克隆基因的表達課件

第六章

克隆基因的表達遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞過程——中心法則（centraldogma）。

（一）、基因表達：（二）克隆基因的表達：外源基因在宿主細胞中表達。外源基因表達載體重組載體導入宿主細胞在宿主細胞中表達出蛋白質(zhì)提取蛋白宿主細胞：原核細胞或真核細胞。一、外源基因表達機制P169（一）外源基因的起始轉(zhuǎn)錄啟動子和相關調(diào)控序列的作用增強子衰減子等（二）mRNA的延伸與穩(wěn)定性mRNA有效延伸、終止、穩(wěn)定性是表達關鍵。Prok.

：終止子結(jié)構：（不）依賴ρ；避免提前終止：衰減子；

RNase缺失受體菌Eur.：poly(A)摻入位點AAUAA；加工成熟mRNA（四）表達蛋白在細胞中的穩(wěn)定性構建融合蛋白表達系統(tǒng)、構建分泌蛋白表達系統(tǒng)、構建包涵體表達系統(tǒng)、選擇蛋白水解酶基因缺陷型的受體系統(tǒng).（三）外源基因mRNA的有效翻譯

Prok.:SD序列，起始密碼子，SD與密碼子的距離等Euk.:5’cap,掃描序列GCC（A/G）CCAUGG,有效的ORF。密碼子使用頻率。（五）目的基因沉默（genesilencing）導入并整合到受體細胞核基因組上的外源基因，在當代或后代轉(zhuǎn)基因個體中表達活性受到抑制的現(xiàn)象。位置效應基因沉默：甲基化、異染色質(zhì)區(qū)等轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默：啟動子甲基化、基因異染色質(zhì)化轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（PTGS）原核基因表達系統(tǒng)（大腸桿菌中表達系統(tǒng)）（一）原核生物基因表達的特點P1531、原核生物只有一種RNA聚合酶，識別原核細胞的啟動子。表達調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平。5、mRNA5’端有SD序列，是mRNA結(jié)合到核糖體上必需的。2、基因的表達是以操縱子為單位進行協(xié)同表達。3、原核生物轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的。4、基因不含內(nèi)含子，真核生物mRNA在原核生物中表達不能成熟。（二）大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征P161

1、大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢（1）遺傳背景清楚。全基因組測序，基因組結(jié)構簡單，便于基因操作和分析。（2）多數(shù)細胞內(nèi)有質(zhì)?；蚴删w，便于構建相應表達載體，

目標基因表達水平高。（3）代謝途徑和基因表達調(diào)控機制比較清楚（4）繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便（5）被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物2、大腸桿菌表達外源基因的劣勢（1）缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)（2）內(nèi)源性蛋白酶降解異源蛋白（三）外源基因在大腸桿菌中表達的原理

啟動子終止子核糖體結(jié)合位點密碼子質(zhì)?？截悢?shù)表達載體的必要元件①必須是一種強啟動子能使外源基因的蛋白產(chǎn)量達到細胞總蛋白的10%-30%以上。②應是可誘導型的便于表達毒性蛋白等。③應呈現(xiàn)低水平的基礎轉(zhuǎn)錄用溫度或化學試劑誘導。（1）最佳啟動子必須具備的條件常用啟動子：乳糖啟動子Plac的可控性：乳糖啟動子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即PlacUV5（2）

乳糖啟動子lac（Lac表達系統(tǒng)）

P164CAP色氨酸啟動子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白復合物阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底狀態(tài)。（3）色氨酸啟動子trp（Trp表達系統(tǒng)）

IAA與Trp結(jié)構相似，可以與阻遏蛋白結(jié)合。通過添加IAA可誘導Ptrp介導的目的基因的表達。cI857:調(diào)節(jié)基因cI

：選擇一個溫度敏感性的突變基因cI857，克隆到載體上。42oC時阻遏蛋白失活，外源基因大量轉(zhuǎn)錄cI857PL外源基因30oC時阻遏PL，外源基因不轉(zhuǎn)錄。（4）PL和PR啟動子（PL和PR表達系統(tǒng)）從噬菌體得到的一類啟動子,PL、PR是否轉(zhuǎn)錄與CI基因產(chǎn)物有關，決定了噬菌體是進入溶源循環(huán)還是溶菌循環(huán)。2、終止子（terminator)P163

RNA聚合酶滑過終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近DNA序列，形成長短不一的mRNA混合物。常用：來自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2串聯(lián)終止子和T7噬菌體DNA上的TΦ強終止子保證載體不會轉(zhuǎn)錄非必須基因，不必浪費源料和能量、不干擾正常的表達。SD序列：位于翻譯起始密碼子上游的5-13個核苷酸序列5’UAAGGAGG3’。5’-AGGAGGU-3’

？？？？S-D序列后面的4個堿基：如是A（U）,翻譯效率最高；如是G（C）,效率只有50%或25%。核糖體結(jié)合位點對外源基因表達的影響SD序列與起始密碼子之間的距離的影響SD與AUG的距離保證mRNA在核糖體上定位，使AUG正好處于核糖體復合物的P位，這是翻譯啟動的前提條件。起始密碼子及其5端若干密碼子的影響：

90%以AUG為起始密碼子，少數(shù)UUG、GUG。

AUG右側(cè)的幾個密碼堿基組成也有影響，不能與mRNA的5’端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構。4.生物體對密碼子的偏愛性：簡并密碼子使用頻率在不同生物或同一生物不同蛋白質(zhì)翻譯時不同，具有偏愛性。pCP3:溫度可誘導型的復制子28℃：每個細胞拷貝數(shù)為6042℃：拷貝數(shù)增至300-600個5、質(zhì)?？截悢?shù)：同時,質(zhì)粒載體的cI基因表達的溫度敏感型阻遏蛋白失活。PL啟動子解除阻遏，外源基因大量表達。由此：可同時控制質(zhì)?？截悢?shù)和基因的表達cI857（四）大腸桿菌基因工程菌的構建策略包涵體型異源蛋白的表達分泌型異源蛋白的表達融合型異源蛋白的表達寡聚型異源蛋白的表達整合型異源蛋白的表達2、分泌型異源蛋白的表達將外源基因與大腸桿菌的信號肽編碼序列重組在一起，使在大腸桿菌細胞中表達的外源蛋白分泌到細胞外的培養(yǎng)基中。優(yōu)點：目的蛋白穩(wěn)定性高、易于分離、末端完整不含Met。缺點：大腸桿菌分泌機制不健全，難于進行分泌型表達，但其表達率通常要比包涵體方式低很多，表達量少。分泌機制3、融合型異源蛋白的表達P173融合蛋白(fusionprotein

)：將外源基因與受體菌自身的蛋白編碼基因拼接在一起，并作為一個開放型閱讀框架進行表達，由這種雜合基因表達出的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。融合蛋白N端：受體菌蛋白C端：外源蛋白通過在DNA水平上人工設計引入的蛋白酶切割位點或化學試劑特異性斷裂位點，可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白（1）受體細胞的結(jié)構基因能高效表達，且其表達產(chǎn)物可以通過親和層析進行特異性簡單純化（2）外源基因應裝在受體蛋白編碼基因的下游，為融合蛋白提供終止密碼子（3）兩個蛋白編碼序列應保持一致的翻譯閱讀框架（4）兩個結(jié)構基因拼接位點處的序列設計十分重要，它直接決定著融合蛋白的裂解工藝融合蛋白表達質(zhì)粒的構建原則：表達率高：與受體蛋白共用一套完善的表達元件溶解性好：由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構象，且大多有水溶性。需要回收：融合蛋白需要裂解和進一步分離，才能獲得目的蛋白。融合形式表達目的蛋白優(yōu)缺點：穩(wěn)定性高：折疊成正確構象，封閉蛋白酶切點。易于分離：利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進行親和層析。優(yōu)點：專一性強，回收率高（可達到85%以上），目的蛋白N端不含甲硫氨酸。缺點：異源蛋白內(nèi)部含有甲硫氨酸不能用此方法。目的蛋白的回收：化學斷裂法、酶促裂解法化學斷裂法：溴化氰（CNBr），斷裂由甲硫氨酸羧基所參與形成的肽鍵。甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為高絲氨酸，下游肽段N端的第一位氨基酸殘基保持不變。酶促裂解法：單殘基位點特點：每種蛋白酶均有相應的斷裂位點。在殘基處切開酰胺鍵形成不含上述殘基的下游斷裂肽段外源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸或賴氨酸殘基。4、寡聚型異源蛋白的表達將外源基因的多拷貝克隆在一個低拷貝質(zhì)粒上，以取代單拷貝外源基因在高拷貝載體上表達的策略。即構建寡聚串聯(lián)型異源蛋白表達載體。特點：目的蛋白高效表達：不提高質(zhì)?？截悢?shù)，增加目的基因的拷貝數(shù)，可以改善表達量。穩(wěn)定表達小分子短肽：串聯(lián)短肽有與蛋白質(zhì)相似的長度及空間結(jié)構。目的產(chǎn)物回收困難：寡聚短肽需要裂解和分離?；緫?zhàn)略

5、整合型異源蛋白的表達

目的基因整合到宿主染色體，隨受體細胞染色體DNA的復制而復制。目的基因表達穩(wěn)定，但表達率低。DNA體內(nèi)重組的基本原理：同源序列依賴型染色體DNA的兩個同源區(qū)之間可發(fā)生同源重組，其頻率與細菌種類、同源程度、兩個同源區(qū)之間距離有關。同源重組有整合和交換兩種形式，前者只需要一個斷裂位點，后者有兩個斷裂位點。標記基因目的基因同源交換標記基因目的基因三、基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對策（一）工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)形式：結(jié)構不穩(wěn)定性：重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導致其表觀生物學功能的喪失。分配不穩(wěn)定性：整個重組DNA分子從受體細胞中逃逸（curing）.（二）工程菌遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生機制：1、受體細胞中限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子降解2、外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長代謝能量、物質(zhì)的匱乏和外源基因表達產(chǎn)物的毒性誘導受體產(chǎn)生應激反應：關閉合成途徑，啟動降解程序。3、重組質(zhì)粒在受體細胞分裂時的不均勻分配，這是重組質(zhì)粒逃逸的基本原因4、受體細胞內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進重組分子的缺失重排（三）改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略1、改進載體受體系統(tǒng)，增大質(zhì)粒穩(wěn)定性：將R1質(zhì)粒上的parB基因引入表達型載體中，其表達產(chǎn)物可以選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無質(zhì)粒細胞

正確設置載體上的多克隆位點，禁止DNA片段插在不穩(wěn)定區(qū)2、施加選擇壓力

根據(jù)載體上的抗藥性標記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應的抗生素，藥物和食品生產(chǎn)禁止加抗生素。根據(jù)載體上的營養(yǎng)缺陷型標記，篩選出含有質(zhì)粒的受體細胞。3、控制目的基因的過量表達使用可控型啟動子控