細胞培養(yǎng)資料及細胞破碎法-高壓勻漿法

細胞培養(yǎng)的基本原理與技術現(xiàn)代生物技術一般認為包括基因工程技術、細胞工程技術、酶工程技術和發(fā)酵工程技術，而這些技術的發(fā)展幾乎都與細胞培養(yǎng)有密切關系，特別是在醫(yī)藥領域的發(fā)展，細胞培養(yǎng)更具有特殊的作用和價值。比如基因工程藥物或疫苗在研究生產過程中很多是通過細胞培養(yǎng)來實現(xiàn)的?；蚬こ桃腋我呙绾芏嗍且訡HO細胞作為載體；細胞工程中更是離不細胞培養(yǎng)，雜交瘤單克隆抗體，完全是通過細胞培養(yǎng)來實現(xiàn)的，既使是現(xiàn)在飛速發(fā)展的基因工程抗體也離不開細胞培養(yǎng)。正在倍受重視的基因治療、體細胞治療也要經過細胞培養(yǎng)過程才能實現(xiàn)，發(fā)酵工程和酶工程有的也與細胞培養(yǎng)密切相關?？傊?，細胞培養(yǎng)在整個生物技術產業(yè)的發(fā)展中起到了很關鍵的核心作用。

第一節(jié)體外培養(yǎng)的概念

一、基本概念體外培養(yǎng)（invitroculture），就是將活體結構成分或活的個體從體內或其寄生體內取出，放在類似于體內生存環(huán)境的體外環(huán)境中，讓其生長和發(fā)育的方法。

●組織培養(yǎng)：是指從生物體內取出活的組織（多指組織塊）在體外進行培養(yǎng)的方法。

●細胞培養(yǎng)：是指將活細胞（尤其是分散的細胞）在體外進行培養(yǎng)的方法。

●器官培養(yǎng)：是指從生物體內取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在體外進行培養(yǎng)的方法。

二、體內、外細胞的差異和分化

1.差異：細胞離體后，失去了神經體液的調節(jié)和細胞間的相互影響，生活在缺乏動態(tài)平衡相對穩(wěn)定環(huán)境中，日久天長，易發(fā)生如下變化：分化現(xiàn)象減弱；形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時間后衰退死亡；或發(fā)生轉化獲得不死性，變成可無限生長的連續(xù)細胞系或惡性細胞系。因此，培養(yǎng)中的細胞可視為一種在特定的條件下的細胞群體，它們既保持著與體內細胞相同的基本結構和功能，也有一些不同于體內細胞的性狀。實際上從細胞一旦被置于體外培養(yǎng)后，這種差異就開始發(fā)生了。

2.分化：體外培養(yǎng)的細胞分化能力并未完全喪失，只是環(huán)境的改變，細胞分化的表現(xiàn)和在體內不同。細胞是否表現(xiàn)分化,關鍵在于是否存在使細胞分化的條件，如Friend細胞（小鼠紅白血病細胞）在一定的因素作用下可以合成血紅蛋白，血管內皮細胞在類似基膜物質底物上培養(yǎng)時能長成血管狀結構，雜交瘤細胞能產生特異的單克隆抗體，這些均屬于細胞分化行為。

第二節(jié)細胞培養(yǎng)的一般過程

一、準備工作準備工作對開展細胞培養(yǎng)異常重要，工作量也較大，應給予足夠的重視，推備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導致實驗失敗或無法進行。準備工作的內容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調試。

二、取材在無菌環(huán)境下從機體取出某種組織細胞（視實驗目的而定），經過一定的處理（如消化分散細胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養(yǎng)則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的首次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。

理論上講各種動物和人體內的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。取材后應立即處理，盡快培養(yǎng)，因故不能馬上培養(yǎng)時，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置4℃的培養(yǎng)液中保存。取組織時應嚴格保持無菌，同時也要避免接觸其他的有害物質。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。

三、培養(yǎng)將取得的組織細胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng)，則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個小時后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。如系細胞培養(yǎng)，一般應在接入培養(yǎng)器皿之前進行細胞計數，按要求以一定的量（以每毫升細胞數表示）接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細胞進入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細胞盡早進入生長狀態(tài)。

正在培養(yǎng)中的細胞應每隔一定時間觀察一次，觀察的內容包括細胞是否生長良好，形態(tài)是否正常，有無污染，培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示），此外對培養(yǎng)溫度和CO2濃度也要定時檢查。

原代培養(yǎng)一般有一段潛伏期（數小時到數十天不等），在潛伏期細胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過了潛伏期后細胞進入旺盛的分裂生長期。細胞長滿瓶底后要進行傳代培養(yǎng)，將一瓶中的細胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為“一代”。二倍體細胞一般只能傳幾十代，而轉化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。轉化細胞可能具有惡性性質，也可能僅有不死性（Immortality）而無惡性。

四、凍存及復蘇（可參閱后面有關章節(jié)）為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度－196℃，將細胞收集至凍存管中加入含保護劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低的溫度下，細胞保存的時間幾乎是無限的。復蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內迅速融解。然后將細胞轉入培養(yǎng)器皿中進行培養(yǎng)。

凍存過程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度及復蘇時溫度、融化速度等都對細胞活力有影響。

五、常用儀器設備無菌室,超凈工作臺,三重純水蒸餾器,抽氣泵,壓力蒸氣消毒器,電熱恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)器具，CO2培養(yǎng)箱,恒溫水浴鍋,倒置顯微鏡,離心機,無菌過濾器,洗刷裝置,細胞計數板和電子細胞技術儀等等。

第三節(jié)細胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境

一、無菌室

無菌室的結構：一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。

無菌室的消毒和防污染：為保持無菌狀態(tài)，經常消毒是必要的，通常采用每日（使用前）紫外照射（1－2小時），每周甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時）和每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進行消毒。實際工作中，要根據無菌室建筑材料的差異來選擇合適的消毒方法。

此外，還應注意防止無菌室的污染。造成無菌室污染的可能包括：送入無菌室的風沒有被過濾除菌；進出無菌室時，能使外界空氣直接對流進無菌室的操作間；等。

二、超凈工作臺

工作原理：鼓風機驅動空氣通過高效過濾器得以凈化，凈化的空氣被徐徐吹過臺面空間而將其中的塵埃、細菌甚至病毒顆粒帶走，使工作區(qū)構成無菌環(huán)境。根據氣流在超凈工作臺的流動方向不同，可將超凈工作臺分為側流式、直流式和外流式三種類型。

超凈臺的使用與保養(yǎng)：超凈臺的平均風速保持在0.32-0.48米/秒為宜，過大、過小均不利于保持凈化度；使用前最好開啟超凈臺內紫外燈照射10－30分鐘，然后讓超凈臺預工作10－15分鐘，以除去臭氧和使用工作臺面空間呈凈化狀態(tài)；使用完畢后，要用70%酒精將臺面和臺內四周擦拭干凈，以保證超凈臺無菌。還要定期用福爾馬林熏蒸超凈臺。

第四節(jié)常用培養(yǎng)器皿及清洗消毒

細胞培養(yǎng)需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金屬器皿、塑料、橡膠制品、布類、紙類等，因此掌握清洗、消毒知識，學會清洗、消毒方法是從事細胞培養(yǎng)工作必須的。

一、清洗離體條件下，有害物質直接同細胞接觸，細胞對任何有害物質十分敏感，極少殘留物都可以對細胞產生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必須認真清洗，達到不含任何殘留物的要求。

（一）玻璃器皿的清洗一般經過浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四個步驟。

1.浸泡:新的或用過的玻璃器皿要先用清水浸泡，軟化和溶解附著物。新玻璃器皿使用前得先用自來水簡單刷洗，然后用5％鹽酸浸泡過夜；用過的玻璃器皿往往附有大量蛋白質和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后應立即浸入清水中備刷洗。

2.刷洗:將浸泡后的玻璃器皿放到洗滌劑水中，用軟毛刷反復刷洗。不要留死角，并防止破壞器皿表面的光潔度。將刷洗干凈的玻璃器皿洗凈、晾干，備浸酸。

3.浸酸:浸酸是將上述器皿浸泡到清潔液中，又稱酸液，通過酸液的強氧化作用清除器皿表面的可能殘留物質。浸酸不應少于六小時，一般過夜或更長。放取器皿要小心。

4.沖洗:刷洗和浸酸后的器皿都必須用水充分沖洗，浸酸后器皿是否沖洗的干凈，直接影響到細胞培養(yǎng)的成敗。手工洗滌浸酸后的器皿，每件器皿至少要反復“注水－倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干后包裝備用。

（二）橡膠制品清洗

新的橡膠制品洗滌方法：0.5mol/LNaOH煮沸15分鐘，流水沖洗，0.5mol/LHCl煮沸15分鐘，流水沖洗，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50℃烤干備用。

（三）塑料制品的清洗

塑料制品特點：質軟、易出現(xiàn)劃痕；耐腐蝕能力強、但不耐熱。

清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來水過夜，用紗布或棉簽和50℃清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液15分鐘，流水沖洗（15－20遍）,蒸餾水浸洗三次，雙蒸水泡24小時，晾干備用。

（四）包裝:對細胞培養(yǎng)用品進行消毒前，要進行嚴密包裝，以便于消毒和貯存。常用的包裝材料：牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、較大培養(yǎng)皿等，近幾年用鋁箔包裝，非常方便，適用。培養(yǎng)皿、注射器、金屬器械等用牛皮紙包裝后再裝入飯盒內，較大的器皿可以進行局部包扎。

二、消毒和滅菌微生物污染是造成細胞培養(yǎng)失敗的主要原因

（一）物理消毒法

1.紫外線消毒:紫外線是一種低能量的電磁輻射，可殺死多種微生物。革蘭陰性菌最為敏感，其次是陽性菌，再次為芽孢，真菌孢子的抵抗力最強。紫外線的直接作用是通過破壞微生物的核酸及蛋白質等而使其滅活，間接作用是通過紫外線照射產生的臭氧殺死微生物。直接照射培養(yǎng)室消毒，用法簡單，效果好。

紫外燈的消毒效果同紫外燈的輻射強度和照射劑量呈正相關，輻射強度隨燈距離增加而降低，照射劑量和照射時間呈正比。因此紫外燈同被照射物的距離和照射時間要適合。離地面2米的30W燈可照射9平方米房間，每天照射2－3小時，期間可間隔30分鐘。燈管離地面2米以外要延長照射時間，2.5米照射效果較差。紫外燈照射工作臺的距離不應超過1.5米，照射時間30分鐘為宜。

紫外燈不僅對皮膚、眼睛傷害，且對培養(yǎng)細胞與試劑等也產生不良影響，因此，不要開著紫外等操作。

2.高溫濕熱滅菌:壓力蒸汽滅菌是最常用的高溫濕熱滅菌方法。對生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白質變性凝固而使微生物死亡。布類、物、璃器皿、屬器皿、膠和某些培養(yǎng)液都可以用這方法滅菌。

不同壓力蒸汽所達到的溫度不同，不同消毒物品所需的有效消毒壓力和時間不同。從壓力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液體），應立即放到60-70℃烤箱內烘干，再貯存?zhèn)溆茫駝t，潮濕的包裝物品表面容易為微生物污染。煮沸消毒也是常用的濕熱消毒方法，它具有條件簡單、使用方便等特點。

3.高溫干熱消毒:干熱滅菌主要是將電熱烤箱內物品加熱到第二章細胞培養(yǎng)液現(xiàn)代生物技術均通過細胞作為載體來進行，無論是基因治療、干細胞、克隆技術都在細胞內進行的。細胞的生長需要一定的營養(yǎng)環(huán)境，用于維持細胞生長的營養(yǎng)基質稱為培養(yǎng)基，即指所有用于各種目的的體外培養(yǎng)、保存細胞用的物質，就其本意上講為人工模擬體內生長的營養(yǎng)環(huán)境，使細胞在此環(huán)境中有生長和繁殖的能力。它是提供細胞營養(yǎng)和促進細胞生長增殖的物質基礎。細胞培養(yǎng)基其組成成分主要有：水、氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子及其他一些入核酸降解物、激素等。

隨著動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術的迅速發(fā)展，作為細胞培養(yǎng)領域中最基本的原料－細胞培養(yǎng)基的用量也迅速增加，被廣泛應用于細胞生物學科和醫(yī)學研究的各個領域，如疫苗生產（人用疫苗如乙腦、狂犬、甲肝、乙肝、出血熱、麻疹等，獸用疫苗如口蹄、馬立克、偽狂犬等），基因藥物生產（如EPO、TPA等），臨床用單抗（如抗人肝癌單抗、抗人肺單抗、WT3）等。

第一節(jié)水與平衡鹽溶液

1.培養(yǎng)用水:體外培養(yǎng)的細胞對水質特別敏感，對水的純度要求較高。培養(yǎng)用水中如果含有一些雜質，即使含量極微，有時也會影響細胞的存活和生長，甚至導致細胞死亡。用金屬蒸餾器制備的蒸餾水，可能會含有某些金屬離子，一般不作為培養(yǎng)用水。配制培養(yǎng)用液應使用經石英玻璃蒸餾器三次蒸餾的三蒸水或超純水凈化裝置制備的超純水。最好用龍頭瓶貯存，存放時間一般不應超過2周。

2.緩沖溶液、生理鹽水、平衡鹽溶液：稍后介紹。

第二節(jié)細胞培養(yǎng)基的基本要求

體外培養(yǎng)的細胞直接生活在培養(yǎng)基中，因此培養(yǎng)基應能滿足細胞對營養(yǎng)成分、促生長因子、激素、滲透壓、pH等諸多方面的要求。

一、營養(yǎng)成分維持細胞生長的營養(yǎng)條件一般包括以下幾個方面：

1.氨基酸：是細胞合成蛋白質的原料。所有細胞都需要12種必須氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸。此外還需要谷氨酰胺，它在細胞代謝過程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的來源，同樣也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物質。體外培養(yǎng)的各種培養(yǎng)基內都含有必需氨基酸。

2.單糖：培養(yǎng)中的細胞可以進行有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細胞對葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。

體外培養(yǎng)動物細胞時，幾乎所有的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質。

3.維生素：主要扮演輔酶、輔基的角色，必不可少。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養(yǎng)基常有的成分。

4.無機離子與微量元素：細胞生長除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮和磷等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。

二、促生長因子及激素已證實：各種激素、生長因子對于維持細胞的功能、保持細胞的狀態(tài)（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素對許多細胞生長有促生長作用，如胰島素，它能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對某一類細胞有明顯促進作用，如氫化可的松可促進表皮細胞的生長，泌乳素有促進乳腺上皮細胞生長作用等。

三、滲透壓細胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數培養(yǎng)細胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg,可視為培養(yǎng)人體細胞的理想滲透壓。鼠細胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數哺乳動物細胞，滲透壓在260－320mOsm/kg的范圍都適宜。

四、pH氣體也是細胞生存的必需條件之一，所需氣體豐要是氧和二氧化碳。氧參與三羧酸循環(huán)，產生能量供給細胞生長、增殖和合成各種成分。一些細胞在缺氧情況下，借糖酵解也可獲取能量，但多數細胞缺氧不能生存。在開放培養(yǎng)時，一般置細胞于95％空氣加5％二氧化碳的混合氣體環(huán)境中培養(yǎng)。二氧化碳既是細胞代謝產物，也是細胞所需成分，它主要與維持培養(yǎng)基的pH有直接關系。動物細胞大多數需要輕微的堿性條件，pH值約在7．2~7．4℃在細胞生長過程中，隨細胞數量的增多和代謝活動的加強，二氧化碳不斷被釋放，培養(yǎng)液變酸，PH值發(fā)生變化。由于NaHCO3容易分解為二氧化碳，很不穩(wěn)定，致使緩沖系統(tǒng)難以精確地控制。故這一緩沖系統(tǒng)適合密閉培養(yǎng)。HEPES結合碳酸氫鈉使用，可提供更有效的緩沖體系，主要是防止pH值迅速變動，但最大缺點是在開放培養(yǎng)或觀察時難以維持正常的pH值。造成pH波動主要是代謝產生的CO2，在封閉式培養(yǎng)過程中CO2與水結合產生碳酸，培養(yǎng)基pH很快下降。為解決這一問題，合成培養(yǎng)基中使用了NaHCO3-CO2緩沖系統(tǒng)，并采用開放培養(yǎng)，使細胞代謝產生的CO2及時溢出培養(yǎng)瓶，再通過穩(wěn)定調節(jié)溫箱中CO2濃度（5％），與培養(yǎng)基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài)。

五、無毒、無污染體外生長的細胞對微生物及一些有害有毒物質沒有抵抗能力，因此培養(yǎng)基應達到無化學物質污染、無微生物污染（如細菌、真菌、支原體、病毒等）、無其他對細胞產生損傷作用的生物活性物質污染（如抗體、補體）。對于天然培養(yǎng)基，污染主要來源于取材過程及生物材料本身，應當嚴格選材，嚴格操作。對于合成培養(yǎng)基，污染主要來源于配制過程，配制所用的水，器皿應十分潔凈，配制后 應嚴格過濾除菌。

第三節(jié)天然細胞培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術建立早期，體外培養(yǎng)細胞都是利用天然培養(yǎng)基。但是由于天然培養(yǎng)基制作過程復雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。目前廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液、促進細胞貼壁的膠原類物質在培養(yǎng)某些特殊細胞也是必不可少。

一、血清(serum)細胞培養(yǎng)的發(fā)展，培養(yǎng)基的質量又是關鍵，而培養(yǎng)基的主要成份中動物血清對細胞的生長繁殖發(fā)揮著重要甚至是難以替代的作用。在動物血清的應用中牛血清又是最為廣泛的，所以血清是醫(yī)藥生物技術產品中重要的原材料之一。保證血清質量也是促進生物制品質量提高的重要環(huán)節(jié)。

1.血清種類:目前用于組織培養(yǎng)的血清主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養(yǎng)細胞的原因：來源充足、制備技術成熟、經過長時間的應用考驗人們對其有比較深入的理解。牛血清對絕大多數哺乳動物細胞都是適合的，但并不排除在培養(yǎng)某種細胞時使用其他動物血清更合適。

牛血清是細胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細胞生長必須的營養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應取自剖腹產的胎牛；新牛血清取自出生24小時之內的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。顯然，胎牛血清是品質最高的，因為胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少。

2.血清的主要成分:血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養(yǎng)條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等，這些物質對促進細胞生長或抑制生長活性是達到生理平衡的。對血清的成分和作用的研究雖有很大進展，但仍存在一些問題。主要是：

第一:血清的成份可能有幾百種之多，目前對其準確的成份、含量及其作用機制仍不清楚，尤其是對其中一些多肽類生長因子、激素和脂類等尚未充分認識，這給研究工作帶來許多困難；

第二:血清都是批量生產，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實驗的標準化和連續(xù)性受到限制；

第三:不能排除血清中含有易變物質，這被認為是“瓶中惡化”的原因之一。

3.血清主要作用：

●提供基本營養(yǎng)物質：氨基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物等，是細胞生長必須的物質。

●提供激素和各種生長因子：胰島素、腎上腺皮質激素（氫化可的松、地塞米松）、類固醇激素（雌二醇、睪酮、孕酮）等。生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。

●提供結合蛋白：結合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉鐵蛋白攜帶鐵。結合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。

●提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。

●對培養(yǎng)中的細胞起到某些保護作用：有一些細胞，如內皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用。因為胰蛋白酶已經被廣泛用于貼壁細胞的消化傳代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護細胞免受機械損傷，特別是在懸浮培養(yǎng)攪拌時，粘度起到重要作用。血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。

4.細胞培養(yǎng)中使用血清的缺點

血清成分復雜，雖含許多對細胞有利成分，也含有對細胞有害的成分，使血清有幾個明顯的缺點：

●對大多數細胞，在體內狀態(tài)，血清不是它們接觸的生理學液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細胞在體內的正常狀態(tài)，血清可能促進某些細胞的生長（成纖維細胞）同時抑制另一類細胞生長（表皮細胞）。

●血清含一些對細胞產生毒性的物質，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細胞的多胺反應（如精胺、亞精胺）形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長，甚至造成細胞死亡。

●動物個體不同，血清產地、批號不同，每批質量差異甚大，其成分不能保持一致。

●取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產生潛在影響，可能導致實驗失敗或實驗結果不可靠性。

●血清的使用使得實驗和生產的標準化困難，其中的蛋白質使得某些轉基因蛋白生物藥品生產中分離純化工作很難完成。

●大規(guī)模生產中，血清來源越來越困難，價格昂貴，是構成動物細胞培養(yǎng)對生產成本的主要部分之一。

5.血清的質量標準:血清質量高低取決于兩方面因素：一是取材對象，二是取材過程。用于取材的動物應健康無病并且在指定的出生天數之內，取材過程應嚴格按照操作規(guī)程執(zhí)行，制備出的血清要經過嚴格的質量鑒定。WHO公布的《用動物細胞體外培養(yǎng)生產生物制品規(guī)程》中的要求：

▲牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。并應具備適當的監(jiān)測系統(tǒng)。

▲有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。

▲證明所用牛血清中不含對所生產疫苗病毒的抑制物。

▲血清要通過濾膜過濾除菌，保證無菌。

▲無細菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國家要求無細菌噬菌體污染。

▲對細胞有良好的支持繁殖作用。

我國在對牛血清的質量2021年版《中國生物制品主要原輔料質控標準》中提出比較嚴格的標準要求。包括蛋白質含量，細菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細菌內毒素，支持細胞增殖檢查。

血清質量的鑒定一般包括以下幾個方面：

●理化性質：如滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內毒素等。蛋白含量包括血清總蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（應小于20g/L)、血紅蛋白含量等。其中球蛋白含量是一項非常重要的指標，血清中球蛋白主要是抗體，球蛋白含量越低血清質量越高。血紅蛋白也是越低越好。

●微生物檢測：包括細菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對支原體、病毒的檢測，支原體是一種很小的微生物，可通過孔徑22u的濾膜。支原體、病毒污染在光學顯微鏡下難于察覺，細胞也能生長繁殖，但會影響實驗結果。檢測支原體的方法很多，如培養(yǎng)法、PCR法、熒光染色法、電鏡觀察法等。

●促生長效果：這是血清重要的特性之一，應當以培養(yǎng)的細胞來檢測。有兩種方法：克隆形成率、貼瓶率測定法和連續(xù)傳代培養(yǎng)法。

(1)克隆形成率測定:一般以懸浮生長的細胞為培養(yǎng)對象，按有限稀釋法做克隆化培養(yǎng)，將不同批號的血清配制成不同濃度的培養(yǎng)基，細胞也稀釋成不同濃度，接種到96孔板，每孔200ul，培養(yǎng)一定時間，統(tǒng)計有克隆生長的孔，計算出百分比，再與對照的標準血清相比較，就可看出不同批號血清間的區(qū)別。比較低的濃度，更能觀察出血清質量間的細微差別。

(2)貼瓶率測定:是以貼壁細胞為培養(yǎng)對象，將細胞稀釋至低密度，接種至平皿，每皿200或100個細胞，以不同濃度的血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時間后棄培養(yǎng)基，染色后統(tǒng)計集落數，計算出集落數占接種細胞數的百分比，同樣再與標準血清比較，判斷血清質量高低。

(3)連續(xù)傳代培養(yǎng)法:是將細胞培養(yǎng)于3個一定體積的培養(yǎng)瓶中，待測血清配制為5％濃度，一般于第七天收集細胞，計數，取平均值，中間可以更換一次培養(yǎng)基。連續(xù)測試三個周期以上，觀察細胞生長狀況，并將每次的計數結果與標準血清的測試結果比較。

●對于使用者，判斷血清質量先從外觀入手。好的血清應該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少沉淀，比較粘稠。如發(fā)現(xiàn)血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說明血清污染或血清中的蛋白質變性；若血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時有溶血現(xiàn)象；如果搖晃時感覺液體稀薄，說明血清中摻入的生理鹽水太多。如果要進一步了解血清的質量，則應連續(xù)培養(yǎng)某些細胞，觀察細胞生長狀況。

6.血清的使用與儲存:正確的使用及保存血清，才能使血清發(fā)揮應有的作用。

●使用前處理：大部分血清在使用前必須滅活處理，即56℃30分鐘。滅活的目的是去除血清中的補體成分，避免補體對細胞產生毒性作用。血清經過滅活也會損失一些對細胞有利的成分，如生長因子，因此也有人提出血清不經滅活直接用于培養(yǎng)，這樣做的前提是確認血清中不含補體成分。對于一些品質高的胎牛血清和新牛血清可以考慮不經滅活直接用于細胞培養(yǎng)。

●儲存條件：血清一般儲存于－20℃，同時應避免反復凍融。購買大包裝的血清后，首先要滅活處理，然后分裝成小包裝，儲存于－20℃，使用前融化。融化時最好現(xiàn)置于4℃。融化后的血清在4℃不宜長時間存放，應盡快使用。

●使用濃度：自從有了合成培養(yǎng)基，血清就是作為一種添加成分與合成培養(yǎng)基混合使用，使用濃度一般為5－20％，最常用是10％。過多血清容易使培養(yǎng)中的細胞發(fā)生變化，特別是一些二倍體的無限細胞系，迅速生長之后容易發(fā)生惡性轉化。

●采購血清時，最好先從供應商處索取樣品進行試驗，選定一批后就要保留足夠使用6個月至1年的量，直至用另一批經過預先試驗的樣品代替。

二、胚胎浸出液

胚胎浸出液(embryonicextract)是早期動物細胞培養(yǎng)中應用的天然培養(yǎng)基，現(xiàn)已很少使用。

三、水解乳蛋白水解乳蛋白(lactalbuminhydrolysate)為乳白蛋白經蛋白酶和肽酶水解的產物，含有豐富的氨基酸，是常用的天然培養(yǎng)基，可用于許多細胞和原代細胞的培養(yǎng)。第四節(jié)合成細胞培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據天然培養(yǎng)基的成分，用化學物質模擬合成、人工設計、配制的培養(yǎng)基。它有一定的配方，是一種理想的培養(yǎng)基。目前合成培養(yǎng)基多達10多余種，有的培養(yǎng)基仍在不斷進行改良。早期組織培養(yǎng)是利用天然培養(yǎng)基，目前合成培養(yǎng)基已經成為一種標準化的商品，從最初的基本培養(yǎng)基發(fā)展到無血清培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基，并且還在不斷發(fā)展。合成培養(yǎng)基的出現(xiàn)極大的促進了組織培養(yǎng)技術的普及發(fā)展。

一、基本組分基本培養(yǎng)基包括四大類物質：無機鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物。

●無機鹽：CaCl2KClMgSO4NaClNaHCO3NaH2PO4。對調節(jié)細胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。

●氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)。它們都是細胞用以合成蛋白質的必需原料，不能由其他氨基酸或糖類轉化合成。除此之外，還需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用，對細胞的培養(yǎng)特別重要，能促進各種氨基酸進入細胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的來源，還是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質，谷氨酰胺缺乏可導致細胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應補加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，故4℃下放置1周可分解50%，使用中最好單獨配制，置-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液中。

●維生素：是維持細胞生長的一種生物活性物質，在細胞中大多形成酶的輔基或輔酶，對細胞代謝有重大影響。脂溶性維生素(A、D、E、K)常從血清中得到補充。水溶性維生素包括牛物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素和B12。維生素C也是不可缺少的，對具有合成膠原能力的細胞更為重要。

●碳水化合物：是細胞生命的能量來源，有的是合成蛋白質和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖和丙酮酸鈉等。體外培養(yǎng)動物細胞時，幾乎所有培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質。

●葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用：乳酸是葡萄糖不完全氧化的產物。研究表明，體外培養(yǎng)條件下95％的葡萄糖轉變?yōu)槿樗?，這降低了營養(yǎng)物質的代謝效率，降低培養(yǎng)基pH值，增加滲透壓。在氧氣供給不足的情況下，NADH轉運系統(tǒng)蘋果酸－天冬氨酸穿梭系統(tǒng)活性低而不能將糖酵解產生的NADH氧化磷酸化為NAD+，細胞只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脫氫酶將糖酵解產生的丙酮酸與NADH反應生產乳酸和NAD+，從而保證了糖酵解的順利進行。另一個可能的解釋是連接糖酵解與TCA循環(huán)的特異性酶如丙酮酸脫氫酶復合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶和丙酮酸羧化酶活性低下，直接導致糖酵解與TCA循環(huán)的失衡。因此體外培養(yǎng)條件下，葡萄糖主要經糖酵解降解，產生過量的乳酸。減少乳酸生產最常用的方法是限制培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，但葡萄糖含量過低可造成細胞營養(yǎng)供應不足，細胞生長抑制。該方法需要對葡萄糖的消耗與需求、乳酸的生產速率以及目的蛋白的表達量等參數進行綜合考慮方可應用。

在目前常用的培養(yǎng)基中，葡萄糖和谷胺酰胺是體外培養(yǎng)動物細胞的主要能源，其能量代謝通路與體內完全不同，表現(xiàn)為葡萄糖主要經糖酵解途徑為細胞提供能量，谷胺酰胺大部分通過不完全氧化途徑，另一小部分通過完全氧化為細胞供能。因此，適當的調整細胞內的代謝途徑，使之能促進細胞的快速生長和產物合成，同時減少代謝抑制物的生成是行之有效的一種策略。

許多動物細胞如CHO、BHK和雜交瘤細胞對營養(yǎng)物質葡萄糖和谷氨酰胺的消耗利用很快。然而對于細胞生長而言，二者的快速利用并非細胞必需；相反相當一部分轉化為代謝廢物乳酸和氨，以及一些非必需氨基酸如丙氨酸，脯氨酸。其中，乳酸和氨是兩種主要代謝廢物，其積累可影響細胞生長以及產品質量。減少這兩種代謝產物的積累，是大規(guī)模細胞培養(yǎng)技術研究的重要方向。

氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺產生的。限制培養(yǎng)基中谷氨酰胺的含量亦是減少氨生成的常用方法。

●除了以上與細胞生長有關的物質以外，培養(yǎng)基中一般還要加入酚紅（當溶液酸性時pH小于6.8呈黃色；當溶液堿性時pH大于8.4呈紅色），一種pH指示劑。

●在較為復雜的培養(yǎng)液中還包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶兩類)以及氧化還原劑(如谷胱甘肽)等。有的培養(yǎng)液還直接采用了三磷酸腺苷和輔酶A。

二、常用細胞培養(yǎng)基

(1).MEM細胞培養(yǎng)基系列（參看本網站-產品展示）

(2).DMEM細胞培養(yǎng)基系列（參看本網站-產品展示）

(3)RPMI-1640細胞培養(yǎng)基系列（參看本網站-產品展示）

(4).199細胞培養(yǎng)基系列（參看本網站-產品展示）

(5).水解乳蛋白細胞培養(yǎng)基（參看本網站-產品展示）

(6)歐氏平衡鹽（參看本網站-產品展示）

(7)F-10,F-12細胞培養(yǎng)基系列（參看本網站-產品展示）

(8)其它類型細胞培養(yǎng)基

三、干粉培養(yǎng)基的配制

配制培養(yǎng)基要注意以下問題：

●認真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據實驗需要決定。

●配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質都要等培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加。

●配制所用的水應是三蒸水，離子濃度很低。

●所用器皿應嚴格消毒。

●配制好的培養(yǎng)基應馬上過濾，無菌保存于4度。

●液體培養(yǎng)基主要是為了科研工作的方便而設計的培養(yǎng)基，它是一種滅菌后保證無菌的溶液，必要時可制成無內毒素等的溶液，可節(jié)省科研人員的工作量。

配制方法

●在一個盡可能接近總體積的容器中加入比預期培養(yǎng)基總體積少5％的雙蒸水。

●在室溫（20℃到30℃）的水中加入干粉培養(yǎng)基，輕輕攪拌，不要加熱。

●水洗包裝袋的內部，轉移全部的痕量干粉到容器內。

●加NaHCO3到培養(yǎng)基中。

●用雙蒸水稀釋到想要的體積，攪拌溶解。注意不要過分攪拌。

●通過緩慢攪拌加入1NNaOH或1NHCL調節(jié)pH值，由于pH值在過濾時會上升0.1到0.3，因而調節(jié)pH值使它比最終想要的pH值低0.2到0.3。培養(yǎng)基在過濾前要保持密封。

第五節(jié)無血清技術及其培養(yǎng)基

經歷了天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后，無血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)成為當今細胞培養(yǎng)領域的一大趨勢。采用無血清培養(yǎng)可降低生產成本，簡化分離純化步驟，避免病毒污染造成的危害。

無血清培養(yǎng)基(serumfreemedium,SFM):是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎培養(yǎng)基加少量血清所配制的完全培養(yǎng)基可以滿足大部分細胞培養(yǎng)的要求，但對有些實驗卻不適合，如觀察一種生長因子對某種細胞的作用，這時需要排除其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子；又如需要測定某種細胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質（抗體、生長因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細胞，以獲得它們的分泌產物。因此研制出無血清培養(yǎng)基一直是生物科學工作者努力的目標。上海恒利安生物科技已成功開發(fā)了商業(yè)化的多種無血清培養(yǎng)基，可滿足眾多廠商的需求。

一、無血清培養(yǎng)基的基本配方:基本成分為基礎培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。

用于生物制藥和疫苗生產的細胞在體外培養(yǎng)時，多數呈貼壁生長或兼性貼壁生長；而當其在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中生長時，由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細胞往往以懸浮形式生長。

添加組分包括以下幾大類物質：

(1）促貼壁物質：許多細胞必須貼壁才能生長，這種情況下無血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴展因子，一般為細胞外基質，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細胞功能的分化因子，對許多細胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖連蛋白主要促進來自中胚層細胞的貼壁與分化，這些細胞包括成纖維細胞、肉瘤細胞、粒細胞、腎上皮細胞、腎上腺皮質細胞、CHO細胞、成肌細胞等。

(2）促生長因子及激素：針對不同細胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細胞生長、維持細胞功能的重要物質，有些激素是許多細胞必不可少的，如胰島素。

(3）酶抑制劑：培養(yǎng)貼壁生長的細胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養(yǎng)基中必不可少須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達到保護細胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制劑。

(4）結合蛋白和轉運蛋白：常見如轉鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養(yǎng)基的粘度，保護細胞免受機械損傷。許多旋轉式培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白。

(5)微量元素：硒是最常見的。

二、使用方法:目前，血清仍是動物細胞培養(yǎng)中最基本的的添加物，尤其是在原代培養(yǎng)或者細胞生長狀況不良時，常常會先使用有血清的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，待細胞生長旺盛以后，再換成無血清培養(yǎng)液。細胞轉入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個適應過程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無血清培養(yǎng)。在降低過程中要注意觀察細胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細胞死亡，存活細胞是否還保持原有的功能和生物學特性等。在實驗后這些細胞一般不再繼續(xù)保留，很少有細胞能夠長期培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細胞轉入無血清培養(yǎng)之前，要留有種子細胞，種子細胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中，以保證細胞的特性不發(fā)生變化。

為了使細胞適應無血清培養(yǎng)，關鍵的是使所培養(yǎng)細胞：

●處于對數生長中期

●>90%活細胞率

●適應時以較高的起始細胞接種

有兩種方法使細胞適應無血清培養(yǎng)基（SFM）:

1.直接適應——細胞從添加血清的培養(yǎng)基轉換到無血清培養(yǎng)基（SFM）中。

一些類型細胞可直接從包含血清的培養(yǎng)基適應無血清培養(yǎng)基。對于直接適應，接種細胞密度應該:2.5×105~3.5×105細胞/ml。當細胞密度達到1×106~3×106細胞/ml時，傳代培養(yǎng)細胞。當細胞密度在培養(yǎng)4到7天后達到2×106~4×106細胞/ml時，細胞完全適應了無血清培養(yǎng)基。每隔3~5天，當細胞密度達到1×106~3×106細胞/ml，細胞活率在90％時，貯備的適應了無血清培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物應該再次傳代培養(yǎng)。

2.連續(xù)適應——分好幾步把細胞從添加血清的培養(yǎng)基轉換到無血清培養(yǎng)基（SFM）中，與直接適應相比較，連續(xù)適應趨向對于細胞更加溫和一些。

●以2倍正常接種密度接種生長活躍的細胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基：25％SFM混合培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)。

●當細胞密度>5×105細胞/ml時，以2×105到3×105細胞/ml細胞密度，在有血清培養(yǎng)基：SFM為50∶50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

●以2×106到3×106細胞/ml細胞密度，25％有血清培養(yǎng)基和75%SFM中傳代培養(yǎng)。

●當細胞密度達到1×106到3×106細胞/ml（接種后4到6天），在100％SFM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

●每隔3到5天，當細胞密度達到1×106到3×106細胞/ml，細胞活率在90％時，貯備的適應了無血清培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物應該再次傳代培養(yǎng)。

建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物，直到每一次細胞適應了新的混合培養(yǎng)基。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進行幾次傳代。

在適應過程中，最好不要讓細胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養(yǎng)基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質，因而更易于受外界因素的影響。

細胞培養(yǎng)適應替代血清：許多細胞利用連續(xù)適應方法能很好的適應，用包含F(xiàn)BS的的培養(yǎng)基和包含有替代血清的培養(yǎng)基1∶1（v∶v）的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。通過下列的混合培養(yǎng)基的方式，連續(xù)幾代減少當前培養(yǎng)基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培養(yǎng)基。每次適應改變血清比例時，傳代細胞2到3次。

培養(yǎng)可以直接從FBS轉換到替代血清。一開始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長的延遲可能會發(fā)生，4允許進行2到3次的傳代，使生長率恢復到以前的水平。

特別需要強調的是：配制無血清培養(yǎng)液必須使用高質量的水，如石英玻璃蒸餾器經三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因為無血清培養(yǎng)基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護細胞的大分子，既便水中的有毒物質含量甚微，也可能對細胞產生致死性損害。這是無血清培養(yǎng)能否成功的關鍵因素之一。

三、使用無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點

●增加確定性

●性能更加一致

●容易進行純化和下游加工

●細胞功能的精確評估

●增強生長和/或產量

●生理反應性的較好對照

●增強細胞內中介物的檢測

第六節(jié)無蛋白培養(yǎng)基與限定化學成分培養(yǎng)基

一、無蛋白培養(yǎng)基（proteinfreemidium,PFM）:即不含有動物蛋白的培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基仍含有較多的動物蛋白，如胰島素，轉鐵蛋白、牛血清白蛋白等。從生物技術發(fā)展的趨勢來看，不含動物蛋白的培養(yǎng)基又廣泛的應用前景，許多利用基因工程技術重組的蛋白質最終要應用于人體，如果再生長過程中使用了含有動物蛋白質的培養(yǎng)基，純化過程就比較復雜，最終要達到一定的質量標準也有一定的難度。無蛋白培養(yǎng)基就是為了適應這發(fā)展趨勢而出現(xiàn)的，許多無蛋白培養(yǎng)基添加了植物水解物以替代動物激素、生長因子的作用。市場上已有適合多種細胞生長的無蛋白培養(yǎng)基。

二、限定化學成分培養(yǎng)基(chemicaldefinedmedium,CDM):是指培養(yǎng)基中的素有成分都是明確的，它同樣不含有動物蛋白，同樣也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結構與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。這種培養(yǎng)基更有利于分析細胞的分泌產物。目前已經有適合于293細胞、CHO細胞、雜交瘤細胞生長的CDM問世，上海恒利安生物科技生產的水解乳蛋白培養(yǎng)基就屬于CDM。

第七節(jié)其他細胞培養(yǎng)用液

在細胞培養(yǎng)過程中，除了培養(yǎng)基外，還經常用到一些平衡鹽溶液、消化液、pH調整液等。

一、平衡鹽溶液（balancedsaltsolution,BSS）:主要是由無機鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。主要用于取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配制其他試劑等。最簡單的BSS是Ringer。D-Hank's與Hank's的一個主要區(qū)別是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有較高的NaHCO3(2.2g/L),適合于5%CO2的培養(yǎng)條件，Hank's平衡液僅含有0.35g/LNaHCO3，不能用于5%CO2的環(huán)境，若放入CO2培養(yǎng)相，溶液將迅速變酸，使用時應注意。

配制溶液應使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+，應當首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌。

二、消化液:取材進行原代培養(yǎng)時常常需要將組織塊消化解離形成細胞懸液，傳代培養(yǎng)時也需要將貼壁細胞從瓶壁上消化下來，常用的消化液有胰酶（Trypsin）溶液和EDTA溶液，有時也用膠原酶（collagenase）溶液。

1.胰酶溶液：胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常見有1：125和1：250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。組織培養(yǎng)用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度，配制時要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液（如前面的D-Hank's），因為這些物質會對胰酶產生抑制作用。胰酶作用及溶解的最佳pH是8-9，配制胰酶溶液應將液體調至pH8左右，充分溶解，過濾除菌。過濾后可以再調只pH7.5，也可不調。

使用細胞清洗液配制胰酶消化液：含0.5%胰酶的細胞清洗液（100ml細胞清洗液加0.5g胰酶），過濾除菌，分裝于4度保存。

2.EDTA溶液：EDTA溶液也常用來解離細胞，它的作用機制是破壞細胞間的連接。對于一些貼壁特別牢固的細胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進行消化。EDTA溶液的使用濃度為0.02%，配制時應加堿助溶，配制后可過濾除菌，也可高溫消毒滅菌。

3.膠原酶溶液：膠原酶在上皮類細胞原代培養(yǎng)時經常使用，膠原酶作用的對象是膠原組織，因此不容易對細胞產生損傷。膠原酶的使用濃度為0.1-0.3mg/L或202100U/L,作用的最佳pH為6.5。膠原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制，配制時可用PBS。

三、pH調整液:常用的有HEPES液和NaHCO3溶液。

1.NaHCO3溶液：NaHCO3是培養(yǎng)基中必須添加的成分，一般情況下按說明書的要求準確添加，以保證培養(yǎng)基在5%CO2的環(huán)境下pH達到設計標準。如果是封閉式培養(yǎng)，即不與5%CO2的環(huán)境發(fā)生交換達到平衡，所使用的培養(yǎng)基就不能按照說明書所要求加入NaHCO3。此時常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液調節(jié)培養(yǎng)基，使之達到所要求的pH環(huán)境。

2.HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細胞無毒性，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPES。

四、抗生素:常用的是青鏈霉素，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預防絕大多數細菌污染。通常使用青霉素終濃度0.007-0.008g/100ml,鏈霉素終濃度0.01g/100ml。一般配制成100倍濃縮液，可用PBS或培養(yǎng)基配制。

五、谷氨酰胺補充液:谷氨酰胺在細胞代謝過程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加。配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上時，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨配制谷氨酰胺，以便臨時加入培養(yǎng)液內。谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L。一般配制為100倍濃縮液，即濃度為200mmol/L（29.22g/L），配制時應加溫30℃第三章細胞培養(yǎng)的基本方法

第一節(jié)培養(yǎng)細胞的細胞生物學

一、基本概念通常，體外培養(yǎng)的生物成分無外乎兩種結構形式：

其一是小塊組織或稱為組織塊（tissueblock），一般稱為外植塊；

其二是將生物組織分散后制成的單個細胞，一般稱為分離的細胞(isolatedcell)或者分散的細胞(dissociatedcell)。

分散的過程通常在培養(yǎng)液或平衡鹽溶液中進行，分散的細胞被懸浮于培養(yǎng)液或平衡鹽溶液中。

單個細胞分散存在于培養(yǎng)液或其它平衡鹽溶液中、緩沖溶液中，就稱為細胞懸液(cellsuspension)。

狹義的細胞培養(yǎng)(cellculture)主要是指分離（散）細胞培養(yǎng)，廣義的細胞培養(yǎng)的概念還包括單（個）細胞培養(yǎng)(singlecellculture)。一種是群體培養(yǎng)（massculture），將含有一定數量細胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合（confluence）后形成均勻的單細胞層；另一種是克隆培養(yǎng)（clonalculture），將高度稀釋的游離細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個細胞貼壁后，彼此距離較遠，經過生長增殖每一個細胞形成一個細胞集落，稱為克?。╟lone）。一個細胞克隆中的所有細胞均來源于同一個祖先細胞。

現(xiàn)今，用于疫苗生產的細胞基本有3類，即原代細胞、二倍體細胞株及傳代細胞系。經過幾十年的研究和發(fā)展，目前我國已經擁有了可以進行大規(guī)模疫苗生產的動物原代細胞、二倍體細胞和Vero細胞等生產技術，用于生產多種人用、動物疫苗。其中二倍體細胞（如我國70年代建立的人胚肺二倍體細胞株KMB17和2BS）對多種病毒具有廣泛的敏感性，用其制備病毒性疫苗可以克服使用原代細胞時在其培養(yǎng)物中可能存在的各種潛在致病因子的危險，是當前病毒性疫苗生產較為理想的細胞基質。Vero細胞是1962年由日本Chiba大學的Yasumura等人從成年非洲綠猴腎中分離獲得的，是一種貼壁依賴性成纖維細胞，核型為2n60，高倍體率約為1.7%，可持續(xù)地進行培養(yǎng)，不含任何污染因子。通常使用199培養(yǎng)基添加5%胎牛血清進行培養(yǎng)。該細胞可用于多種病毒的增殖，已被WHO批準廣泛用于人用、動物用疫苗生產。

二、體外培養(yǎng)細胞的分型

（一）貼附型：大多數培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞，大致分成以下四型：

1、成纖維細胞型：胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質突起，生長時呈放射狀。除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間充質起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內皮等常呈本型狀態(tài)。培養(yǎng)中細胞的形態(tài)與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細胞。

2、上皮型細胞：細胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細胞彼此緊密相連成單層膜。生長時呈膜狀移動，處于膜邊緣的細胞總與膜相連，很少單獨行動。起源于內、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。

3、游走細胞型：呈散在生長，一般不連成片，胞質常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細胞相區(qū)別。

4、多型細胞型：有一些細胞，如神經細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。

（二）懸浮型:見于少數特殊的細胞，如某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細胞容易大量繁殖。

三、培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程:體內細胞生長在動態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營養(yǎng)是有限的。當細胞增殖達到一定密度后，則需要分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代（Passage或Subculture）。每次傳代以后，細胞的生長和增殖過程都會受一定的影響。另外，很多細胞在體外的生存也不是無限的，存在著一個發(fā)展過程。所有這一切，使組織細胞在培養(yǎng)中有著一系列與體內不同的生存特點。

（一）培養(yǎng)細胞生命期（LifeSpanofCultureCells）:所謂培養(yǎng)細胞生命期，是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。體內組織細胞的生存期與完整機體的死亡衰老基本相一致。人胚二倍體成纖維細胞培養(yǎng)，在不凍存和反復傳代條件下，可傳30～50代，相當于150～300個細胞增殖周期，能維待一年左右的生存時間，最后衰老凋亡（Apoptosis）。如供體為成體或衰老個體，則生存時間較短；如培養(yǎng)的為其它細胞,如肝細胞或腎細胞，生存時間更短，僅能傳幾代或十幾代。只有當細胞發(fā)生遺傳性改變，如獲永生性或惡性轉化時，細胞的生存期才可能發(fā)生改變。正常細胞培養(yǎng)時，不論細胞的種類和供體的年齡如何，在細胞全生存過程中，大致都經歷以下三個階段：

1．原代培養(yǎng)（PrimaryCulture）期：也稱初代培養(yǎng)，即從體內取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細胞呈活躍的移動，可見細胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細胞與體內原組織在形態(tài)結構和功能活動上相似性大。細胞群是異質的（Heterogeneous），也即各細胞的遺傳性狀互不相同，細胞相互依存性強。

2．傳代期：初代培養(yǎng)細胞一經傳代后便改稱做細胞系（CellLine）。在全生命期中此期的持續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細胞稱二倍體細胞系（DiploidCellLine）。為保持二倍體細胞性質，細胞應在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當前世界上常用細胞均在不出十代內凍存。如不凍存，則需反復傳代以維持細胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導致細胞失掉二倍體性質或發(fā)生轉化。一般情況下當傳代10～50次左右，細胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細胞進入第三期。

3．衰退期：此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退凋亡。

在細胞生命期階段，少數情況下，在以上三期任何一點（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細胞可能發(fā)生自發(fā)轉化（SpontaneousTransformation）。轉化的標志之一是細胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。細胞永生性也稱不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞系（InfiniteCellLine），也稱連續(xù)細胞系（ContinuousCellLine）。無限細胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。細胞轉化亦可用人工方法誘發(fā)，轉化后的細胞也可能具有惡性性質。細胞永生性和惡性性非同一性狀。

（二）組織培養(yǎng)細胞一代生存期所有體外培養(yǎng)細胞，包括初代培養(yǎng)及各種細胞系，當生長達到一定密度后，都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質、接種細胞數量和細胞增殖速度等有關。接種細胞數量大、細胞基數大、相同增殖速度條件下，細胞數量增加與飽和速度相對要快（實際上細胞接種數量大時細胞增殖速度比稀少時要快）。連續(xù)細胞系和腫瘤細胞系比初代培養(yǎng)細胞增殖快，培養(yǎng)液中血清含量多時細胞增殖比少時快。以上情況都會縮短傳代時間。

所謂細胞“一代”一詞，系僅指從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習慣說法，它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代（Generation）或倍增〔Doubling〕不同；在細胞一代中，細胞能倍增3～6次。

細胞傳一代后，一般要經過以下三個階段：

1．潛伏期（LatentPhase）：細胞接種培養(yǎng)后，先經過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時細胞胞質回縮，胞體呈圓球形。接著是細胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結束。各種細胞貼附速度不同，這與細胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質等密切相關。初代培養(yǎng)細胞貼附慢，可長達10～24小時或更多；連續(xù)細胞系和惡性細胞系快，10～30分鐘即可貼附。細胞貼附現(xiàn)象是一個非常復雜和與多種因素相關的過程。支持物能影響細胞的貼附；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中，有一些特殊物質如纖維連接素（Fibronectin），又稱LETS（LargerExternalTransformationSubstance），細胞表面蛋白（CellSurfaceProtein：CSP）等也參與貼附過程。這些物質都是蛋白類成分，它們有的存在于細胞膜的表面（如CSP），有的則來自培養(yǎng)基中的血清（LETS）。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質。貼附是貼附類細胞生長增殖條件之一。

細胞貼附于支持物后，除先經過前述延展過程變成極性細胞，還要經過一個潛伏階段，才進入生長和增殖期。細胞處在潛伏期時，可有運動活動，基本無增殖，少見分裂相。細胞潛伏期與細胞接種密度、細胞種類和培養(yǎng)基性質等密切相關。初代培養(yǎng)細胞潛伏期長，約24～96小時或更長，連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅6～24小時；細胞接種密度大時潛伏期短。當細胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標志細胞已進入指數增生期。

2．指數增生期（LogarithmicgrowthPhase）：這是細胞增值最旺盛的階段，細胞分裂相增多。指數增生期細胞分裂相數量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標志。一般以細胞分裂（MitoticIndex：MI）表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數。體外培養(yǎng)細胞分裂指數受細胞種類、培養(yǎng)液成分、pH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細胞的分裂指數介于0.1%～0.5%，初代細胞分裂指數低，連續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂指數可高達3%～5%。pH和培養(yǎng)液血清含量變動對細胞分裂指數有很大影響。指數增生期是細胞一代中活力最好的時期，因此是進行各種實驗最好的和最主要的階段。在接種細胞數量適宜情況下，指數增生期持續(xù)3～5天后，隨細胞數量不斷增多、生長空間漸趨減少、最后細胞相互接觸匯合成片。細胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（ContactInhibition）。而惡性細胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細胞標志之一。腫瘤細胞由于無接觸抑制能繼續(xù)移動和增殖，導致細胞向三維空間擴展，使細胞發(fā)生堆積（Piledup）。細胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數量仍在增多。但當細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產物增多時，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制（DensityInhibition），導致細胞分裂停止。因此細胞接觸抑制和密度抑制是兩個不同的概念，不應混淆。

3．停滯期（StagnatePhase）：細胞數量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。此時細胞數量不再增加，故也稱平頂期（Plateau）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產物積累、pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細胞的機能狀態(tài)。在這種情況下，雖進行了傳代，因細胞已受損，需要恢復，至少還要再傳1～2兩代，通過換液淘汰掉死細胞和使受損輕微的細胞得以恢復后，才能再用。結果反而耽誤了時間，這是在實驗中應特別注意的。

四、原代培養(yǎng):即第一次培養(yǎng)，是指將培養(yǎng)物放置在體外生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。有幾方面含義：

●培養(yǎng)物一經接種到培養(yǎng)器皿（瓶）中就不在分割，任其生長繁殖；

●原代培養(yǎng)中的“代”并非細胞的“代”數，因為培養(yǎng)過程中細胞經多次分裂已經產生多代子細胞；

●原代培養(yǎng)過程中不分割培養(yǎng)物不等于不更換培養(yǎng)液，也不等于不更換培養(yǎng)器皿。

正常細胞培養(yǎng)的世代數有限，只有癌細胞和發(fā)生轉化的細胞才能無限生長下去。所謂轉化即是指正常細胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而具有癌性的細胞。目前世界上許多實驗室所廣泛傳用的HeLa細胞系就是1951年從一位名叫HenriettaLacks的婦女身上取下的宮頸癌細胞培養(yǎng)而成。此細胞系一直延用至今。

原代培養(yǎng)的細胞一般傳至10代左右就不易傳下去了，細胞的生長就會出現(xiàn)停滯，大部分細胞衰老死亡。但是有極少數的細胞能夠度過“危機”而繼續(xù)傳下去，這些存活的細胞一般能夠傳到40～50代，這種傳代細胞叫做細胞株。細胞株的遺傳物質沒有發(fā)生改變,在培養(yǎng)過程中其特征始終保持。當細胞株傳至50代以后又會出現(xiàn)“危機”，不能再傳下去。但是有部分細胞的遺傳物質發(fā)生了改變，并且?guī)в邪┳兊奶攸c，有可能在培養(yǎng)條件下無限制地傳代下去，這種傳代細胞稱為細胞系。

原代培養(yǎng)是建立各種細胞系（株）必經的階段，其是否成功與組織污染與否、供體年齡、培養(yǎng)技術和方法、適宜培養(yǎng)基的選擇等多種因素有關。由于原代培養(yǎng)的細胞轉化性極小，對病毒敏感性好，因此適應制備疫苗等生物制品；但也存在有潛在外源因子、不能事先檢查標本、且受供體年齡健康狀況的影響而導致批間差異大等缺陷。目前常用的原代細胞培養(yǎng)有雞胚成纖維細胞及豬腎、猴腎、地鼠腎等原代細胞。

原代培養(yǎng)的基本過程包括取材、培養(yǎng)材料的制備、接種、加培養(yǎng)液、置培養(yǎng)條件下培養(yǎng)等步驟，在所有的操作過程中，都必須保持培養(yǎng)物及生長環(huán)境的無菌。

多數情況下，分散的細胞若屬于貼壁依賴型細胞，就能黏附、鋪展于培養(yǎng)器皿和載體表面生長而形成細胞單層，這種培養(yǎng)方式稱為單層細胞培養(yǎng)（monolayerculture），又叫貼壁培養(yǎng)（adherentculture）。少數情況下，培養(yǎng)的細胞沒有貼壁依賴性，可通過專門設備使細胞始終處于懸狀態(tài)而在體外生長，這種形式稱為懸浮培養(yǎng)（suspensionculture）。如何讓接種的細胞盡快貼壁，是決定培養(yǎng)成功的關鍵步驟：

●取決于適當的生長基質表面；

●可降低接種后培養(yǎng)液對細胞的浮力，如先少補加少量培養(yǎng)液，待細胞貼壁后再補足營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；

●注意適當的細胞接種密度，一般105個/ml左右。

五、傳代培養(yǎng):當原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時間的延長和細胞不斷分裂，一則細胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止；另一方面也會因營養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于生長或發(fā)生中毒。此時就需要將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內，再進行培養(yǎng)。這個過程就稱為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）。對單層培養(yǎng)而言，80%匯合或剛匯合的細胞是較理想的傳代階段。

體外培養(yǎng)技術中所謂的傳“代”概念并不等于細胞生物學中“親代細胞”與“子代細胞”中“代”的概念。傳代培養(yǎng)的實質就是分割后再一次培養(yǎng)，可以相對地衡量培養(yǎng)物的培養(yǎng)年齡。

六、生長曲線:細胞接種入培養(yǎng)瓶后，先進入2-24h的延遲期（lagperiod），然后進入指數生長期（即對數期）（logphase），匯合成單層進入緩慢生長或停滯期（即平臺期）（plateaulhase）。每種細胞系（cellline）的這些生長期（growthphase）都是特征性的，只要環(huán)境條件保持恒定，每一次測定結果應該是可重復的。第二節(jié)細胞分離技術

一、從原代組織中分離細胞將組織塊分離（散）成細胞懸液的方法有多種，最常用的是機械解離細胞法、酶學解離細胞法以及螯合劑解離細胞法。

從原代組織中獲得單細胞懸液的一般方法是酶解聚。細胞暴露在酶中的時間要盡可能的短，以保持最大的活性。下列步驟可以解聚整個組織，獲得較高產量的有活性細胞。

1.胰蛋白酶(Trypsin)

●在去除不需要的組織后，使用無菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4mm小片，通過懸浮在無鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀，去除上清液。重復清洗2到3次。

●將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液。加入0.25％溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶（100mg組織加入1ml胰蛋白酶）。

●在4℃孵育6到18小時，使幾乎沒有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進去。

●移棄組織碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘。

●在組織碎片加入熱的完全培養(yǎng)基，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養(yǎng)基，要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。

●通過無菌不銹鋼絲網（100～200mm）過濾，分散所有剩余組織。計數和接種細胞，進行培養(yǎng)。

2.膠原酶(Collagenase)

●用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mm小片，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗組織碎片幾次。

●加入膠原酶（50～200單位/ml，溶解在HBSS中）。

●在37℃孵育4到18小時。加入3mMCaCl2增加解離效率。

●通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液，以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶。

●通過離心在HBSS中清洗懸液幾次。

●再一次在培養(yǎng)基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進行培養(yǎng)。

3.Dispase

●用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mm小片，用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次。

●加入Dispase（0.6～2.4單位/ml溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液）

●在37℃孵育20分鐘到幾個小時。

●通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液，以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚，在碎片中加入新鮮的Dispase。

●通過離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次。

●再一次在培養(yǎng)基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進行培養(yǎng)。

二、從原培養(yǎng)容器中分離細胞:以下是從基層迅速分離細胞，且保持細胞完整性的一般步驟。這一步驟并不意味著對于所有細胞系的廣泛應用，每一種系統(tǒng)最佳條件和施用濃度應該根據經驗加以確定。

●再次培養(yǎng)時檢測細胞的活性。

●細胞的活率應該超過90％

●對于無血清培養(yǎng)基，降低胰蛋白酶使用量。

1.移棄使用過的細胞培養(yǎng)基。

2.使用不包含有鈣鎂的平衡鹽溶液或EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸.)清洗細胞（看表確定正確的清洗溶液）。在培養(yǎng)瓶對著細胞的一面加入清洗溶液，通過轉動培養(yǎng)瓶1到2分鐘清洗細胞層，然后去除清洗液。

3.以2～3ml/25cm2的量，加選擇的分離液(見表)到培養(yǎng)瓶對著細胞的一面。確保分離液覆蓋細胞層。在37℃孵育培養(yǎng)瓶，輕輕搖動培養(yǎng)瓶。通常，在5到15分鐘內，細胞就會脫落。細胞分離需要的時間因細胞系不同而有所變化。仔細監(jiān)測細胞分離過程，避免細胞受損傷。對難于從培養(yǎng)瓶基層分離的細胞系，可以輕輕敲打，以加速分離過程。

4.當細胞完全分離時，垂直放置培養(yǎng)瓶，讓細胞流到培養(yǎng)瓶的底部。在培養(yǎng)瓶中加入完全培養(yǎng)基，通過移液管在單層細胞表面反復吹打來分散細胞。計數并再次培養(yǎng)細胞。

5.對于無血清培養(yǎng)基，加入大豆胰蛋白酶抑制劑。通常使用1∶1（v∶v）0.25mg/ml胰蛋白酶抑制劑到胰蛋白酶中將抑制胰蛋白酶活性。

第三節(jié)細胞的凍存與復蘇

為了防止因污染或技術原因使長期培養(yǎng)功虧一簣，考慮到培養(yǎng)細胞因傳代而遲早會出現(xiàn)變異，有時因寄贈、交換和購買，培養(yǎng)細胞從一個實驗室轉運到另一個實驗室，最佳的策略是進行低溫保存。這對于維持一些特殊細胞株的遺傳特性極為重要?，F(xiàn)簡要介紹深低溫保存法(－70℃~－196℃)的特點。細胞深低溫保存的基本原理是：在－70℃以下時，細胞內的酶活性均己停止，即代謝處于完全停止狀態(tài)，故可以長期保存。細胞低溫保存的關鍵，在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內，水晶呈針狀，極易招致細胞的嚴重損傷。

一、細胞的凍存:為避免污染造成的損失，最小化連續(xù)細胞系的遺傳改變和避免有限細胞系的老化和轉化，需要凍存哺乳細胞。凍存細胞前，細胞應該特性化并檢查是否污染。

有幾種普通培養(yǎng)基用來凍存細胞。對于包含有血清的培養(yǎng)基，成分可能如下：

◆包含10％甘油的完全培養(yǎng)基，

◆包含10％二甲基亞砜（DMSO）的完全培養(yǎng)基，

◆50％細胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％甘油的新鮮培養(yǎng)基，或

◆50％細胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％二甲基亞砜的新鮮培養(yǎng)基。

對于無血清培養(yǎng)基，一些普通的培養(yǎng)基成分可能是：

◆50％細胞條件無血清培養(yǎng)基和50％包含有7.5％二甲基亞砜的新鮮的無血清培養(yǎng)基，或

◆包含有7.5％二甲基亞砜和10％細胞培養(yǎng)級BSA的新鮮無血清培養(yǎng)基。

1.懸浮細胞

●計數將要凍存的活細胞。細胞應該處于對數生長期。以大約200～400g離心5分鐘沉淀細胞，使用移液管移去上清到最小體積，不要攪亂細胞。

●以1×107到5×107細胞/ml密度，在包含有血清的冷凍培養(yǎng)基中再次懸浮細胞，或者以0.5×107到1×107在無血清培養(yǎng)基中，再次懸浮細胞。

●分裝進凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內開始冷凍步驟。

●細胞以1℃/分鐘進行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉移到液氮中貯存。

2.貼壁細胞

●使用分離試劑從基層分離細胞，分離時盡可能溫和，使對細胞的損傷減少到最小。

●在完全生長培養(yǎng)基中，再次懸浮分離細胞，確定有活力細胞數。

●以大約200g離心5分鐘沉淀細胞。使用移液管移去上清到最小體積，不要攪亂細胞。

●以5×106到1×106細胞/ml密度，在凍存液中懸浮細胞。

●分裝進凍存管，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內開始冷凍步驟。

●細胞以1℃/分鐘進行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉移到液氮中貯存。

二、凍存細胞的復蘇:凍存細胞較脆弱，要輕柔操作。凍存細胞要快速融化，并直接加入完全生長培養(yǎng)基中。若細胞對凍存劑（DMSO或