生物大分子相互作用

生物大分子相互作用第1頁(yè)/共98頁(yè)BAKERM.(2012).Proteomics:Theinteractionmap.Nature,484,271-5.互作組第2頁(yè)/共98頁(yè)蛋白與蛋白相互作用

蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)可以被表示成為一個(gè)無(wú)向圖，其中每個(gè)節(jié)點(diǎn)表示一個(gè)蛋白質(zhì)，每條邊表示一對(duì)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)之間的相互作用。有一些蛋白質(zhì)可以以單體的形式發(fā)揮作用，但是大部分的蛋白質(zhì)都是和伴侶分子或是與其他蛋白質(zhì)一起發(fā)揮作用的。第3頁(yè)/共98頁(yè)第4頁(yè)/共98頁(yè)通過神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿調(diào)節(jié)心肌收縮第5頁(yè)/共98頁(yè)我們體內(nèi)有些肽是細(xì)胞間的化學(xué)信號(hào)，控制著情緒、行為、壓力應(yīng)答、血壓、消化和癌癥發(fā)展。它們一般與細(xì)胞膜上的受體蛋白相互作用，例如G蛋白偶聯(lián)受體GPCR。GPCR負(fù)責(zé)將信息傳達(dá)到細(xì)胞內(nèi)的G蛋白，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生特定的細(xì)胞反應(yīng)。用藥物激活這類GPCR可以改善相關(guān)疾病的治療，不幸的是這類藥物的研發(fā)特別困難，其中有部分原因就是缺少結(jié)合狀態(tài)或激活狀態(tài)的結(jié)構(gòu)信息。HAUSCHF,HOLSBOERF.(2012).Structuralbiology:Snapshotofanactivatedpeptidereceptor.Nature.第6頁(yè)/共98頁(yè)蛋白質(zhì)間的相互作用力蛋白質(zhì)內(nèi)部：肽鍵蛋白質(zhì)間：非共價(jià)鍵

氫鍵范德華力疏水鍵離子鍵第7頁(yè)/共98頁(yè)DNA與蛋白質(zhì)相互作用第8頁(yè)/共98頁(yè)組蛋白與非組蛋白真核的染色體是由DNA與組蛋白（histoneproteins）、非組蛋白(nonhistoneproteins，NHP)構(gòu)成的復(fù)合物?；蜣D(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)最終必定涉及特殊DNA的核苷酸序列，這些序列可被相應(yīng)的調(diào)節(jié)物分子所識(shí)別第9頁(yè)/共98頁(yè)第10頁(yè)/共98頁(yè)第11頁(yè)/共98頁(yè)非組蛋白的調(diào)節(jié)功能非組蛋白特異調(diào)節(jié)作用的的證據(jù)來自染色質(zhì)重建實(shí)驗(yàn)。一個(gè)細(xì)胞的染色體可以解離成DNA，組蛋白和非組蛋白三種組份。來自不同類型染色質(zhì)組份能夠重新建成染色質(zhì)。若將無(wú)轉(zhuǎn)錄活性細(xì)胞中的DNA、組蛋白與具有轉(zhuǎn)錄活性細(xì)胞中的非組蛋白相混合，將會(huì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活性第12頁(yè)/共98頁(yè)第13頁(yè)/共98頁(yè)第14頁(yè)/共98頁(yè)第15頁(yè)/共98頁(yè)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控順式作用元件和反式作用因子：

(1)核心啟動(dòng)子成分，如TATA框；

(2)上游啟動(dòng)子分，如CAAT框,GC框;(3)遠(yuǎn)上游順序：如增強(qiáng)子，減弱子、靜息子,酵母的UAS

（upstreamactivatorsequences）等。

(4)特殊細(xì)胞中的啟動(dòng)子成分：如淋巴細(xì)胞中的Oct(octamer）和κB。第16頁(yè)/共98頁(yè)第17頁(yè)/共98頁(yè)第18頁(yè)/共98頁(yè)第19頁(yè)/共98頁(yè)增強(qiáng)子(transcriptionalenhancer)：是真核生物基因轉(zhuǎn)錄中另一種順式調(diào)控元件，常位于啟動(dòng)子上游700－1000bp處，離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)較遠(yuǎn)，可提高轉(zhuǎn)錄效率。第20頁(yè)/共98頁(yè)第21頁(yè)/共98頁(yè)

反式作用因子可以分為3類；

(1)

通用反式作用因子，，主要識(shí)別啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)成分，如TBP；（2）特殊組織與細(xì)胞中的反式作用因子，如淋巴細(xì)胞中的Oct-2；（3）和反應(yīng)性元件（responseelenents）相結(jié)合的反式作用因子。如HSE（熱休克反應(yīng)元件，heatshockresponseelement），

GRE（糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件glucocorticoidresponseelement）；

MRE（金屬反應(yīng)元件，metalresponseelement）；

TRE（腫瘤誘導(dǎo)劑反應(yīng)元件，tumorgenicagentresponseelement);第22頁(yè)/共98頁(yè)(一)蛋白質(zhì)直接和DNA結(jié)合1.

螺旋轉(zhuǎn)角螺旋（Helix-turn-helix,

HTH）：如LacO的R蛋白，λ的CI，Cro蛋白，涉及酵母交配型的a1和a2蛋白。真核生物中的Oct-1和Oct-2；2.鋅指結(jié)構(gòu)（zincfimger）單個(gè)的鋅指保守序列是：Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X2-HisⅠ型:2Cys/2His:TFIIIA,SP1Ⅱ型:2cys/2cys:GAL4

第23頁(yè)/共98頁(yè)第24頁(yè)/共98頁(yè)第25頁(yè)/共98頁(yè)3.亮氨酸拉鏈（Leucineziipper）同二聚體（honwdimers）異二聚體（hefercdimers）

C-Jun,C-Fos,Myc,4.螺旋一環(huán)一螺旋（HLH）在HLH中帶有堿性區(qū)的肽鏈稱為堿性HLH（bHLH，protein）。bHLH又分為兩類。

A類是可以廣泛表達(dá)的蛋白，包括哺乳動(dòng)物的E12/E47（可和免疫球蛋基因增強(qiáng)子中的元件結(jié)合）和果蠅da（daughterless,性別控制的總開關(guān)基因）的產(chǎn)物；

B類是組織特異性表達(dá)的蛋白，包括哺乳動(dòng)物的MyoD(肌漿蛋白（myogen）基因的轉(zhuǎn)錄因子果蠅的AC-S（achaete-scute無(wú)剛毛基因的產(chǎn)物）第26頁(yè)/共98頁(yè)第27頁(yè)/共98頁(yè)第28頁(yè)/共98頁(yè)

5．同源異形結(jié)構(gòu)域（Homeodomains，HD）是一種編碼60aa的序列，長(zhǎng)180bp，它存在于很多控制果蠅早期發(fā)育基因中，在高等生物中也發(fā)現(xiàn)了相關(guān)基序。

HD的C-端區(qū)域和原核阻遏蛋白的HTH同源，但也有幾點(diǎn)不同:（1）HD的C端由3個(gè)α-螺旋構(gòu)成，螺旋3結(jié)合于大溝，長(zhǎng)17aa；而阻遏蛋白由5個(gè)α-螺旋構(gòu)成，螺旋3長(zhǎng)僅9個(gè)aa；（2）原核的HTH的以二聚體形式與DNA結(jié)合，靶序列是回文結(jié)構(gòu)，而HD是以單體形式與DNA結(jié)合，靶序列不是回文結(jié)構(gòu)；（3）HDN-端的臂位于小溝，而HTH螺旋1的末端與DNA的背面接觸。

第29頁(yè)/共98頁(yè)第30頁(yè)/共98頁(yè)（二）蛋白質(zhì)和配基的結(jié)合甾類受體蛋白一般都具有3個(gè)不同的功能區(qū)：（1）N-端區(qū)是激活轉(zhuǎn)錄所需的區(qū)域，不同受體之間此區(qū)的同一性僅小于15%；（2）DNA結(jié)合及轉(zhuǎn)錄活化區(qū)，同一性較高為94-42%；（3）C-端的激素結(jié)合和二聚體形成區(qū)，同一性為57-15%。第31頁(yè)/共98頁(yè)第32頁(yè)/共98頁(yè)第33頁(yè)/共98頁(yè)第34頁(yè)/共98頁(yè)噬菌體展示酵母雙雜交技術(shù)免疫共沉淀染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)表面等離子共振熒光共振能量轉(zhuǎn)移串聯(lián)親和純化生物大分子相互作用研究方法第35頁(yè)/共98頁(yè)蛋白相互作用酵母雙雜交系統(tǒng)噬菌體展示免疫共沉淀

第36頁(yè)/共98頁(yè)酵母雙雜交系統(tǒng)第37頁(yè)/共98頁(yè)基本原理典型的真核生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子，如GAL4、GCN4、等都含有二個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域:DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-bindingdomain)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activatingdomain)。前者可識(shí)別DNA上的特異序列，并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用，啟動(dòng)它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。第38頁(yè)/共98頁(yè)動(dòng)畫將編碼某一蛋白X的DNA序列與DNA結(jié)合域BD的編碼序列融合形成一個(gè)雜交體，將編碼另一蛋白Y的DNA序列與DNA激活域AD的編碼序列融合形成另一個(gè)雜交體，當(dāng)兩個(gè)雜交體共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞（此酵母細(xì)胞上游有DNA結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因），若X和Y沒有相互作用，則單獨(dú)不能激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄；若X和Y可相互作用，則使BD和AD靠近形成一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄激活子，激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。因此可通過檢測(cè)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄來研究蛋白質(zhì)X和Y的相互作用第39頁(yè)/共98頁(yè)

1）已知蛋白之間相互作用的檢測(cè)：2）蛋白質(zhì)的功能域研究：通過對(duì)其中某一個(gè)蛋白質(zhì)作缺失或定點(diǎn)突變，再用此系統(tǒng)檢測(cè)是否還存在相互作用，可闡明其功能域或關(guān)鍵氨基酸；3）克隆新基因和新蛋白：將感興趣的蛋白質(zhì)基因與BD基因構(gòu)建成“誘餌”表達(dá)質(zhì)粒，將某一器官或組織的cDNA文庫(kù)與AD基因構(gòu)建成“獵物”基因庫(kù)，共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，可篩到與感興趣蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的cDNA序列，并推測(cè)其蛋白質(zhì)序列。

用途第40頁(yè)/共98頁(yè)優(yōu)點(diǎn)

蛋白--蛋白相互作用是細(xì)胞進(jìn)行一切代謝活動(dòng)的基礎(chǔ)。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立為研究這一問題提供了有利的手段和方法。大規(guī)模篩選操作簡(jiǎn)單，直觀（可以用熒光做報(bào)告基因，也可以用氨基酸缺陷型平板篩選等）第41頁(yè)/共98頁(yè)缺點(diǎn)1、它并非對(duì)所有蛋白質(zhì)都適用，這是由其原理所決定的。雙雜交系統(tǒng)要求兩種雜交體蛋白都是融合蛋白，都必須能進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。因?yàn)槿诤系鞍紫嗷プ饔眉せ顖?bào)告基因轉(zhuǎn)錄是在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生的。2、假陽(yáng)性的發(fā)生較為頻繁。所謂假陽(yáng)性，即指未能與誘餌蛋白發(fā)生作用而被誤認(rèn)為是陽(yáng)性反應(yīng)的蛋白。而且部分假陽(yáng)性原因不清，可能與酵母中其他蛋白質(zhì)的作用有關(guān)。3、在酵母菌株中大量表達(dá)外源蛋白將產(chǎn)生毒性作用，從而影響菌株生長(zhǎng)和報(bào)告基因的表達(dá)。第42頁(yè)/共98頁(yè)噬菌體展示技術(shù)一種基因表達(dá)產(chǎn)物和親和選擇相結(jié)合的技術(shù)以改構(gòu)的噬菌體為載體，把待選基因片段定向插入噬菌體外殼蛋白質(zhì)基因區(qū)，使外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)并展示于噬菌體表面，進(jìn)而通過親和富集法表達(dá)有特異肽或蛋白質(zhì)的噬菌體.廣泛應(yīng)用于蛋白組學(xué)、基因克隆等多個(gè)分子生物學(xué)領(lǐng)域第43頁(yè)/共98頁(yè)第44頁(yè)/共98頁(yè)噬菌體展示的基本原理

(1)在pⅢ和pⅧ衣殼蛋白的N端插入外源基因，形成的融合蛋白表達(dá)在噬菌體顆粒的表面，不影響和干擾噬菌體的生活周期，同時(shí)保持的外源基因天然構(gòu)象，也能被相應(yīng)的抗體或受體所識(shí)別；(2)利用固定與固相支持物的靶分子，采用適當(dāng)?shù)奶韵?panning)方法，洗去非特異結(jié)合的噬菌體，篩選出目的噬菌體；(3)外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)在噬菌體的表面，而其編碼基因作為病毒基因組中的一部分可通過分泌型噬菌體的單鏈DNA測(cè)序推導(dǎo)出來.第45頁(yè)/共98頁(yè)第46頁(yè)/共98頁(yè)噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用噬菌體隨機(jī)多肽文庫(kù)噬菌體抗體庫(kù)蛋白質(zhì)的定向改造cDNA文庫(kù)的表達(dá)篩選應(yīng)用噬菌體展示，可合成、篩選到許多我們想要的蛋白（如融合肽、抗體、酶），這些蛋白具有預(yù)期的催化特性或結(jié)合親和力，或者具有用于胞內(nèi)、胞外診斷、人體疾病免疫治療和生物催化作用時(shí)所需的特異性。第47頁(yè)/共98頁(yè)噬菌體展示技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)高通量的淘選可用于模擬表位的篩選易于純化第48頁(yè)/共98頁(yè)高通量的淘選

將靶標(biāo)分子（抗體）固定在固相載體上，加入噬菌體展示肽庫(kù)，利用抗原-抗體的特異性親和力將與抗體結(jié)合的噬菌體吸附在固相載體上，不能結(jié)合的噬菌體仍在溶液中，可以通過洗滌去除，再將特異結(jié)合的噬菌體洗脫下來，如此反復(fù)數(shù)輪擴(kuò)增、淘選，即可將有用的基因從多達(dá)百萬(wàn)以上的噬菌體克隆中分離出來。第49頁(yè)/共98頁(yè)可用于模擬表位的篩選

利用噬菌體展示技術(shù)得到模擬表位的報(bào)道較多李全喜等（1997）利用單抗9E10篩選噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)，結(jié)果獲得了兩個(gè)陽(yáng)性克隆，其中一個(gè)與抗原天然序列同源，而另一個(gè)則完全不同（即為模擬表位）。模擬表位同樣可誘發(fā)與天然表位相似的特異性免疫反應(yīng)，例如利用乙肝病毒的模擬表位免疫小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的乙肝病毒抗體。第50頁(yè)/共98頁(yè)易于純化

重組噬菌體的純化步驟簡(jiǎn)單、不要求昂貴的試劑與設(shè)備，在一般的實(shí)驗(yàn)室條件下就可以完成。目前用于鑒定表位和受體所用的噬菌體載體為M13單鏈?zhǔn)删w。由于M13噬菌體是溫和型噬菌體，不裂解宿主菌，成熟的噬菌體可分泌到培養(yǎng)基中，通過離心收集培養(yǎng)上清，再向其中加入沉淀劑即可將上清中大量噬菌體粒子沉淀下來，從而富集得到含外源基因產(chǎn)物的重組噬菌體。第51頁(yè)/共98頁(yè)用抗體將相應(yīng)特定分子沉淀的同時(shí)，與該分子特異性結(jié)合的其他分子也會(huì)被帶著一起沉淀出來的技術(shù)。這種技術(shù)常用于驗(yàn)證蛋白質(zhì)之間相互特異性結(jié)合。免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）缺點(diǎn)：可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用第52頁(yè)/共98頁(yè)通過質(zhì)譜確定捕獲的蛋白第53頁(yè)/共98頁(yè)應(yīng)用通常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合產(chǎn)生相互作用。用于驗(yàn)證確定某種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。第54頁(yè)/共98頁(yè)注意的問題1）細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或TritonX-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗(yàn)確定。

不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktailer。2）使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用3）使用對(duì)照抗體：?jiǎn)慰寺】贵w：正常小鼠的IgG或另一類單抗兔多克隆抗體：正常兔IgG

第55頁(yè)/共98頁(yè)優(yōu)點(diǎn)

Co-IP是檢測(cè)蛋白質(zhì)間相互作用的經(jīng)典方法，在此方法中,蛋白質(zhì)及復(fù)合物均以天然狀態(tài)存在，符合體內(nèi)實(shí)際情況，能更真實(shí)的反映出蛋白質(zhì)間的相互作用情況，得到的蛋白可信度高第56頁(yè)/共98頁(yè)局限性1）可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用。2）不能給出動(dòng)態(tài)的結(jié)果，同時(shí)也還應(yīng)該排除細(xì)胞在破碎時(shí)導(dǎo)致本來沒有相互作用的蛋白質(zhì)發(fā)生凝聚的可能性3）所得的蛋白質(zhì)有可能不是直接相互作用的蛋白質(zhì),而是通過第三者間接相互作用的蛋白質(zhì)第57頁(yè)/共98頁(yè)利用免疫共沉淀（CO-IP）技術(shù)、酶聯(lián)免疫（ELISA）都可以研究抗原和抗體之間的相互作用，但是，它們都是基于體外非細(xì)胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。而在細(xì)胞體內(nèi)的抗原和抗體的聚積反應(yīng)則可以通過酵母雙雜交進(jìn)行檢測(cè)，從而在活細(xì)胞的水平上檢測(cè)抗原和抗體的免疫反應(yīng)。第58頁(yè)/共98頁(yè)凝膠阻滯分析

（GelshiftAssay）染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)

（ChromatinImmunoprecipitation（ChIP））DNA與蛋白相互作用第59頁(yè)/共98頁(yè)凝膠阻滯分析（GelshiftAssay，ElectrophoreticMobilityShiftAssay（EMSA））該方法用來研究DNA與特異性蛋白的相互作用，通常是放射性標(biāo)記的DNA片段與純化蛋白，或提取物中的蛋白混合物相結(jié)合，然后在非變性凝膠中分析該產(chǎn)物。與游離DNA相比，蛋白-DNA復(fù)合物的遷移率將降低，因此，與游離DNA相對(duì)應(yīng)，人們將觀察到帶中的“阻滯”。第60頁(yè)/共98頁(yè)第61頁(yè)/共98頁(yè)ChIP染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的原理是：在生理狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，通過超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)一般包括細(xì)胞固定，染色質(zhì)斷裂，染色質(zhì)免疫沉淀，交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)，DNA的純化，以及DNA的鑒定。第62頁(yè)/共98頁(yè)該技術(shù)主要應(yīng)用于：

1.組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系2.轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析

3.藥物開發(fā)研究

第63頁(yè)/共98頁(yè)基本的實(shí)驗(yàn)步驟以及需要注意的問題1.細(xì)胞固定

甲醛能有效的使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-DNA，蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián)，形成生物復(fù)合體，防止細(xì)胞內(nèi)組分的重新分布。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)是完全可逆的，便于在后續(xù)步驟中對(duì)DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%，交聯(lián)時(shí)間通常為5分鐘到1個(gè)小時(shí)，具體時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)而定。值得注意的是，交聯(lián)時(shí)間如果過長(zhǎng)，細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響ChIP結(jié)果，而且實(shí)驗(yàn)材料也容易在離心過程中丟失。交聯(lián)時(shí)間如果過短，則交聯(lián)不完全，產(chǎn)生假陰性。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)可被加入的甘氨酸終止第64頁(yè)/共98頁(yè)2.染色質(zhì)斷裂交聯(lián)后的染色質(zhì)可被超聲波或MicrococcalNuclease切成400~600bp的片段（用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)），以便暴露目標(biāo)蛋白，利于抗體識(shí)別。超聲波是使用機(jī)械力斷裂染色質(zhì)，容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫，這都會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而影響ChIP的效率。所以在超聲波斷裂染色質(zhì)時(shí)，要在冰上進(jìn)行，且要設(shè)計(jì)時(shí)斷時(shí)續(xù)的超聲程序，保證低溫。另外，超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側(cè)壁，以免產(chǎn)生泡沫。總超聲時(shí)間也不要太長(zhǎng)，以免蛋白降解。第65頁(yè)/共98頁(yè)3.染色質(zhì)免疫沉淀

Input對(duì)照Beads選擇抗體選擇陽(yáng)性與陰性對(duì)照第66頁(yè)/共98頁(yè)4.交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)和DNA的純化用不含DNase的RNase和ProteinaseK，65度保溫6小時(shí)逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，經(jīng)DNA純化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化DNA。第67頁(yè)/共98頁(yè)5DNA的鑒定方法半定量PCR和Real-timePCR第68頁(yè)/共98頁(yè)CHIPonChip將基因組DNA芯片（chip）技術(shù)與染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（ChIP）相結(jié)合第69頁(yè)/共98頁(yè)ChipSeq第70頁(yè)/共98頁(yè)第71頁(yè)/共98頁(yè)由于ChIP-Seq的數(shù)據(jù)是DNA測(cè)序的結(jié)果，為研究者提供了進(jìn)一步深度挖掘生物信息的資源，研究者可以在以下幾方面展開研究：

（1）判斷DNA鏈的某一特定位置會(huì)出現(xiàn)何種組蛋白修飾；

（2）檢測(cè)RNApolymeraseII及其它反式因子在基因組上結(jié)合位點(diǎn)的精確定位；

（3）研究組蛋白共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系；

（4）CTCF轉(zhuǎn)錄因子研究。第72頁(yè)/共98頁(yè)第73頁(yè)/共98頁(yè)表面等離子共振(SPR)實(shí)時(shí)分析，簡(jiǎn)便快捷地監(jiān)測(cè)DNA與蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)分子之間以及藥物—蛋白質(zhì)、核酸—核酸、抗原—抗體、受體—配體等等生物分子之間的相互作用，在生命科學(xué)、醫(yī)療檢測(cè)、藥物篩選、食品檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、毒品檢測(cè)、法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用需求。第74頁(yè)/共98頁(yè)表面等離子共振原理1.消逝波2.等離子波3.SPR的光學(xué)原理第75頁(yè)/共98頁(yè)1.消逝波當(dāng)光從光密介質(zhì)入射到光疏介質(zhì)時(shí)（n1>n2）就會(huì)有全反射現(xiàn)象的產(chǎn)生。n1sinθ1=n2sinθ2菲涅爾定理：密疏密疏第76頁(yè)/共98頁(yè)1.消逝波這表示沿X軸方向傳播而振幅衰減的一個(gè)波，這就是消逝波。全反射的光波會(huì)透過光疏介質(zhì)約為光波波長(zhǎng)的一個(gè)深度，再沿界面流動(dòng)約半個(gè)波長(zhǎng)再返回光密介質(zhì)。光的總能量沒有發(fā)生改變。透入光疏介質(zhì)的光波成為消逝波。界面疏密第77頁(yè)/共98頁(yè)2.等離子波

等離子體

等離子體通常是指由密度相當(dāng)高的自由正、負(fù)電荷組成的氣體，其中正、負(fù)帶電粒子數(shù)目幾乎相等。

金屬表面等離子波

把金屬的價(jià)電子看成是均勻正電荷背景下運(yùn)動(dòng)的電子氣體，這實(shí)際上也是一種等離子體。由于電磁振蕩形成了等離子波。第78頁(yè)/共98頁(yè)SPR光學(xué)原理光在棱鏡與金屬膜表面上發(fā)生全反射現(xiàn)象時(shí)，會(huì)形成消逝波進(jìn)入到光疏介質(zhì)中，而在介質(zhì)（假設(shè)為金屬介質(zhì)）中又存在一定的等離子波。當(dāng)兩波相遇時(shí)可能會(huì)發(fā)生共振。第79頁(yè)/共98頁(yè)SPR光學(xué)原理當(dāng)消逝波與表面等離子波發(fā)生共振時(shí)，檢測(cè)到的反射光強(qiáng)會(huì)大幅度地減弱。能量從光子轉(zhuǎn)移到表面等離子，入射光的大部分能量被表面等離子波吸收，使得反射光的能量急劇減少。第80頁(yè)/共98頁(yè)SPR光學(xué)原理可以從反射光強(qiáng)的響應(yīng)曲線看到一個(gè)最小的尖峰，此時(shí)對(duì)應(yīng)的入射光波長(zhǎng)為共振波長(zhǎng)，對(duì)應(yīng)的入射角為SPR角。SPR角隨金表面折射率變化而變化，而折射率的變化又與金表面結(jié)合的分子質(zhì)量成正比。這就是SPR對(duì)物質(zhì)結(jié)合檢測(cè)的基本原理。第81頁(yè)/共98頁(yè)SPR的響應(yīng)模式第82頁(yè)/共98頁(yè)Biacore3000的光學(xué)系統(tǒng)第83頁(yè)/共98頁(yè)傳感芯片——分子敏感膜成膜方法：金屬膜直接吸附法共價(jià)連接法（生物素-親和素、葡聚糖凝膠、水凝膠、高分子膜、多肽等）單分子復(fù)合膜法分子印膜技術(shù)第84頁(yè)/共98頁(yè)展望未來如今，SPR技術(shù)已被廣泛地用來分析生物分子第85頁(yè)/共98頁(yè)MainAdvantages實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)無(wú)需標(biāo)記樣品樣品需要極少

檢測(cè)過程方便快捷，靈敏度較高應(yīng)用范圍廣泛-第86頁(yè)/共98頁(yè)Disadvantages傳感曲線經(jīng)常不符合假一級(jí)動(dòng)力學(xué)多價(jià)結(jié)合多步結(jié)合反應(yīng)空間位阻效應(yīng)配體或者分析物的不均一擴(kuò)散速度限制重結(jié)合現(xiàn)象第87頁(yè)/共98