生物大分子制備與純化

生物大分子制備與純化第1頁/共70頁MDCKcells第2頁/共69頁第2頁/共70頁Fibroblast

第3頁/共69頁第3頁/共70頁第4頁/共69頁第4頁/共70頁基因工程產物（重組蛋白）第5頁/共69頁第5頁/共70頁維持生物系統(tǒng)的作用力

（非共價鍵）第6頁/共69頁第6頁/共70頁氫鍵（HydrogenBond）第7頁/共69頁第7頁/共70頁HydrogenBond第8頁/共69頁第8頁/共70頁Theaggregationofnonpolargroupsinwaterleadstoanincreaseinentropyowingtothereleaseofwatermoleculesintobulkwater.疏水作用（HydrophobicEffect）

第9頁/共69頁第9頁/共70頁雙極性（Amphipathic）第10頁/共69頁第10頁/共70頁范德華力

VanDerWaalsForcesOrbitsofelectronssynchronizesothatelectronsinneighboringmoleculesstayasfarawayfromeachotheraspossible:+-+-Thisleadstoaveryweakveryshortrangeattractionperhaps1%asstrongasacovalentbond.第11頁/共69頁第11頁/共70頁壁虎（geckos）EvidenceforvanderWaalsadhesioningeckosetae.

ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUSA

2002,

99,12252–12256.

第12頁/共69頁第12頁/共70頁弱相互作用第13頁/共69頁第13頁/共70頁奇妙的生物酶系統(tǒng)低溫、高效、專一性、可調控第14頁/共69頁第14頁/共70頁第15頁/共69頁第15頁/共70頁酶活力（酶活性）習慣單位U：一定條件、時間將一定量底物轉化所需的酶量，U/mL,U/L國際標準單位IU：25℃，每分鐘催化1umol底物所需酶量，umol/min.Kat:每秒鐘催化1mol底物所需酶量，mol/S比活力：U/mg蛋白第16頁/共69頁第16頁/共70頁酶激活劑能提高酶活性的物質金屬離子還原劑螯合劑激活酶原的蛋白酶特點：選擇性互相之間有拮抗或替代作用最適作用濃度第17頁/共69頁第17頁/共70頁生物緩沖系統(tǒng)生物化學反應的pH環(huán)境第18頁/共69頁第18頁/共70頁生物緩沖體系常見的共軛酸堿對磷酸二氫鹽磷酸磷酸氫鹽碳酸碳酸氫鹽H2PO4-=H++HPO42-H2CO3=H++HCO3-

第19頁/共69頁第19頁/共70頁pH緩沖區(qū)pK

(dissociationconstant)：解離常數(shù)inmammals,forexample,extracellularfluidsandmostcytoplasmiccompartmentshaveapHintherangeof6.9to7.4.第20頁/共69頁第20頁/共70頁氨基酸的酸堿性（帶電性）兼性離子質子供體：酸質子受體：堿兩性電解質(ampholyte)第21頁/共69頁第21頁/共70頁等電點（pI）Thetitrationcurveof0.1Mglycineat25degree.Theionicspeciespredominatingatkeypointsinthetitrationareshownabovethegraph.Theshadedboxes,centeredaboutpK1=2.34andpK2=9.60,indicatetheregionsofgreatestbufferingpower.

多元酸：隨溶液pH的變化可多次解離，攜帶凈電荷的狀態(tài)與溶液pH相關pI(isoeletricpoint):等電點，凈電荷為零時的溶液pH緩沖區(qū)域第22頁/共69頁第22頁/共70頁蛋白質的酸堿性質（電荷）第23頁/共69頁第23頁/共70頁蛋白質等電點第24頁/共69頁第24頁/共70頁蛋白質的等電點測定ThePrincipleofIsoelectricFocusing.ApHgradientisestablishedinagelbeforeloadingthesample.(A)Thesampleisloadedandvoltageisapplied.TheproteinswillmigratetotheirisoelectricpH,thelocationatwhichtheyhavenonetcharge.(B)Theproteinsformbandsthatcanbeexcisedandusedforfurtherexperimentation.第25頁/共69頁第25頁/共70頁等電聚焦（IEF）PH梯度的形成將一組兩性電解質混入電泳載體，電流通過時，等電點最小的兩性電解質在中性溶液介質中發(fā)生解離、帶負電荷，向正極方向泳動。當它泳動到陽極端支持物時，與正極溶液電離出來的H+中和失去電荷、停止泳動，這時緩沖容量大的載體兩性電解質就使周圍溶液的pH值等于其等電點PI1。同理，等電點稍大的兩性電解質也向正極泳動，當泳動到等電點最小的兩性電解質(PI1)陰極端時，就不能再向前泳動。如果穿過PI1區(qū)域，則第二種兩性電解質帶正電荷，反過來向陰極泳動。所以第二種電解質一定停留在pI1的陰極端，形成PI2區(qū)域。依次類推，經過適當時間的電泳后，兩性電解質將依等電點遞增的次序，在支持物中從正極排向負極，彼此互相銜接，形成一個個平滑穩(wěn)定的由正極向負極逐漸上升的pH梯度。第26頁/共69頁第26頁/共70頁電聚焦分離蛋白質的過程蛋白質是典型的兩性電解質物質。它所帶的電荷是隨著溶液酸堿度的變化而變化的。即在酸性溶液中帶正電荷，在堿性溶液帶負電荷。蛋白質在外加電場作用下或向正極、或向負極泳動。例如，當一個等電點為PIa的蛋白質置于具有從正極向負極逐漸遞增的穩(wěn)定、平滑pH梯度的支持物之陰極端時，因其堿性環(huán)境中，其帶負電荷，故在電場作用下將向正極泳動，當泳動到pH等于其PHa的區(qū)域時，泳動將停止。如果把此蛋白放在陽極端，則其帶正電荷，向負極泳動，最后也會泳動到其等電點相等的pH區(qū)域。第27頁/共69頁第27頁/共70頁因此，無論把蛋白質放在支持物的哪個位置上，在電場作用下都會聚焦在pH梯度間pH=pI的地方，這種行為聚焦作用。同上道理，如將等電點分別為pI1，pI2，….pIn的蛋白質混合物置于pH梯度支持物中，在電場作用下經過適當時間的電泳，其各組分將分別聚焦在支持物中pH等于各自等電點的區(qū)域，形成一個一個的蛋白質區(qū)帶，這既是電聚焦分離蛋白質的過程，也是等電點聚焦的基本原理。第28頁/共69頁第28頁/共70頁蛋白質的膠體性質雙極性大分子水化作用（氫鍵）膠體分散系統(tǒng)蛋白質溶液系統(tǒng)穩(wěn)定的三個要素：質點的范圍

（溫度）電荷（pH，重金屬）水化層（鹽離子強度，有機溶劑）第29頁/共69頁第29頁/共70頁第30頁/共69頁第30頁/共70頁第31頁/共69頁第31頁/共70頁個體、器官、組織第32頁/共69頁第32頁/共70頁材料的選擇與處理選擇原則：含量來源工藝、成本處理：冰凍干燥脫脂第33頁/共69頁第33頁/共70頁細胞破碎、生物分子抽提緩沖液的選擇離子強度：0.1-0.2MpH范圍：7.0-8.0最常使用的兩種緩沖液添加成分1、抗氧化劑：DTT，BME，Cys，GSH2、酶抑制劑：EDTA，蛋白酶抑制PMSF3、酶的輔因子或輔基4、植物細胞（酚類化合物）：PVP5、抗菌劑：NaN3第34頁/共69頁第34頁/共70頁破碎方法機械破碎法研磨法組織搗碎器法超聲波法壓榨法凍融法溶脹自溶化學法酶解法第35頁/共69頁第35頁/共70頁制定純化策略目標蛋白的性質穩(wěn)定性：溫度、pH溶解性帶電性大小疏水性親和配基第36頁/共69頁第36頁/共70頁純度的定義100%90%95%100%Pureenough!(目的、用途)Enoughisenough!考馬斯亮蘭染色一條帶銀染一條帶質譜一條帶（理想狀態(tài)）第37頁/共69頁第37頁/共70頁純化策略的制定第38頁/共69頁第38頁/共70頁純化策略的制定根據目標蛋白的特性，制定由粗到精，由分離效率低到分離效率高的純化路線特殊：親和層析制定快速有效的目標蛋白跟蹤方法（酶活性，抗原-抗體反應，其它方法）純度：SDS（染色方法）HPLC計算純化效率與產率第39頁/共69頁第39頁/共70頁建立檢測方法跟蹤目的分子專一、靈敏、方便光譜法吸收光譜熒光法活性法酶活性其他活性第40頁/共69頁第40頁/共70頁自動檢測及分部收集系統(tǒng)UV實時監(jiān)測器分部收集器第41頁/共69頁第41頁/共70頁1.酶活測定法：根據底物和產物的變化，用于檢測酶制劑如胃蛋白酶、胰蛋白酶等。2.配體結合能力測定：包括與蛋白、核酸的結合能力等，常見的是抗原-抗體反應（ELISA），用于檢測抗原或抗體或者其他的蛋白質。第42頁/共69頁第42頁/共70頁3.細胞試驗法：細胞生長的數(shù)量，蛋白、核酸的變化等定性或定量分析。3HTdR攝入法（細胞ＤＮＡ合成）MTT法（細胞的能量代謝，反應細胞生長狀態(tài)）第43頁/共69頁第43頁/共70頁4.Western-blottingSDSProteintransferringMembraneblottingSignaldetectionp21Rbp16p53pSer-15-p53tubulin第44頁/共69頁第44頁/共70頁ElectrophoreticAnalysisofaProteinPurification.ThepurificationschemeinTable4.1wasanalyzedbySDS.Eachlanecontained50μgofsample.Theeffectivenessofthepurificationcanbeseenasthebandfortheproteinofinterestbecomesmoreprominentrelativetootherbands.第45頁/共69頁第45頁/共70頁Table4.1.Quantificationofapurificationprotocolforafictitiousprotein

StepTotalprotein(mg)Totalactivity(units)Specificactivity,(unitsmg-1

Yield(%)PurificationlevelHomogenization15,000150,000101001Saltfractionation4,600138,00030923Ion-exchangechromatography1,278115,50090779Molecularexclusionchromatography68.875,0001,10050110Affinitychromatography1.7552,50030,000353,000第46頁/共69頁第46頁/共70頁純化方法第47頁/共69頁第47頁/共70頁沉淀法溶解度法鹽溶（saltin）與鹽析（saltout）常用作純化路線的第一步去除部分雜蛋白，穩(wěn)定目標蛋白簡單易行，均勻地加入第48頁/共69頁第48頁/共70頁中性鹽沉淀鹽析法應用最廣的還是在蛋白質領域，已有八十多年的歷史，其突出的優(yōu)點是：①成本低，不需要特別昂貴的設備。②操作簡單、安全。③對許多生物活性物質具有穩(wěn)定作用。第49頁/共69頁第49頁/共70頁鹽析法基本原理第50頁/共69頁第50頁/共70頁鹽析的操作方法固體法飽和溶液法透析法

硫酸銨濃度的表示方法是以飽和溶液的百分數(shù)表示，稱為百分飽和度。各種飽和度下需加固體硫酸銨的量可由表中查出。第51頁/共69頁第51頁/共70頁硫酸銨溶液飽和度計算表在25℃硫酸銨終濃度,%飽和度10202530333540455055606570758090100每1升溶液加固體硫酸銨的克數(shù)硫酸銨初濃度，%飽和度05611414417619620924327731335139043047251656166276710578611813715018321625128832636540644949459269420295978911231551902252623003403824245206192530496193125158193230267307348390485583301930629412716219823527331435644954633124374107142177214252292333426522353163941291642002381783194115064031639713216820524528537546945326599134171210250339431503366101137176214302392553367103141179264353603469105143227314653470107190275703572153237753611519880771579079第52頁/共69頁第52頁/共70頁鹽的分級沉淀確定分級沉淀的收集范圍蛋白質的性質（鹽析曲線的制作）得率的要求純度的要求成本計算第53頁/共69頁第53頁/共70頁鹽析曲線的制作第54頁/共69頁第54頁/共70頁若生物材料來源容易，選48%～65%鹽飽和分級范圍，純化倍數(shù)3.0，收率為75%；若生物材料來源較困難，則選擇45%～70%甚至45%～75%鹽飽和分級范圍，酶的收率可達80%以上，純化倍數(shù)將≤2.4。有時在鹽析沉淀時，需加1mmol/L的EDTA-Na2

鹽，以除去沉淀劑中帶入的金屬離子。加硫酸銨沉淀的時間要控制好，過長過短都不適宜，一般需要2h左右。第55頁/共69頁第55頁/共70頁脫鹽脫鹽柱透析法透析原理透析帶的處理透析體積比、時間脫鹽效果檢查第56頁/共69頁第56頁/共70頁Dialysis.Proteinmolecules(red)areretainedwithinthedialysisbag,whereassmallmolecules(blue)diffuseintothesurroundingmedium.第57頁/共69頁第57頁/共70頁第58頁/共69頁第58頁/共70頁透析的動力是擴散壓，擴散壓是由橫跨膜兩邊的濃度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶質在膜內外的濃度梯度，還正比于膜的面積和溫度，通常是4℃透析，升高溫度可加快透析速度。第59頁/共69頁第59頁/共70頁透析膜可用動物膜和玻璃紙等，但用的最多的還是用纖維素制成的透析膜、透析管。截留分子量（即留在透析袋內的生物大分子的最小分子量）。第60頁/共69頁第60頁/共70頁商品透析袋制成管狀，扁平寬度為23mm～50mm。為防干裂，用10％的甘油處理過，含有極微量的硫化物、重金屬和一些具有紫外吸收的雜質，對蛋白質和其它生物活性物質有害，用前須除去。可先用2%碳酸氫鈉和1mmol/LEDTA溶液煮沸10min，再用蒸餾水煮沸，冷卻后漂洗。處理后的透析袋可存于4℃蒸餾水中，若長時間不用，可加少量NaN3。使用時，通常要留三分之一至一半的空間。第61頁/共69頁第61頁/共70頁透析體積比、時間1:103hr1:20O/N脫鹽效果檢查檢查透析效果的方法是：用1％BaCl2檢查(NH4)2SO4，用1％AgNO3檢查NaCl、KCl等。第62頁/共69頁第62頁/共70頁有機溶劑沉淀法⑴基本原理有機溶劑沉淀法的優(yōu)點是：分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質或其它溶質只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內沉淀。沉淀不用脫鹽，過濾比較容易（如有必要，可用透析袋脫有機溶劑）。其缺點是對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進行。第63頁/共69頁第63頁/共70頁有機溶劑的選擇和濃度的計算

用于生化制備的有機溶劑的選擇首先是要能與水互溶。沉淀蛋白質和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀劑是乙醇。有機溶劑的濃度和體積可按下式計算：

V=V0(S2－S1)/(100－S2)

式中：V=需加入100％濃度有機溶劑的體積

V0=原溶液體積

S1=原溶液中有機溶劑的濃度

S2=所要求達到的有機溶劑的濃度

100是指加入的有機溶劑濃度為100％，如所加入的有機溶劑的濃度為95％，上式的(100－S2)項應改為(95－S2)。第64頁/共69頁第64頁/共70頁選擇性變性沉淀法

利用蛋白質、酶與核酸等生物大分子與非目的生物大分子在物理化學性質等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉淀而得到分離提純，稱為選擇性變性沉淀法。常用的有熱變性、選擇性酸堿變性和有機溶劑變性等。⑴熱變性⑵表面活性劑和有機溶劑變性⑶選擇性酸堿變性酵母干粉中加0.066mol/L磷酸氫二鈉溶液↓37℃水浴保溫2h↓室溫攪拌3h↓離心收集上清液↓升溫至55℃，保持20min后迅速冷卻↓離心去除熱變性蛋白↓為熱穩(wěn)定的醇脫氫酶溶液(上清液）第65頁/共69頁第65頁/共70頁等電點沉淀法有機聚合物沉淀法有機聚合物是六十年代發(fā)展起來