病毒學研究方法簡介課件

第八章

病毒學研究方法簡介生物安全實驗室P1實驗室——研究的病毒危險性較低，試驗人員連口罩都不用帶，穿上白大褂就可以了，試驗人員在這里很放松；P2實驗室——研究的是中度危險的病原，像肝炎、流行性感冒等等，要求戴防護性較好的口罩；P3實驗室——研究的是高度危險的病毒，傳染性很強，而且沒有疫苗，試驗人員的保護措施要比P1/P2實驗室嚴密得多；P4實驗室——全球級別最高的生物安全實驗室，研究的是極度危險的病毒，如令人談之色變的埃博拉病毒、馬爾堡病毒，進入這種實驗室的工作人員，處于防護服的嚴密保護之下，連空氣都不能在實驗室內呼吸，紅色螺旋狀管子，是專門用來向室內輸送新鮮空氣的，試驗人員一進入實驗室，要先屏住呼吸，馬上接上這種管子，然后才能呼吸。根據微生物及其毒素的危害程度不同，分為４級，一級最低，四級最高。

病毒學研究的主要方法生物學特性測定:在寄主上的反應——癥狀、傳播等病毒分離與培養(yǎng)：提純與純化、二元培養(yǎng)法光鏡與電鏡觀察：病毒粒子和病毒與相應抗血清的特異免疫吸附情況免疫學技術：以血清學和組織免疫化學方法檢測材料帶毒情況、多克隆抗體、單克隆抗體分子生物學技術：核酸分子雜交、PCR等巨細胞病毒感染細胞的典型“貓頭鷹眼”樣核內包涵體冠狀病毒感染——“非典”X線胸部檢查可見肺部不同程度的片狀陰影，少數病人進展迅速，呈大片狀陰影，大多數為雙側改變，陰影吸收消散較慢。

斑駁Mottle脈明癥Vein-clearing條斑Leafstreak腿色斑駁Chloroticmottleyellowdwarf變色seedcoatmottling郁金香碎錦花葉病

花變色—碎色癥colorbreaking、花瓣變綠virescence雜色花郁金香、香石竹、紫羅蘭、虞美人、唐菖蒲Materials:gloves,sterilecottonswabs,rinsebottle,tissuegrindingbagsandcarborundum-siliconcarbidewhichisusedasatissueabrasive2Plantsapismadefromtheplanttobetestedforvirusbypullingoffasymptomaticupperleaf3placingtheleafinasterileplasticbag.addingbuffersolutiontothebag.grindtheleaftissuetoreleasethevirusparticlesintothebuffer.4inoculatetheindicatorplant,acottonswabisimmersedinplantsaprubthesurfaceofthetestplantleaffirmly,butnotwithenoughforcetoteartheleaf67rinseoffthecarborundum

excesssapfromtheleafwithwatertoremovecompoundsthatcouldinterferewiththeinfectionprocess8Theindicatorplantsareplacedinthegreenhouseandcheckeddailyforsymptoms.Ifcharacteristicsymptomsappear,weknowthatvirusparticleswerepresent

要證明某種疾病是某一感染因子所引起．則必須滿足Rivers法則：①從患病者體內分離出病毒；②在實驗動物或寄主細胞中可以培養(yǎng)；③證明這種培養(yǎng)物具有濾過性；④在原始宿主或相關種內能產生同樣的病癥；⑤能重新分離出病毒。病毒的分離與鑒定組成了病毒學診斷技術的主體。病毒分離(virusisolation)是診斷病毒感染的“金標準”(goldstandard)。二、病毒的分離與培養(yǎng)標本采集和運送時間：發(fā)病早期部位：視發(fā)病規(guī)律和病程而定運送：立即送檢4℃保存或-70℃（長期保存）不泄漏、傳播、填寫詳細標簽分離與鑒定：二、病毒的分離與培養(yǎng)二、病毒的分離與培養(yǎng)提純extraction/純化purification

二元培養(yǎng)法混合感染的病毒分離1、根據病毒的性狀、選擇不同的寄主或根據病毒鈍化溫度和稀釋終點的差異，如：

PVX—在千日紅上引起局部病斑PVY—在酸漿草上形成局部病斑，蔓陀羅對PVY免疫TMV鈍化溫度90℃以上CMV鈍化溫度在60~70℃（汁液接種前高溫處理….)2、蟲媒傳染：

PVX不可由蟲媒傳，PVY可由桃蚜傳不同種的蟲媒或獲毒飼育時間和持久性的長短3、果樹等木本植物病毒，如找到草本寄主和傳毒蟲媒可用草本寄主純化、繁殖、分離二、病毒的分離與培養(yǎng)病毒純化中的必要參考屬性：1.稀釋限點(dilutionendpoint,

DEP)抽提液稀釋到最后一個尚有侵染力的稀釋度2.鈍化溫度(thermalinactivationpoint,TIP)病毒在未加處理的抽提液中，在某一溫度時暴露10min而達到完全鈍化3.體外存活期(L)病毒在抽提液中放在20~22℃條件下，能保持多少時間的侵染力。4.沉降系數與分子量沉降系數S在20℃下1達因的引力場中的沉降的速度（cm/s)常用1000×，植物病毒在50~幾千S二、病毒的分離與培養(yǎng)1、差速離心和密度梯度離心

差速離心：交替使用高速和低速離心高速離心（40000~80000g）使病毒沉淀，取沉淀低速離心（約4000g）僅去除大的細胞碎片等雜質，取上清

密度梯度離心：部分或完全根據顆粒在一個無對流介質中的密度而獲得分離蔗糖10%~40%CsCl等（三）病毒提純的技術二、病毒的分離與培養(yǎng)

2、沉淀法

簡便快速但粗糙易變性鹽析法

硫酸銨濃度達30~50%飽和度時多數病毒沉淀等電點沉淀

加醋酸或鹽酸丙酮沉淀

濃度達40~70%聚乙二醇沉淀

濃度達4~8%乙醇沉淀

濃度達20%沉淀植物蛋白，上清夜用硫酸銨沉淀3、吸附法磷酸鈣、離子交換樹脂、羧甲基纖維素4、酶處理

許多病毒抗蛋白酶和核酸酶（三）病毒提純的技術二、病毒的分離與培養(yǎng)5、有機溶劑萃取有機溶劑可溶掉脂肪、有色雜質或非病毒的變性蛋白，如脊髓灰質炎病毒提純中用正丁醇：要考慮病毒對有機溶劑的耐受性（三）病毒提純的技術脂肪變性非病毒蛋白病毒水醇二、病毒的分離與培養(yǎng)6、電泳法普通電泳、密度梯度電泳、等電聚焦電泳等7、柱層析法吸附：用離子交換或吸附法分子篩：瓊脂糖或葡聚糖制成凝膠柱8、抗血清處理針對寄主蛋白的血清來沉淀雜蛋白加病毒的抗血清形成病毒—抗體復合物（三）病毒提純的技術二、病毒的分離與培養(yǎng)硫酸銨沉淀法（四）植物病毒提純舉例1PVX病植株汁液澄清的汁液+飽和硫酸銨2：1去上清，沉淀懸浮在生理鹽水或buffer靜置30min11500g離心10min流水透析2h，buffer或生理鹽水透析1夜3800g離心10min，去雜質也可低速離心提純的病毒懸液可直接使用，也可進一步重復沉淀提純棄沉淀，上層即為提純的病毒懸液超速離心法（四）植物病毒提純舉例2CMV病葉+buffer+巰基乙酸，勻漿500g離心15min，留上清液80000g離心30min,留沉淀+緩沖液澄清液+聚乙二醇，溶解后靜置30min（沉淀病毒）低速離心10min（5000g)保留上清液超速離心150min(75000g)留沉淀，緩沖液懸浮15000g離心20min,保留上清液上清液即為提純的病毒懸液，也可重復進一步提純動物培養(yǎng)雞胚培養(yǎng)組織培養(yǎng)原代細胞：新鮮組織+胰蛋白酶消化，分散+培養(yǎng)液成——單層細胞二倍體細胞株：原代細胞傳代（為二倍體細胞）傳代細胞系：腫瘤組織或二倍體細胞自發(fā)轉化（非整倍體）動物病毒的培養(yǎng)二、病毒的分離與培養(yǎng)病毒學研究的主要方法生物學特性測定:在寄主上的反應——癥狀、傳播等病毒分離與培養(yǎng)：提純與純化、二元培養(yǎng)法光鏡與電鏡觀察：病毒粒子和病毒與相應抗血清的特異免疫吸附情況免疫學技術：以血清學和組織免疫化學方法檢測材料帶毒情況、多克隆抗體、單克隆抗體分子生物學技術：核酸分子雜交、PCR等標本制備濃縮標本有以下幾種方法：①超速離心離心的時間和速度取決于病毒顆粒的大小和離心機轉頭的半徑，一般是30min到3h．沉淀的樣本用滅菌蒸餾水洗后再放到銅網上；②超過濾法用于分子篩的蛋白質相對分子質量為10000；③接種細胞接種細胞增殖病毒，然后快速包埋、切片；④免疫凝集如有特異抗血清，且病毒已知，也可用該法濃縮病毒三、病毒的光鏡與電鏡觀察法光鏡：寄主組織切片、包含體三、病毒的電鏡觀察法1、正染法（超薄切片法、病組織）將細胞用戊二醛固定，然后脫水、包埋、切片、染色、觀察病毒顆粒，通常1~2d完成。操作復雜、費時，但樣品可長期保存，可觀察病毒粒子形態(tài)與發(fā)生過程。2、負染法直接將病毒懸液(也可用細胞)滴在銅網上，用重金屬(通常用磷鎢酸)進行染色，觀察病毒顆粒，10-20min可出結果。原理：負性染料不滲入病毒顆粒，而是將病毒顆粒包繞，由于負性染料含重金屬使電子束不能穿透，病毒顆粒具有亮度，在周圍暗背景上顯示亮區(qū)——較正染法顯示的圖像清晰，可顯示病毒的結構。缺點：敏感性低，要求病毒量在107／mL以上，同科病毒難于鑒別。3、投影技術4、膠體金標記技術、與免疫學技術結合等采用幾種電鏡技術觀察病毒粒子的形態(tài)Orfvirus：口瘡病毒(接觸性膿皰皮炎)Ebolavirus埃博拉病毒（正染技術）Vacciniavirus痘苗病毒（投影技術）負染技術美國疾病控制和預防中心公布的一張未標明日期的彩色電子顯微照片。它顯示出H5N1型禽流感病毒（金黃色）在MDCK細胞（綠色）培養(yǎng)液中的活動狀態(tài)電鏡技術的應用研究病毒形態(tài)、鑒定

觀察病毒的形態(tài)及形態(tài)發(fā)生學過