法溴化氰法——含有苯氨基（亞硝酸）——含有酰肼基/羧基（亞硝酸）——含有羥基（三氯三嗪等多鹵代物）——含有羥基（溴化氰活化）現(xiàn)在是24頁\一共有80頁\編輯于星期四2）交聯(lián)法借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法稱為交聯(lián)法。也可用于含酶菌體或菌體碎片的固定化。常用試劑：戊二醛、異氰酸酯、N，N’乙烯馬來亞胺、雙重氮聯(lián)苯胺等。應(yīng)用最廣泛的是戊二醛，它兩個(gè)醛基都可以與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基形成席夫堿（shiff）。第一篇報(bào)道是：戊二醛交聯(lián)羧肽酶得到一種分子間交聯(lián)的固定化酶?，F(xiàn)在是25頁\一共有80頁\編輯于星期四（4）熱處理法將含酶細(xì)胞在一定溫度下加熱處理一段時(shí)間，使酶穩(wěn)定在菌體內(nèi)，而制備得到固定化菌體。熱處理法只適用于熱穩(wěn)定性較好的酶的固定化，在熱處理時(shí)，要嚴(yán)格控制好加熱溫度和時(shí)間，以免引起酶的變性失活?，F(xiàn)在是26頁\一共有80頁\編輯于星期四步驟step總體積Volume(ml)總活力Totalactivity(u)總蛋白Totalprotein(mg)比活力Specificactivity(u/mg)純化倍數(shù)Purification(fold)收率Yield(%)粗酶1040460070168.1乙醇沉淀9014257410.9DEAE-Sepharose柱層析11466292.0HiTrap-Q柱層析19422180.3下表是某酶的純化總結(jié)表，試計(jì)算比活力，回收率及純化倍數(shù)。2736.913080.223314.5140726.714.88.551.410030109現(xiàn)在是27頁\一共有80頁\編輯于星期四實(shí)驗(yàn)?zāi)竟系鞍酌傅墓潭ɑ瘜?shí)驗(yàn)原理：載體：尼龍固定化方法：共價(jià)結(jié)合法尼龍長(zhǎng)鏈中的酰胺鍵經(jīng)HCl水解后，產(chǎn)生游離的-NH基，在一定條件下與雙功能試劑戊二醛中的一個(gè)-CHO基縮合，戊二醛中的另一個(gè)-CHO基則與酶中的游離氨基縮合，形成尼龍(載體)-戊二醛(交聯(lián)劑)-酶，即尼龍固定化酶?，F(xiàn)在是28頁\一共有80頁\編輯于星期四實(shí)驗(yàn)?zāi)竟系鞍酌傅墓潭ɑ傅墓潭ɑ襟E：（1）每組取5塊尼龍布洗凈、晾干，浸入含18.6%CaCl2溶液和18.6%水的甲醇溶液中，在室溫下保溫10s左右，并輕輕攪拌至尼龍布發(fā)粘。取出后用水沖去污物，用吸水紙吸干。（2）將尼龍布用3.65mol/LHCl溶液在室溫下水解45min，用水洗至pH值中性。（3）將尼龍布用5%戊二醛溶液在室溫下浸泡偶聯(lián)20min。現(xiàn)在是29頁\一共有80頁\編輯于星期四實(shí)驗(yàn)?zāi)竟系鞍酌傅墓潭ɑ傅墓潭ɑ襟E：（4）取出尼龍布，用0.1mol/L磷酸緩沖液（pH值7.8）反復(fù)洗滌，洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液（0.5～1mg/mL）在4℃下固定3.5h（酶液用量每塊尼龍布不宜超過0.8mL）。（5）從酶液中取出尼龍布（保留殘余酶液作測(cè)定用），用0.5mol/LNaCl溶液（用0.1mol/L磷酸緩沖液（pH值7.2）配制），洗去多余的酶蛋白，即為尼龍固定化酶?，F(xiàn)在是30頁\一共有80頁\編輯于星期四實(shí)驗(yàn)?zāi)竟系鞍酌傅墓潭ɑ富盍y(cè)定：（1）溶液酶活力測(cè)定：取0.2mL酶液，加入1.8mL激活劑，于37℃下預(yù)熱10min，加入37℃預(yù)熱的0.5%酪蛋白溶液1mL，準(zhǔn)確反應(yīng)10min，然后加入10%三氯乙酸溶液2.0mL終止酶反應(yīng)。對(duì)照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其他與測(cè)定管相同，以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min或過濾，取其上清液于波長(zhǎng)280nm處測(cè)定消光值。在上述條件下，每10min增加0.001個(gè)消光值為1個(gè)酶單位(U)(以下同)?，F(xiàn)在是31頁\一共有80頁\編輯于星期四實(shí)驗(yàn)?zāi)竟系鞍酌傅墓潭ɑ富盍y(cè)定：（2）殘留酶活力測(cè)定：方法同溶液酶活力測(cè)定。（3）固定化酶活力測(cè)定：取一塊尼龍布固定化酶，加入2.0mL激活劑，其余步驟與溶液酶測(cè)定相同。現(xiàn)在是32頁\一共有80頁\編輯于星期四實(shí)驗(yàn)?zāi)竟系鞍酌傅墓潭ɑY(jié)果計(jì)算：固定化酶總活力活力回收=————————×100%

溶液酶總活力

固定化酶總活力數(shù)相對(duì)活力=

——————————————

×100%

溶液酶總活力數(shù)-殘留酶活力數(shù)現(xiàn)在是33頁\一共有80頁\編輯于星期四3.固定化酶的性質(zhì)（1）固定化后酶活力的變化——酶活力降低，反應(yīng)速度下降原因：1）構(gòu)象改變：酶分子在固定化過程中，空間構(gòu)象會(huì)有所變化，甚至影響了活性中心的氨基酸。2）空間位阻：固定化后，酶分子空間自由度受到限制（空間位阻），會(huì)直接影響到活性中心對(duì)底物的定位作用。3）內(nèi)擴(kuò)散作用：內(nèi)擴(kuò)散阻力使底物分子于活性中心的接近受阻。4）立體障礙：包埋時(shí)酶被高分子物質(zhì)包埋，大分子不能透過膜與酶接近?，F(xiàn)在是34頁\一共有80頁\編輯于星期四（2）固定化酶的穩(wěn)定性——大多提高1）穩(wěn)定性大多提高熱穩(wěn)定性大多提高，有些反而下降對(duì)各種有機(jī)試劑及酶抑制劑的穩(wěn)定性提高對(duì)不同pH（酸度）穩(wěn)定性，對(duì)分解酶的穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性提高。2）穩(wěn)定性提高的原因固定化后，酶分子與載體多點(diǎn)連接，可防止酶分子伸展變形；酶活力的緩慢釋放；抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。青霉素?；福汗潭ɑ冈趐H5.5~10.3穩(wěn)定，游離酶僅在pH7.0~9.0穩(wěn)定?，F(xiàn)在是35頁\一共有80頁\編輯于星期四（3）固定化酶的最適溫度變化——可能提高固定化酶的最適作用溫度一般與游離酶差不多，活化能變化也不大，有些會(huì)發(fā)生變化；由于固定化，酶的熱穩(wěn)定性提高，所以最適溫度也隨之提高；固定化酶的最適作用溫度可能會(huì)受到固定化方法和固定化載體的影響?，F(xiàn)在是36頁\一共有80頁\編輯于星期四（4）固定化酶的最適pH——發(fā)生改變酶經(jīng)固定化后，對(duì)底物作用的最適pH和酶活力-pH曲線常常發(fā)生偏移；2）載體性質(zhì)對(duì)最適pH的影響；一般用帶負(fù)電荷載體（陰離子聚合物）制備的固定化酶，其最適pH↑。一般用帶正電荷載體（陽離子聚合物）制備的固定化酶，其最適pH↓。1）pH對(duì)酶活性的影響：改變酶的空間構(gòu)象影響酶的催化基團(tuán)的解離影響酶的結(jié)合基團(tuán)的解離改變底物的解離狀態(tài)，酶與底物不能結(jié)合或結(jié)合后不能生成產(chǎn)物?，F(xiàn)在是37頁\一共有80頁\編輯于星期四3）產(chǎn)物性質(zhì)對(duì)最適pH的影響；產(chǎn)物酸性，其最適pH↑。產(chǎn)物堿性，其最適pH↓。產(chǎn)物中性，其最適pH不變?，F(xiàn)在是38頁\一共有80頁\編輯于星期四（5）底物特異性——發(fā)生改變對(duì)作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特異性沒有明顯變化；對(duì)于可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，固定化酶的底物特異性往往會(huì)發(fā)生變化。固定化酶底物特異性的改變，是由于載體的空間位阻作用引起的?，F(xiàn)在是39頁\一共有80頁\編輯于星期四（6）固定化酶的米氏常數(shù)（Km）——發(fā)生改變當(dāng)酶結(jié)合于電中性載體時(shí)，由于擴(kuò)散限制，造成表觀Km↑；由于高級(jí)結(jié)構(gòu)變化及載體影響引起酶與底物親和力變化，從而使Km變化。當(dāng)載體與底物電荷相反，固定化酶的表觀Km↓；當(dāng)載體與底物電荷相同，固定化酶的表觀Km顯著增加。Km值又受載體的疏水性及溶液中離子強(qiáng)度的影響?，F(xiàn)在是40頁\一共有80頁\編輯于星期四——改變——可能改變——發(fā)生變化固定化酶的性質(zhì)固定化酶活力固定化酶的穩(wěn)定性固定化酶的最適溫度固定化酶的最適pH固定化酶的底物特異性固定化酶的米氏常數(shù)（Km）——活力降低——大多提高——可能提高載體性質(zhì)帶負(fù)電荷：固定化酶pH↑帶正電荷：固定化酶pH↓產(chǎn)物性質(zhì)產(chǎn)物酸性：固定化酶pH↑產(chǎn)物堿性：固定化酶pH↓產(chǎn)物中性：固定化酶pH不變作用于小分子底物的酶－不變可作用于小分子及大分子底物的酶－改變載體與底物電荷相反－Km降低載體與底物電荷相同－Km升高現(xiàn)在是41頁\一共有80頁\編輯于星期四5.4細(xì)胞和原生質(zhì)體固定化1、細(xì)胞固定化細(xì)胞的固定化：通過各種方法將細(xì)胞與水不溶性載體結(jié)合，制備固定化細(xì)胞的過程。固定化細(xì)胞：指被限制自由移動(dòng)的細(xì)胞，即細(xì)胞受到物理、化學(xué)等因素的約束或限制在一定的空間界限內(nèi)，但細(xì)胞仍保留催化活性并具有能反復(fù)或連續(xù)適用的活力?，F(xiàn)在是42頁\一共有80頁\編輯于星期四（1）

固定化細(xì)胞的分類①按細(xì)胞類型分類固定化微生物細(xì)胞固定化植物細(xì)胞固定化動(dòng)物細(xì)胞②按生理狀態(tài)分固定化死細(xì)胞固定化活細(xì)胞固定化靜止細(xì)胞和饑餓細(xì)胞固定化生長(zhǎng)細(xì)胞（增殖細(xì)胞）：完整細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器：較適合于單酶反應(yīng)：更適合于多酶反應(yīng)現(xiàn)在是43頁\一共有80頁\編輯于星期四（2）固定化（增殖）細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)①優(yōu)點(diǎn)Ⅰ.有利于提高細(xì)胞的存活率和穩(wěn)定性；Ⅱ.縮短發(fā)酵周期，提高生產(chǎn)能力（產(chǎn)率）；Ⅲ.提高發(fā)酵穩(wěn)定性，可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)反復(fù)和連續(xù)使用；Ⅳ.易與培養(yǎng)液與產(chǎn)物分開，利于產(chǎn)品的分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。現(xiàn)在是44頁\一共有80頁\編輯于星期四（2）固定化（增殖）細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)②缺點(diǎn)Ⅰ.利用的僅是胞內(nèi)酶，副產(chǎn)物多；Ⅱ.細(xì)胞膜、細(xì)胞壁及載體存在擴(kuò)散限制作用；Ⅲ.載體形成的孔隙大小影響高分子底物和產(chǎn)物的通透性?，F(xiàn)在是45頁\一共有80頁\編輯于星期四（3）固定化細(xì)胞的制備（P169-178）一般說，對(duì)于一步和兩步反應(yīng)的轉(zhuǎn)化過程，用固定化酶較合適；對(duì)多步轉(zhuǎn)化，采用整體細(xì)胞有利。固定方法吸附法包埋法：制備固定化細(xì)胞的主要方法。：凝膠包埋法是應(yīng)用最廣泛的方法。瓊脂凝膠包埋法海藻酸鈣凝膠包埋法角叉菜膠包埋法明膠包埋法聚丙烯酰胺凝膠包埋法光交聯(lián)樹脂包埋法現(xiàn)在是46頁\一共有80頁\編輯于星期四研究熱點(diǎn)——光交聯(lián)樹脂包埋法例：相對(duì)分子量為1000-3000的光交聯(lián)聚氨酯預(yù)聚物等，加入1%左右的光敏劑，加水配成一定濃度，加熱至50℃，然后與一定濃度的細(xì)胞懸浮液混合均勻，攤成一定厚度的薄層，用紫外照射3min，就可制得?，F(xiàn)在是47頁\一共有80頁\編輯于星期四活性炭固定化產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵性絲孢酵母細(xì)胞的研究摘要：以活性碳為載體，采用吸附培養(yǎng)的方法將發(fā)酵性絲孢酵母細(xì)胞固定化，確定了吸附培養(yǎng)固定化的適宜條件，并測(cè)定了固定化細(xì)胞的保存穩(wěn)定性和使用穩(wěn)定性。結(jié)果表明，在100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中(250mL搖瓶)添加1.0g活性碳于30％、160r/min吸附培養(yǎng)48h，可吸附較多細(xì)胞。將固定化細(xì)胞于40℃保存30d脂肪酶活力無明顯下降。用固定化細(xì)胞催化人豆油轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，連續(xù)催化5批后酯化率仍超過50％?，F(xiàn)在是48頁\一共有80頁\編輯于星期四載體的預(yù)處理將一定量活性炭顆粒置于lmol/LHCl溶液中，于50℃攪拌1h后除去酸液，用去離子水反復(fù)沖洗至洗液pH值為中性，然后于130％烘干待用?，F(xiàn)在是49頁\一共有80頁\編輯于星期四固定化細(xì)胞的吸附培養(yǎng)與處理在l00mL發(fā)酵培養(yǎng)基中(250mL搖瓶)加入一定量經(jīng)預(yù)處理的載體，接入10％的液體種子，于30℃、160r/min搖床發(fā)酵，濾出載體，用去離子水和50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)洗滌3次，風(fēng)干制得固定化細(xì)胞?，F(xiàn)在是50頁\一共有80頁\編輯于星期四固定化細(xì)胞的保存穩(wěn)定性將固定化細(xì)胞置于4℃保存，定期取樣測(cè)定胞內(nèi)脂肪酶活力，以游離細(xì)胞作對(duì)照舊?，F(xiàn)在是51頁\一共有80頁\編輯于星期四固定化細(xì)胞的使用穩(wěn)定性用固定化細(xì)胞催化大豆油進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，每反應(yīng)一批后，回收固定化細(xì)胞，用丙酮充分洗滌，風(fēng)干，加入新的反應(yīng)體系中，繼續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)?，F(xiàn)在是52頁\一共有80頁\編輯于星期四5.4細(xì)胞和原生質(zhì)體固定化2.原生質(zhì)體的固定化（1）原生質(zhì)體的制備1）制備過程將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞收集→懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的高滲緩沖液中→加入水解酶→分離→得到原生質(zhì)體2）細(xì)胞壁水解酶細(xì)菌：溶菌酶酵母菌：蝸牛消化酶霉菌：幾丁質(zhì)酶植物：纖維素酶，果膠酶現(xiàn)在是53頁\一共有80頁\編輯于星期四（2）原生質(zhì)體固定化將原生質(zhì)替制備好后，把離心收集到的原生質(zhì)體重新懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖液中，配成一定濃度的原生質(zhì)體懸浮液，然后采用包埋法制成固定化原生質(zhì)體?，F(xiàn)在是54頁\一共有80頁\編輯于星期四（3）固定化原生質(zhì)體的特點(diǎn)1）增加細(xì)胞的通透性，利于氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞和吸收，利于胞內(nèi)產(chǎn)物的釋放，可顯著提高產(chǎn)率。2）有載體的保護(hù)作用，具有較好的操作穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性，可反復(fù)使用或連續(xù)使用較長(zhǎng)時(shí)間，利于連續(xù)化生產(chǎn)。3）易與發(fā)酵產(chǎn)物分開，有利于產(chǎn)物的分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。4）固定化原生質(zhì)體發(fā)酵的培養(yǎng)基中需添加滲透壓穩(wěn)定劑，以保持原生質(zhì)體的穩(wěn)定性?，F(xiàn)在是55頁\一共有80頁\編輯于星期四輔酶、細(xì)胞及原生質(zhì)體的固定化方法輔酶多采用共價(jià)結(jié)合法細(xì)胞吸附法凝膠包埋法原生質(zhì)體包埋法現(xiàn)在是56頁\一共有80頁\編輯于星期四上節(jié)課主要內(nèi)容固定化酶的性質(zhì)輔酶的固定化細(xì)胞及原生質(zhì)體的固定化現(xiàn)在是57頁\一共有80頁\編輯于星期四——改變——可能改變——發(fā)生變化固定化酶的性質(zhì)固定化酶活力固定化酶的穩(wěn)定性固定化酶的最適溫度固定化酶的最適pH固定化酶的底物特異性固定化酶的米氏常數(shù)（Km）——活力降低——大多提高——可能提高載體性質(zhì)帶負(fù)電荷：固定化酶pH↑帶正電荷：固定化酶pH↓產(chǎn)物性質(zhì)產(chǎn)物酸性：固定化酶pH↑產(chǎn)物堿性：固定化酶pH↓產(chǎn)物中性：固定化酶pH不變作用于小分子底物的酶－不變可作用于小分子及大分子底物的酶－改變載體與底物電荷相反－Km降低載體與底物電荷相同－Km升高現(xiàn)在是58頁\一共有80頁\編輯于星期四輔酶、細(xì)胞及原生質(zhì)體的固定化方法輔酶多采用共價(jià)結(jié)合法細(xì)胞吸附法凝膠包埋法原生質(zhì)體包埋法現(xiàn)在是59頁\一共有80頁\編輯于星期四評(píng)價(jià)固定化酶（細(xì)胞）的指標(biāo)1、固定化酶（細(xì)胞）的活力2、偶聯(lián)率及相對(duì)活力3、固定化酶（細(xì)胞）的半衰期

現(xiàn)在是60頁\一共有80頁\編輯于星期四5.5固定化酶（細(xì)胞）的應(yīng)用固定化酶在基礎(chǔ)理論研究中應(yīng)用固定化酶和親和色譜固定化酶（細(xì)胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用固定化酶在分析化學(xué)中應(yīng)用固定化酶與環(huán)境保護(hù)固定化酶在新能源開發(fā)中的應(yīng)用現(xiàn)在是61頁\一共有80頁\編輯于星期四1.在基礎(chǔ)理論研究中的應(yīng)用（1）闡明酶反應(yīng)的機(jī)理在多酶反應(yīng)中，將酶固定化后裝成酶柱，說明每一個(gè)酶的作用。（2）酶亞基性質(zhì)的研究采用固定化方法，控制一定的條件，使多亞基酶中只有一個(gè)亞基與載體相連，再通過一定的方法，除去未被固定的亞基，從而研究單亞基的性質(zhì)?，F(xiàn)在是62頁\一共有80頁\編輯于星期四活化載體

載體+活化+現(xiàn)在是63頁\一共有80頁\編輯于星期四例如：醛縮酶亞基活力的測(cè)定8mol/L尿素透析醛縮酶亞基活力測(cè)定固定化衍生物活力/U蛋白質(zhì)/mg比活力/U·mg-1全酶1001004.5亞基9.827.51.6現(xiàn)在是64頁\一共有80頁\編輯于星期四（3）揭示酶原激活機(jī)理有時(shí)酶原激活并不涉及蛋白水解。如：酪氨酸酶，固定化后，不需水解就可活化至天然酶活的20％～30％。說明蛋白酶結(jié)構(gòu)重排后可激活酶的一些活力。（4）研究蛋白質(zhì)-核酸分子結(jié)構(gòu)如：用雙功能試劑測(cè)定酶?jìng)?cè)鏈基團(tuán)之間的距離；用交聯(lián)法分析寡聚蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)在是65頁\一共有80頁\編輯于星期四2.親和分離系統(tǒng)（1）生物親和技術(shù)的基礎(chǔ)：生物活性化合物特異性信息的綜合。（2）親和分離利用生命現(xiàn)象中生物分子間特有的高親和力、高專一性，可逆結(jié)合而設(shè)計(jì)的一種十分巧妙的純化方法，是唯一的一種能夠體現(xiàn)待分離物質(zhì)間生物學(xué)功能差異的分離方法?，F(xiàn)在是66頁\一共有80頁\編輯于星期四（3）親和分離種類1）將某種作為配基的生物分子偶聯(lián)于固相載體上制成親和吸附劑，用作色譜的填充劑來分離與之特異結(jié)合的配體，然后將配體洗脫下來并回收-親和色譜法。2）將配基偶聯(lián)于載體上，用于選擇性地去除某些污染物。3）將細(xì)胞表面抗原分子對(duì)應(yīng)的抗體偶聯(lián)于載體上用于細(xì)胞的標(biāo)記、分離及性質(zhì)研究。現(xiàn)在是67頁\一共有80頁\編輯于星期四（4）應(yīng)用1）物質(zhì)分離2）微量物質(zhì)的分析3）肽庫及抗體庫的篩選4）制藥工業(yè)（親和色譜用于藥用重組蛋白的純化）5）核酸分離（堿基配對(duì)）現(xiàn)在是68頁\一共有80頁\編輯于星期四色譜

固定化金屬離子親和色譜法純化豬銅鋅超氧化物歧化酶以Cu+-Sepharose4B固定化金屬離子親和色譜法純化豬銅鋅超氧化物歧化酶，考察丁不同的洗脫緩沖溶液及其pH對(duì)純化效率的影響，顯示了方法的有效性。現(xiàn)在是69頁\一共有80頁\編輯于星期四色譜

固定化銅離子親和膜色譜柱吸附血紅蛋白的研究

將纖維素濾紙進(jìn)行堿處理及環(huán)氧活化、偶聯(lián)亞氨基二乙酸、固定化銅離子等處理，并將其裝入自制的色譜柱管，制得固定化銅離子親和膜色譜柱。該柱可用于吸附血紅蛋白(hemoglobin，Hb)，吸附率可達(dá)到90％以上?，F(xiàn)在是70頁\一共有80頁\編輯于星期四3.藥物控釋載體——從時(shí)間和空間分布上控制藥物的釋放。（1）一些藥物不能用于臨床的原因1）很多藥物尤其是蛋白質(zhì)類藥物，口服易被胃酸破壞或沉淀。2）單純注射后瞬時(shí)血藥濃度提高，但馬上被肝臟及血液中的酶系統(tǒng)所消除，需要反復(fù)注射，不僅增加治療費(fèi)用，而且增加感染的機(jī)會(huì)。3）腫瘤化療用細(xì)胞毒性物質(zhì)選擇性較差，全身毒副作用嚴(yán)重。4）有些藥物親水性強(qiáng)，難于穿過細(xì)胞膜。5）蛋白質(zhì)類藥物易引起免疫反應(yīng)。6）很多藥物穩(wěn)定性差，不耐貯存。藥物控制釋放技術(shù)：將藥物或其他的活性物質(zhì)與適當(dāng)?shù)妮d體按一定的形式制成制劑，控制藥物在人體內(nèi)吸收、代謝以及排泄的過程。使藥物按設(shè)計(jì)的劑量，在要求的時(shí)間范圍內(nèi)以一定的模式在體內(nèi)釋放或使藥物在指定部位釋放而達(dá)到治療某種疾病的目的?，F(xiàn)在是71頁\一共有80頁\編輯于星期四（2）解決方法1）聚合物修飾多用于蛋白質(zhì)類藥物。這類藥物生物半衰期短，免疫性強(qiáng)，可用適當(dāng)?shù)乃苄愿叻肿泳酆衔锛右孕揎椧愿纳破湫阅堋?）凝膠包埋

——希望藥物能夠較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持一個(gè)穩(wěn)定濃度用生物相容性好的高分子聚合物與藥物混合制成含有藥物的凝膠，植入人體內(nèi)特定部位，以達(dá)到緩釋給藥效果?，F(xiàn)在是72頁\一共有80頁\編輯于星期四3）微球制劑用高聚物微球包埋或化學(xué)偶聯(lián)藥物可制成微球制劑，它具有靶向性、緩釋性及減少抗藥性等特點(diǎn)。微球與靶細(xì)胞接觸，可以通過胞飲進(jìn)入胞內(nèi)發(fā)生作用，不影響細(xì)胞膜通透性，不會(huì)產(chǎn)生抗藥性。4）脂質(zhì)體脂質(zhì)體是磷脂雙分子層在水溶液中自發(fā)形成的超微型中空小泡，具有靶向性、長(zhǎng)效性。并且可以通過胞飲作用胞內(nèi)釋放藥物，從而避免抗藥性；此外還具有更好的生物相容性和可生物降解性，并且無毒性，無免疫原性?，F(xiàn)在是73頁\一共有80頁\編輯于星期四5）導(dǎo)向藥物導(dǎo)向藥物具有主動(dòng)靶向性，將針對(duì)腫瘤細(xì)胞的單克隆抗體與化療藥物化學(xué)偶聯(lián)，可以直接作用于腫瘤細(xì)胞而產(chǎn)生殺傷作用，并且降低全身毒性。現(xiàn)在是74頁\一共有80頁\編輯于星期四高分子通報(bào)

生物可降解聚酯用作蛋白質(zhì)藥物控釋載體聚乳酸PLA及乳酸與羥基乙酸的共聚物PLGA，由于其良好的生物相容性以及生物降解性，可用作蛋白質(zhì)類藥物控釋體系的載體材料，同時(shí)可延長(zhǎng)蛋白質(zhì)藥物的釋放。本文綜述了幾種生物相容性聚酯及其衍生物以及它們的形成方法：(1)在PLGA的分子鏈中引入親水性的含醚鍵的分子如PEO、PEG，來提高聚合物的親水性，形成PLGA嵌段共聚物；(2)將細(xì)胞可接受的片段或多肽固定在聚合物支架表面，來增強(qiáng)PLGA與細(xì)胞間的粘附力，得到靶向的PLGA衍生物；(3)改變PLGA載體內(nèi)的酸性環(huán)境，提高蛋白質(zhì)藥物在載體中的穩(wěn)定性，發(fā)展了支化聚酯PVA-g-PLGA，并得到均速的藥物釋放。以上這些方法所得到的聚酯及其衍生物，均可作為蛋白質(zhì)類藥物安全、可靠的載體材料?，F(xiàn)在是75頁\一共有80頁\編輯于星期四4.生物傳感器由固定化酶（或細(xì)胞、細(xì)胞器等）與適當(dāng)?shù)膿Q能器（電極、場(chǎng)效應(yīng)管、離子選擇場(chǎng)效應(yīng)管等）密切結(jié)合而構(gòu)成的分析系統(tǒng)，由感受器、換能器和電子線路三部分組成。應(yīng)用：葡萄糖氧化酶電極，青霉素酶電極現(xiàn)在是76頁\一共有80頁\編輯于星期四Pellinen等研究了一種