雞β-防御素-1重組畢赤酵母的制備與表達(dá)課件

雞β-防御素-1重組畢赤酵母的制備與表達(dá)姓名：莊杰導(dǎo)師：張興群概述β-防御素是雞體內(nèi)的一種重要抗菌肽，除了具有直接的殺菌、抗病毒作用外，它還參與機(jī)體免疫反應(yīng)，如今由于抗生素的濫用引發(fā)的問題而日益引起人們廣泛關(guān)注。

動(dòng)物防御素具有代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素的潛力，主要表現(xiàn)在：抗菌譜廣，免疫原性無或低，對(duì)人畜無毒副作用，無殘留，無耐藥性，熱穩(wěn)定性和溶解性良好，對(duì)較高離子強(qiáng)度或較大pH變化耐受性較好。因此，防御素越來越受到研究人員的關(guān)注。防御素

防御素是一類堿性陽離子抗菌肽，相對(duì)分子質(zhì)量為3500-4500左右，分子中含有6-8個(gè)保守的半胱氨酸殘基，形成3-4對(duì)分子內(nèi)二硫鍵，并通過半胱氨酸分子間二硫鍵使肽環(huán)形成反向平行的β-片狀結(jié)構(gòu)。根據(jù)其分子內(nèi)半胱氨酸的位置和連接方式及前體性質(zhì)的差異可分為α-防御素、β-防御素、θ-防御素、昆蟲防御素和植物防御素。防御素具有廣譜抗微生物作用，包括各種細(xì)菌、真菌和一些具膜病毒，為機(jī)體抵御外界微生物侵襲的第一道屏障?？咕鷻C(jī)理2.抑制胞外大分子的合成

防御素對(duì)肽聚糖、幾丁質(zhì)及一些生物大分子合成、交聯(lián)的抑制也可能是其重要的殺菌機(jī)理之一。3.抑制胞內(nèi)功能

防御素也能夠破壞某些重要的胞內(nèi)過程，從而促進(jìn)細(xì)胞死亡。在某些實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)微生物能夠在膜不完整的情況下存活更長的時(shí)間，這就預(yù)示著防御素可能有非膜破壞殺菌機(jī)制的存在?？共《緳C(jī)理

防御素抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制與殺菌的機(jī)制不盡相同，它比殺菌機(jī)制更為復(fù)雜。一方面，它能通過其細(xì)胞毒性，主要是對(duì)細(xì)胞膜、核膜、線粒體、細(xì)胞核染色體和細(xì)胞骨架等的損傷來達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的效果；另一方面，防御素能通過調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫機(jī)能，從體液免疫方面來抵抗癌細(xì)胞的入侵。防御素的應(yīng)用現(xiàn)狀1在醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用

細(xì)菌對(duì)傳統(tǒng)抗生素的耐藥性是當(dāng)今全球性難題，防御素因其具有廣譜的抗菌活性，獨(dú)特的抗菌機(jī)理，并與典型的抗生素具有協(xié)同作用，能中和內(nèi)毒素，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)組織創(chuàng)傷修復(fù)等特點(diǎn)引起了人們的廣泛關(guān)注2在食品行業(yè)的應(yīng)用

在食品方面，防御素主要用作防腐劑，防止食品腐敗變質(zhì)。防御素的應(yīng)用現(xiàn)狀3在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用

防御素在農(nóng)業(yè)中可用于農(nóng)作物抗病育種。4在畜牧業(yè)上應(yīng)用

防御素作為飼料添加劑對(duì)細(xì)菌具有很強(qiáng)的抑制作用，能夠促經(jīng)畜禽生長，提高飼料的利用率，動(dòng)物在采食以后不會(huì)再體內(nèi)殘留。酵母表達(dá)系統(tǒng)

作為外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：遺傳操作簡單；對(duì)重組蛋白可以進(jìn)行翻譯后加工修飾，從而使表達(dá)出的蛋白具有生物活性；具有強(qiáng)有力的乙醇氧化酶(AOXI)基因啟動(dòng)子，可嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)；對(duì)需氧生長有強(qiáng)的偏好，這一生理學(xué)特性使它能高密度發(fā)酵生長，表達(dá)量高，對(duì)工業(yè)放大生產(chǎn)有利；畢赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，有利于外源蛋白的分離和純化。防御素畢赤酵母的構(gòu)建及篩選

利用TRNzol試劑盒從安徽三黃雞肝臟中抽提總RNA，并進(jìn)行電泳檢測；根據(jù)Genbank中登錄的雞β-防御素-1基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，利用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增Gal-1成熟肽基因片段；將此片段與pMD-18-T載體相連，構(gòu)建重組克隆載體pMD-18-Gal-1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后進(jìn)行鑒定、序列測定；后將測序正確的目的片段與載體pPIC3.5K連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5K-Gal-1，單酶切后用電轉(zhuǎn)化的方法將構(gòu)建的重組表達(dá)載體整合入畢赤酵母GS115中，然后進(jìn)行了高拷貝的篩選和表型的鑒定。高拷貝篩選

實(shí)驗(yàn)中使用濃度分別為0，50，100，200，300μg/mL的G418來進(jìn)行高拷貝的初步篩選，然后進(jìn)一步通過實(shí)時(shí)定量PCR來驗(yàn)證，兩者結(jié)果基本一致。但也有研究發(fā)現(xiàn)高拷貝與高表達(dá)并不一定對(duì)應(yīng)。因此，基因拷貝數(shù)對(duì)表達(dá)量的影響還無法預(yù)測，高表達(dá)菌株的篩選只應(yīng)以表達(dá)蛋白量的高低作為唯一標(biāo)準(zhǔn)。因此還需要進(jìn)行下一步的表達(dá)工作來證明高拷貝是否能提高重組Gal-1的表達(dá)量。轉(zhuǎn)化子表型的鑒定

外源蛋白在酵母基因組中的整合方式有兩種：一種是在His4或5’AOX1啟動(dòng)子區(qū)域，酵母染色體上的AOX1基因保持完整，這種整合產(chǎn)生的菌株表型為Mut+；另一種是雙位點(diǎn)置換，含5’AOX1啟動(dòng)子、外源基因和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的表達(dá)單元將染色體上的AOX1基因置換下來，導(dǎo)致AOX1基因的缺失，因而只能依靠弱轉(zhuǎn)錄的AOX2基因，所以利用甲醇速度慢，由此產(chǎn)生的菌株表型為Muts。轉(zhuǎn)化子表型的鑒定

基于此原理，我們對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了表型鑒定，方法是以5’AOX1/3’AOX1作為引物，酵母基因組作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如果是Mut+整合，可見兩條帶，一條與目的基因相關(guān)，另一條為AOX1基因（大小約為2.2kb），如果是Muts整合，只有與目的基因相關(guān)的一條帶。重組酵母菌表達(dá)蛋白酶：有些蛋白特別易受在中性PH值時(shí)有很好活性的蛋白酶的影響。在這種情況下，建議用MGY，MM培養(yǎng)基，因?yàn)楫?dāng)畢赤酵母在無緩沖培養(yǎng)基如MM中表達(dá)時(shí)，PH降至3或更低，許多中性PH蛋白酶都將失活。畢赤酵母對(duì)低PH值有抗性，因此低PH值不會(huì)影響生長。如果表達(dá)蛋白降解了，嘗試在無緩沖培養(yǎng)基中進(jìn)行表達(dá)。如果以上條件仍不能有效防止蛋白降解，可將基因轉(zhuǎn)入SMD1168中，該菌株表型是his4pep4，缺失了蛋白酶，轉(zhuǎn)化與表達(dá)程序與GS115相同，也可用于大規(guī)模發(fā)酵。重組酵母菌表達(dá)換氣：畢赤酵母高效表達(dá)的重要因素是在甲醇誘導(dǎo)時(shí)充分換氣?；旧显谡T導(dǎo)時(shí)，培養(yǎng)基不要超過搖瓶體積的10-30%。建議使用隔板搖瓶，用2-3層干酪包布或松散合適的蓋子蓋住搖瓶，不要用很緊的蓋子。(換氣在誘導(dǎo)前大量培養(yǎng)時(shí)并不那么重要)溫度及振蕩：所有表達(dá)需在30度的搖床中進(jìn)行。溫度不能超過30度很重要，如果搖床溫度不穩(wěn)，設(shè)置在28度。使用落地式搖床，速度為225-250rpm，如果為臺(tái)式搖床，速度調(diào)至250-300rpm。

重組酵母菌表達(dá)開始前：先證實(shí)重組子及對(duì)照重組子(無插入，1拷貝插入)在GS115中的表達(dá)情況。進(jìn)行表達(dá)時(shí)，選擇合適的對(duì)照很重要，可以更好地解釋你的表達(dá)結(jié)果。表達(dá)對(duì)照如下：GS115/HIS+Mut+β-galMut+胞內(nèi)表達(dá)對(duì)照GS115/HIS+MutsAbluminMuts

分泌表達(dá)對(duì)照GS115/載體(無插入)背景對(duì)照GS115/載體(1拷貝插入)單拷貝基因表達(dá)水平對(duì)照不同的重組形式均會(huì)影響表達(dá)，建議挑取6-10個(gè)克隆進(jìn)行表達(dá)水平篩選。重組酵母菌表達(dá)4每24小時(shí)，加甲醇至終濃度為0.5%以繼續(xù)誘導(dǎo)。檢查培養(yǎng)基的量，確保正確加入甲醇，因?yàn)檎舭l(fā)作用會(huì)減少培養(yǎng)基的體積。5在下列的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取1ml培養(yǎng)基至1-5ml離心管。這些樣品用于分析表達(dá)水平及確定誘導(dǎo)后收集細(xì)胞的最佳時(shí)間。室溫用水平離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速離心2-3min。時(shí)間點(diǎn)：0，6，12，24(1天)，36，48(2天)，60，72(3天)，84，96(4天)。

6用考馬斯亮藍(lán)染色SDS，westernblot或功能分析方法來分析上清及細(xì)胞沉淀的蛋白表達(dá)(SDSp47)。重組酵母菌表達(dá)Muts胞內(nèi)表達(dá):可培養(yǎng)GS115Ablumin(Muts，分泌白蛋白至培養(yǎng)基中)檢測培養(yǎng)條件的效率。記住要用轉(zhuǎn)化親本載體的GS115作為胞內(nèi)表達(dá)的背景對(duì)照。1挑取單克隆，接種至含100mlMGY，BMG或BMGY的1L隔板搖瓶中。在搖床中28-30度，250-300rpm生長至OD600=2-6(約16-18小時(shí))2室溫1500-3000g離心5min收集細(xì)胞，去除上清，用1/5-1/10原培養(yǎng)基體積的MM，BMM或BMMY重懸細(xì)胞(約10-20ml)3置于100ml隔板搖瓶中，用2層滅菌紗布或干酪包布蓋住瓶口，放入搖床繼續(xù)培養(yǎng)。重組酵母菌表達(dá)4每隔24小時(shí)，加入甲醇至終濃度為0.5%以繼續(xù)誘導(dǎo)。5在下列的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取1ml培養(yǎng)基至1-5ml離心管。這些樣品用于分析表達(dá)水平及確定誘導(dǎo)后收集細(xì)胞的最佳時(shí)間。室溫用水平離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速離心2-3min。時(shí)間點(diǎn)：0，6，12，24(1天)，36，48(2天)，60，72(3天)，84，96(4天)。6用考馬斯亮藍(lán)染色SDS，westernblot或功能分析方法來分析上清及細(xì)胞沉淀的蛋白表達(dá)。重組酵母菌表達(dá)4渦旋30s，冰上孵育30s，重復(fù)8次54度最大轉(zhuǎn)速離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至干凈的微量離心管中6取50ul上清(細(xì)胞裂解物)，，加入50ul2×SDS凝膠上樣緩沖液(樣品buffer)7煮沸10min,每孔加10-20ul，依膠的厚薄及孔量，決定點(diǎn)樣量。剩下樣品存于-20度，用于western