內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療專家講座

內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與抗血管新生治療

中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院

楊霞

yangxia@內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第1頁(yè)目錄凋亡（apoptosis）血管新生（angiogenesis）內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與抗血管新生治療內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第2頁(yè)apoptosis概述凋亡過(guò)程與調(diào)控發(fā)生機(jī)制凋亡與疾病內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第3頁(yè)(一)細(xì)胞凋亡(apoptosis)第一節(jié)概述★由體內(nèi)外原因觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存死亡程序而造成細(xì)胞死亡過(guò)程。apo-ptosis離開落下PCD（programmedcelldeath）內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第4頁(yè)一.細(xì)胞凋亡研究歷史1.

凋亡概念形成和形態(tài)學(xué)研究(1972）

1972年Kerr等在英國(guó)癌癥雜志發(fā)表論文，首次提出細(xì)胞凋亡(apoptosis)概念。宣告了對(duì)細(xì)胞凋亡真正探索開始。2．DNA降解和內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶參加(1987）3.蛋白質(zhì)水解酶活化研究(1995)4.細(xì)胞膜改變(1997)5.線粒體改變和分子生物學(xué)研究(1998-)1)相關(guān)基因及調(diào)控

2）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

3）各種分子及其相互作用及相互關(guān)系

4）疾病機(jī)制說(shuō)明，以及新療法探索及問(wèn)世。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第5頁(yè)

二.概念

細(xì)胞凋亡是能量依賴細(xì)胞內(nèi)死亡程序活化而致細(xì)胞自殺，由基因控制細(xì)胞自主有序主動(dòng)死亡過(guò)程。

細(xì)胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）

PCD最初是1956年發(fā)育生物學(xué)中提出概念，是個(gè)功效性概念，強(qiáng)調(diào)是其分子生物學(xué)和生理功效，普通指生理性細(xì)胞死亡。描述在一個(gè)多細(xì)胞生物體中一些細(xì)胞死亡是個(gè)體發(fā)育中一個(gè)預(yù)定，并受到嚴(yán)格程序控制正常組成部分。細(xì)胞凋亡與壞死區(qū)分

內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第6頁(yè)P(yáng)rogrammedCellDeathinEukaryotes內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第7頁(yè)(二)細(xì)胞凋亡與壞死區(qū)分★壞死凋亡1.性質(zhì)病理性，非特異性,非遺傳性生理性或病理性，特異性遺傳性2.誘導(dǎo)原因強(qiáng)烈刺激（極端環(huán)境），隨機(jī)發(fā)生較弱刺激，非隨機(jī)發(fā)生3.生化特點(diǎn)被動(dòng)過(guò)程，無(wú)新蛋白合成，主動(dòng)過(guò)程，有新蛋白合成，不耗能耗能4.形態(tài)改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)全方面溶解、破壞、胞膜及細(xì)胞器相對(duì)完整細(xì)胞腫脹細(xì)胞皺縮，核固縮5.DNA電泳彌散性降解，電泳呈均一DNA片段化（180-200bp）

DNA片狀電泳呈“梯”狀條帶6.炎癥反應(yīng)溶酶體破裂，局部炎癥反應(yīng)溶酶體相對(duì)完整，局部無(wú)炎癥反應(yīng)7.凋亡小體無(wú)有8.基因調(diào)控?zé)o有內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第8頁(yè)apoptosis概述

確保胚胎發(fā)生、器官發(fā)育，調(diào)整細(xì)胞群體

維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定

發(fā)揮主動(dòng)防御功效凋亡生理意義凋亡病理意義

器官功效障礙惡性腫瘤發(fā)生(三)凋亡意義內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第9頁(yè)apoptosis概述凋亡過(guò)程與調(diào)控發(fā)生機(jī)制凋亡與疾病內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第10頁(yè)第二節(jié)細(xì)胞凋亡過(guò)程與調(diào)控一、凋亡過(guò)程二、凋亡時(shí)細(xì)胞主要改變?nèi)?、凋亡調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第11頁(yè)apoptosis凋亡過(guò)程與調(diào)控一、凋亡過(guò)程可大致分成4個(gè)階段

凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

凋亡基因激活

凋亡執(zhí)行

凋亡細(xì)胞去除內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第12頁(yè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡誘導(dǎo)原因受體cAMPCa2+神經(jīng)酰胺（第二信使）胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑激活凋亡程序死亡信號(hào)開啟預(yù)定程序凋亡相關(guān)基因激活酶合成核酸內(nèi)切酶激活Caspases激活DNA切割細(xì)胞解體凋亡基因激活執(zhí)行凋亡去除內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第13頁(yè)apoptosis生化改變凋亡過(guò)程與調(diào)控二、凋亡時(shí)細(xì)胞主要改變

形態(tài)學(xué)改變內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第14頁(yè)apoptosis（一）凋亡時(shí)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變凋亡過(guò)程與調(diào)控細(xì)胞變圓微絨毛消失胞質(zhì)濃縮空泡化凋亡小體

早期：核染色質(zhì)高度濃縮凝集在核周圍,邊集細(xì)胞體積縮小中期：胞膜內(nèi)陷出芽濃縮核裂解膜自行分割致死前期可逆期致死期不可逆期原期：鄰近上皮細(xì)胞、MΦ、瘤細(xì)胞等吞噬凋亡小體內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第15頁(yè)（二）細(xì)胞凋亡生化改變apoptosis凋亡過(guò)程與調(diào)控1．DNA片段化核酸內(nèi)切酶切割核小體，形成180～200bp或成倍數(shù)幾個(gè)核小體長(zhǎng)短DNA片段細(xì)胞凋亡DNA片段化內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第16頁(yè)2．和凋亡相關(guān)兩個(gè)酶DNaseCaspasesCa2+

、Mg2+Zn2+內(nèi)源性促凋亡滅活細(xì)胞凋亡抑制物（bcl-2）水解細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中水解相關(guān)活性蛋白內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第17頁(yè)Caspases種類及其底物新名稱舊名底物Caspase-1ICEPro-IL-1β,PKC-δ,actin,pro-cas1,3Caspase-2ICH-1?Caspase-3CPP32/Yama/apopainPARP,Pro-cas6,9,DNA-PKcs,U1-70kDCaspase-4ICErel-Ⅱ/ICH-2Pro-IL-1β，Pro-cas1Caspase-5ICErel-Ⅲ?Caspase-6Mch2PARP,B1/B2,CCaspase-7Mch3／ICE-LAP3/CMH1PARPCaspase-8FLICE/MACH/Mch5PARPCaspase-9ICE-LAP6/Mch6PARPCaspase-10Mch4Pro-cas3,7PARP:poly(ADP-Ribose)polymerase此表摘自T1B5，1997，7：111內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第18頁(yè)apoptosis凋亡過(guò)程與調(diào)控信號(hào)TNF相關(guān)蛋白存活原因缺失化療藥品發(fā)育信號(hào)Caspases活化因子死亡受體細(xì)胞色素C釋放Apaf-1FADD起始Caspase效應(yīng)CaspaseCaspase-3（-6，-7）Caspase8（-10）Caspase-9執(zhí)行凋亡（裂解凋亡調(diào)控因子，裂解看家蛋白，DNA斷裂）Caspases活化與級(jí)聯(lián)反應(yīng)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第19頁(yè)apoptosis凋亡相關(guān)基因三、凋亡調(diào)控凋亡調(diào)控凋亡相關(guān)原因

凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第20頁(yè)apoptosis細(xì)胞因子：IL-2，神經(jīng)生長(zhǎng)因子，IL-6,IL-4凋亡調(diào)控（一）凋亡相關(guān)原因誘導(dǎo)性原因：激素和生長(zhǎng)因子失衡:過(guò)多或過(guò)少理化原因：射線、高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿，抗癌藥免疫性原因：微生物學(xué)原因：細(xì)菌、病毒、毒素抑制性原因：一些激素:ACTH，性激素，CSFs，NGF一些癌基因或細(xì)胞凋亡相關(guān)基因:內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第21頁(yè)誘導(dǎo)因子細(xì)胞類型T細(xì)胞抗原受體胸腺細(xì)胞Fas/Apo激活胸腺細(xì)胞及其它細(xì)胞TNF-α

各種細(xì)胞細(xì)胞毒性T細(xì)胞溶解受感染細(xì)胞糖皮質(zhì)激素淋巴細(xì)胞DNA損傷各種細(xì)胞谷氨酸神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGFβ1）肝細(xì)胞細(xì)菌感染巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡原因內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第22頁(yè)抑制凋亡原因細(xì)胞生長(zhǎng)因子細(xì)胞類型各種細(xì)胞因子造血原始干細(xì)胞

IL-2T淋巴細(xì)胞抗原B細(xì)胞

IL-5嗜酸性粒細(xì)胞神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）神經(jīng)元血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）膠質(zhì)細(xì)胞雌激素，黃體酮乳腺，子宮平滑肌雄激素前列腺血清表示c-myc纖維母細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第23頁(yè)apoptosis（二）凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡調(diào)控多途性：同一凋亡誘導(dǎo)原因可經(jīng)過(guò)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑觸發(fā)凋亡多樣性：不一樣種類細(xì)胞有不一樣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)偶聯(lián)性：死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)與細(xì)胞增殖、分化過(guò)程中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在一些步驟上有交叉、偶聯(lián)

同一性：不一樣凋亡誘導(dǎo)原因可經(jīng)過(guò)同一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑觸發(fā)凋亡凋亡誘導(dǎo)原因凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)死亡程序激活apoptosis特點(diǎn)：內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第24頁(yè)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)1.胞內(nèi)Ca2+信號(hào)系統(tǒng)激活鈣依賴谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶活化核轉(zhuǎn)錄因子，觸發(fā)凋亡2.cAMP/PKA信號(hào)系統(tǒng)cAMP依賴PKA激活，靶蛋白殘基磷酸化，蛋白功效改變3.Fas/FasL信號(hào)系統(tǒng)Fas是跨膜蛋白，為TNF受體家族，與T細(xì)胞上FasL結(jié)合，開啟凋亡內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第25頁(yè)Fas誘發(fā)凋亡方式：Fas配體＋Fas蛋白+神經(jīng)鞘磷脂酶(SMase)神經(jīng)鞘磷脂(SM)神經(jīng)酰胺(CER)＋蛋白激酶DNA斷裂細(xì)胞凋亡抗Fas抗體或TNF與Fas蛋白結(jié)合＋I(xiàn)CE樣Caspase組蛋白降解染色體松弛DNA鏈?zhǔn)嬲姑盖形稽c(diǎn)暴露Fas蛋白激活Ca2+信號(hào)系統(tǒng)傳遞死亡信息內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第26頁(yè)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)4.神經(jīng)酰胺（CER）信號(hào)系統(tǒng)神經(jīng)鞘磷脂（SM）神經(jīng)酰胺（第二信使）電離輻射TNF-αFas抗原GCapoptosisPLA2SMase絲／蘇氨酸激酶(EGFR)絲／蘇氨酸磷酸酶(CAPP)PKC底物抑制增生各種細(xì)胞反應(yīng)誘導(dǎo)NFkB下調(diào)c-myc表示環(huán)氧酶機(jī)制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第27頁(yè)神經(jīng)酰胺水解鞘氨醇激酶1－磷酸鞘氨醇（SPP）細(xì)胞增殖抗凋亡轉(zhuǎn)錄因子（AP-1）S期運(yùn)轉(zhuǎn)所需基因轉(zhuǎn)錄＋內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第28頁(yè)5.二酰甘油／PKC信號(hào)系統(tǒng)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)磷脂酰肌醇磷脂酰膽堿PLC二酰甘油（第二信使）PKCβ1apoptosis生長(zhǎng)因子受體PTKGsGiTCRPLCPIP2IP3Ca2+DGPKC核內(nèi)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ磷酸化DNA損傷凋亡離子通道G蛋白磷酸化cAMP增加凋亡內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第29頁(yè)6.酪氨酸蛋白激酶(PTK)信號(hào)系統(tǒng)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)生長(zhǎng)因子（NGF，EGF）細(xì)胞因子（IL-3）PTK靶蛋白上酪氨酸磷酸化rasraf-1MAPKKMAPK靶蛋白磷酸化細(xì)胞分化生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子撤除apoptosis內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第30頁(yè)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第31頁(yè)（三）凋亡相關(guān)基因細(xì)胞生存抑凋亡凋亡促凋亡BaxICEwtP53EIBIAPBcl-2內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第32頁(yè)1.Bcl-2抗凋亡能阻抑各種凋亡誘導(dǎo)原因引發(fā)細(xì)胞凋亡機(jī)制：直接抗氧化抑制線粒體釋放促凋亡蛋白質(zhì)抑制促凋亡性調(diào)整蛋白Bax,Bak細(xì)胞毒作用抑制caspases激活維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第33頁(yè)2.P53促凋亡wtP53突變P53功效：在細(xì)胞周期G1期發(fā)揮檢驗(yàn)點(diǎn)作用開啟DNA修復(fù)機(jī)制開啟凋亡機(jī)制分子警察細(xì)胞受損P53表示P16P27表示CDK抑制RbE2FG1SMycjunfos內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第34頁(yè)3.C-mycBcl-xC-myc一個(gè)癌基因誘導(dǎo)細(xì)胞增殖有生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡無(wú)生長(zhǎng)因子（轉(zhuǎn)錄調(diào)整因子）機(jī)制：誘導(dǎo)凋亡功效區(qū)與促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，本身調(diào)整區(qū)是同一個(gè)區(qū)域。C-myc表示信號(hào)細(xì)胞增殖＋第二信號(hào)細(xì)胞凋亡MAX1(P21),2(p22)MAD/MAX內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第35頁(yè)Bcl-xBcl-XL抑制細(xì)胞凋亡Bcl-Xs促進(jìn)細(xì)胞凋亡（與bcl-2同源）（與bcl-2同源氨基酸少，抑制）內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第36頁(yè)apoptosis概述凋亡過(guò)程與調(diào)控發(fā)生機(jī)制凋亡與疾病內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第37頁(yè)apoptosis第三節(jié)發(fā)生機(jī)制一、氧化損傷（自由基作用）1、引發(fā)DNA損傷，可激活P53基因。2、引發(fā)DNA損傷可活化多聚ADP核糖合成酶，引發(fā)NAD

快速耗竭，ATP大量消耗，引發(fā)細(xì)胞凋亡。3、引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，直接造成細(xì)胞膜損傷可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，不飽和脂肪酸過(guò)氧化產(chǎn)物促凋亡。4、激活核酸內(nèi)切酶，膜發(fā)泡。5、引發(fā)細(xì)胞膜通透性增高（Ca2+內(nèi)流增加）和線粒體膜損傷6、活化核轉(zhuǎn)錄因子，可加速凋亡相關(guān)基因表示。機(jī)制：內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第38頁(yè)apoptosis二、鈣穩(wěn)態(tài)失衡發(fā)生機(jī)制1、激活鈣鎂依賴性核酸內(nèi)切酶，降解DNA鏈2、激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，催化細(xì)胞內(nèi)肽鏈間酰基轉(zhuǎn)移，使骨架蛋白交聯(lián)形成，有利于凋亡小體形成。3、激活核轉(zhuǎn)錄因子，加速細(xì)胞凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。4、Ca2+在ATP配合下使DNA舒展，暴露出核小體之間連接區(qū)內(nèi)酶切位點(diǎn)。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第39頁(yè)apoptosis三、線粒體損傷發(fā)生機(jī)制凋亡誘導(dǎo)原因線粒體跨膜電位↓線粒體膜通透性增加

細(xì)胞凋亡開啟因子釋放CytC,Apaf,AIF等釋放增強(qiáng)caspase3水解活性活化Dnase激活Caspases細(xì)胞凋亡通透性轉(zhuǎn)換孔（PTP）開放核基因編碼膜間蛋白快速內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第40頁(yè)apoptosis概述凋亡過(guò)程與調(diào)控發(fā)生機(jī)制凋亡與疾病內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第41頁(yè)apoptosis不足與過(guò)分并存：動(dòng)脈粥樣硬化

(內(nèi)皮凋亡過(guò)分,平滑肌細(xì)胞增殖＞凋亡)第四節(jié)凋亡與疾病凋亡失調(diào)過(guò)分：心肌缺血、心力衰竭、神經(jīng)元退行性疾?。ɡ夏臧V呆癥）、病毒感染等不足：腫瘤、本身免疫病內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第42頁(yè)一、細(xì)胞凋亡不足（一）腫瘤Bcl-2基因表示增加P53異常（突變，缺失）基因轉(zhuǎn)染（二）本身免疫病胚胎期各種組織器官成熟識(shí)別本身抗原淋巴細(xì)胞凋亡凋亡不足攻擊本身組織內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第43頁(yè)二、細(xì)胞凋亡過(guò)分（一）心血管疾病1．心肌缺血再灌注損傷機(jī)制：氧化應(yīng)激缺血缺氧使心肌細(xì)胞死亡受體上調(diào)，F(xiàn)as/FasL配體信號(hào)系統(tǒng)激活缺氧增加P53基因轉(zhuǎn)錄，開啟凋亡內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第44頁(yè)2.心力衰竭機(jī)制：氧化應(yīng)激壓力或容量負(fù)荷過(guò)分神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)（交感神經(jīng)，RAAS，TNF，IL-2，NO）缺血缺氧正常心肌凋亡指數(shù)0.2%-0.4%心衰時(shí)≥35.5%內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管新生治療第45頁(yè)（二）神經(jīng)退行性疾病以特定神經(jīng)元進(jìn)行性喪失為病理特征疾病AD，alzhemer’sdiseasePD，Parkinson’sdise