HIV樣品采集和處理

HIV樣品的采集和處理

海南省皮膚病醫(yī)院檢驗科

喬鳳皮膚性病防治中心1現(xiàn)在是1頁\一共有34頁\編輯于星期一主要內(nèi)容1各種檢測的基本知識2樣品采集的種類3操作步驟4影響因素2現(xiàn)在是2頁\一共有34頁\編輯于星期一基本知識

HIV檢測方法

抗體檢測、抗原檢測、核酸檢測、耐藥檢測、CD4+和CD8+T淋巴細胞測定、HIV分離培養(yǎng)

樣品的種類

全血、血清、血漿、細胞、唾液、尿液、濾紙干血斑

支持性文件:《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》(2009)、《艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴細胞檢測質(zhì)量保證指南》(2006)、《HIV-1病毒載量測定及質(zhì)量保證指南》(2008)、《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運輸管理規(guī)定》(衛(wèi)生部45號令，2006)3現(xiàn)在是3頁\一共有34頁\編輯于星期一基本知識step4step3step2step1檢測方法樣品種類采集處理保存運輸樣品采集處理選擇策略檢測方法：依據(jù)檢驗?zāi)康倪x擇。樣品種類：實驗方法、檢測試劑和儀器要求。采集處理：采血方法、抗凝管的選擇、采血量、離心分離、多項檢測保存運輸：溫度、時限、容器4現(xiàn)在是4頁\一共有34頁\編輯于星期一樣品種類

HIV抗體檢測：全血、血清、血漿、唾液、尿液、DBS

CD4+和CD8+T淋巴細胞測定：抗凝全血

病毒載量檢測：血漿

耐藥、基因型檢測：血漿、DBS核酸定性檢測：全血、血漿、淋巴細胞、DBS分離培養(yǎng)：全血、淋巴細胞5現(xiàn)在是5頁\一共有34頁\編輯于星期一抗病毒治療的目標病毒學(xué)目標：最大程度地減少病毒載量，將其維持在不可檢測水平的時間越長越好免疫學(xué)目標：維持免疫功能，獲得免疫功能重建和/或部分免疫重建終極目標：延長生命并提高生活質(zhì)量6現(xiàn)在是6頁\一共有34頁\編輯于星期一病毒載量與CD4+T計數(shù)

HIVinfectionJ.Coffin,XIInternationalConf.onAIDS,Vancouver,1996AIDS病程：一列迫近懸崖的列車病毒載量=火車的速度CD4+T計數(shù)=離懸崖的距離抗病毒治療：制動火車的外力7現(xiàn)在是7頁\一共有34頁\編輯于星期一病毒載量與CD4+T計數(shù)8現(xiàn)在是8頁\一共有34頁\編輯于星期一病毒載量與CD4+T計數(shù)

CD4細胞(cell/mm3）800400

急性感染期

無癥狀期

艾滋病前期和艾滋病期

CD4

病毒載量抗HIV的CTLHIV抗體9現(xiàn)在是9頁\一共有34頁\編輯于星期一HAART的目標UltimateGoalofHAARTRelativeLevelsMonthsYearsAfterHIVInfectionCD4+T-cellsPlasmaHIVViremiaAcuteHIVinfectionSymptomLimitofdetection10現(xiàn)在是10頁\一共有34頁\編輯于星期一HIV-1病毒載量檢測代表的是病毒的負荷，即體內(nèi)復(fù)制的病毒的數(shù)量體內(nèi)復(fù)制的病毒的數(shù)量是不能直接測量的，一般用血漿中RNA的拷貝數(shù)代表HIV的病毒載量簡單來講是通過測量從而顯示每毫升血液里病毒的數(shù)量定量機體內(nèi)游離病毒的含量11現(xiàn)在是11頁\一共有34頁\編輯于星期一病毒載量檢測的意義急性HIV感染，窗口期復(fù)制高峰每毫升血液RNA拷貝可達9×107，一年以后仍然可達2-4×104判定病人疾病的進程和進展。血漿中病毒水平是病毒增殖和免疫清除機制共同作用的結(jié)果，CD4+T細胞越少顯示病毒載量水平越高12現(xiàn)在是12頁\一共有34頁\編輯于星期一病毒載量檢測的意義監(jiān)測與指導(dǎo)抗病毒治療過程，ART早期HIVRNA水平快速下降，并在相當長的一段時間維持在一個比較平緩的水平，大部分患者可以下降到檢測不出的水平觀察耐藥性13現(xiàn)在是13頁\一共有34頁\編輯于星期一HIV-1病毒載量檢測方法病毒載量檢測主要有三種方法：bDNA、RT-PCR及NASBANASBA檢測是通過核酸釋放、提取、核酸擴增(NASBA擴增)及核酸檢測來完成對血漿中HIV病毒RNA的定量測定生物梅里埃公司將NASBA核酸擴增技術(shù)與實驗時(real-time)檢測技術(shù)結(jié)合起來，“分子信標實時擴增檢測技術(shù)”，能夠?qū)z測進行實時監(jiān)控，即稱為“EasyQ”14現(xiàn)在是14頁\一共有34頁\編輯于星期一病毒載量檢測樣品采集運輸保存HIV-1，血漿樣品EDTA抗凝真空無菌采血管全血5ml或3ml*2,采集的樣品量應(yīng)盡可能與定量采血管的刻度一致，采集量過多或不足，會造成血液凝固或被稀釋。采集血液后，立即輕輕上下顛倒抗凝管約10次，使血液與抗凝劑充分混勻，避免劇烈振蕩導(dǎo)致溶血15現(xiàn)在是15頁\一共有34頁\編輯于星期一病毒載量檢測樣品采集運輸保存務(wù)必在采集全血的4小時內(nèi)分離血漿，室溫下1500-3000r/min離心15分鐘送檢血漿2管，每管>1ml，冷凍(藏)運輸血漿樣本3天內(nèi)送檢可在2-8℃暫時保存，1個月以內(nèi)應(yīng)凍存于-20℃以下，1年以內(nèi)應(yīng)置于-70℃以下血漿樣品凍融不應(yīng)超過3次16現(xiàn)在是16頁\一共有34頁\編輯于星期一病毒載量檢測結(jié)果的解釋單位：copies/ml檢測限：20cps/ml(0.5ml)；10cps/ml(1ml);100cps/ml(0.1ml)結(jié)果舉例：

＜20copies/ml(檢測到HIV核酸，但是低于方法檢測下限，無法定量)TND(未檢出，使用現(xiàn)有的檢測方法對本次樣本未檢測到HIV核酸)17現(xiàn)在是17頁\一共有34頁\編輯于星期一樣品處理對病毒載量結(jié)果的影響一般地講，血漿中病毒載量水平比血清中的要高出30％～80％用EDTA抗凝劑的采血管采集全血后分離血漿樣本，其HIVRNA含量比ACD和肝素抗凝管相應(yīng)含量多10％～15％及20％～25％18現(xiàn)在是18頁\一共有34頁\編輯于星期一樣品處理對病毒載量結(jié)果的影響采集全血后的3-6小時RNA丟失量最大，血漿樣本RNA丟失低于全血樣本。1小時以內(nèi)，EDTA抗凝管RNA丟失約10％，ACD抗凝管丟失約20％；6小時以內(nèi)，肝素抗凝管RNA丟失約30％。19現(xiàn)在是19頁\一共有34頁\編輯于星期一樣品處理對病毒載量結(jié)果的影響血漿樣本在-20℃冰柜保存3-14個月，與起始病毒載量水平值(0月)相比，3個月時變化沒有顯著性差異；6個月后下降值明顯，有隨著保存時間延長病毒載量水平下降幅度越大的趨勢。在-20℃冰柜內(nèi)保存6個月，樣本病毒載量水平已不能真實反映樣本采集之初的水平，對疾病進展和療效評價，尤其對回顧性研究已無指導(dǎo)意義。20現(xiàn)在是20頁\一共有34頁\編輯于星期一樣品處理對病毒載量結(jié)果的影響-20℃條件下凍融3次比凍融1次HIVRNA降低約20％。許多研究者用多種檢測方法和不同人群樣本的研究結(jié)果證實，技術(shù)和生物因素對樣本RNA水平的影響是持續(xù)的和可預(yù)測的，大約在0.3-0.6log/ml之間。21現(xiàn)在是21頁\一共有34頁\編輯于星期一CD4+T淋巴細胞測定進行性且選擇性地消耗CD4細胞是HIV感染的特征。CD4細胞減少與機會感染增高相結(jié)合并且在個體感染HIV后病情呈進行性。CD4細胞殘余數(shù)在臨床預(yù)后治療監(jiān)測和新型抗逆轉(zhuǎn)錄病毒以及疫苗的臨床試驗入選標準工作中是最經(jīng)常利用的實驗室測量項目22現(xiàn)在是22頁\一共有34頁\編輯于星期一CD4+T淋巴細胞測定準確及時地對殘留CD4細胞計數(shù)，不僅是評價性試驗，也是對存活的HIV感染者實施治療與關(guān)懷的一部分CD4細胞減少與機會感染增加和病情發(fā)展相聯(lián)系

CD4細胞計數(shù)為HIV感染臨床分期、疾病進展監(jiān)測、機會性感染的風險評估、抗病毒治療適應(yīng)癥選擇及療效評價的實驗室指標23現(xiàn)在是23頁\一共有34頁\編輯于星期一流式細胞術(shù)(FCM)FCM是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。FALSSensorLaser24現(xiàn)在是24頁\一共有34頁\編輯于星期一流式細胞術(shù)特點單細胞的流動的活細胞的定量的多參數(shù)的高統(tǒng)計學(xué)精度的分選細胞25現(xiàn)在是25頁\一共有34頁\編輯于星期一CD4+T淋巴細胞測定的方法CD4+和CD8+T淋巴細胞計數(shù)的方法分為兩大類，一類是應(yīng)用流式細胞儀測定法，另一類是非流式細胞儀測定法常用的淋巴細胞計數(shù)檢測方法為自動檢測方法，包括流式細胞儀（主要有多平臺法和單平臺法）和專門的細胞計數(shù)儀26現(xiàn)在是26頁\一共有34頁\編輯于星期一雙平臺法雙平臺方法是一種細胞群體的絕對計數(shù)方法，利用血球計數(shù)儀檢測淋巴細胞數(shù)量，再根據(jù)流式細胞儀得到的細胞群體百分比，計算得到每微升的淋巴細胞數(shù)量。雙平臺法需要兩種儀器，由于儀器有系統(tǒng)誤差，計算結(jié)果的重復(fù)性和準確性影響因素較多，導(dǎo)致不同實驗室計數(shù)結(jié)果差異很大。最大的缺點在于操作步驟復(fù)雜，操作人員多、費時，因此很難將變異水平減小到最低。27現(xiàn)在是27頁\一共有34頁\編輯于星期一單平臺法應(yīng)用三色、四色流式試劑配以內(nèi)參絕對計數(shù)微球，加上流式細胞儀淋巴細胞亞群獲取和分析軟件，一步即可獲得T細胞亞群的相對數(shù)(百分比)和絕對數(shù)。單平臺法最大程度地減少了多個儀器檢測帶來的檢測誤差，細胞絕對計數(shù)結(jié)果的重復(fù)性和準確性都得到了良好的保證。28現(xiàn)在是28頁\一共有34頁\編輯于星期一CD4細胞計數(shù)樣品的采集運輸抗凝全血K2EDTA/K3EDTA抗凝真空無菌采血管采樣量：成人采集靜脈血5ml，采集兒童靜脈血樣品建議用兒童型注射器和小試管(2ml)，采集嬰兒樣品較為困難，用小試管采集0.5-1ml即可樣品混勻：采集的靜脈血注入抗凝管后，立即輕輕顛倒抗凝管6-8次，使血液與抗凝劑充分混勻，防止血液凝固，避免劇烈振蕩導(dǎo)致溶血29現(xiàn)在是29頁\一共有34頁\編輯于星期一CD4細胞計數(shù)樣品的采集運輸采血時間：鑒于CD4+T淋巴細胞數(shù)日間自然變化的個體差異，每一病人采樣時間應(yīng)盡可能集中在某個相同的時段運輸條件：37℃以上的溫度會破壞細胞，使血液學(xué)和流式儀的檢測結(jié)果受到影響。因此應(yīng)在室溫(18-25℃)保存和運輸樣品，避免極端溫度(結(jié)冰或大于37℃)。高溫季節(jié)，需用隔熱容器盛裝樣品，并將其置于有冰袋和吸熱物質(zhì)的容器中樣品應(yīng)存放于室溫，不得冰凍保存，并且在24小時之內(nèi)送達檢測實驗室30現(xiàn)在是30頁\一共有34頁\編輯于星期一CD4細胞計數(shù)結(jié)果解釋CD4+T淋巴細胞是T輔助淋巴細胞。報告該值的正確細胞是CD3和CD4全部雙陽性的細胞絕對計數(shù)和百分比。CD45陽性細胞是所有白細胞的計數(shù)。結(jié)果報告單中附有參考范圍(例如，CD4+T淋巴細胞絕對數(shù)和百分數(shù))。31現(xiàn)在是31頁\一共有34頁\編輯于星期一CD4細胞計數(shù)的影響因素CD4+T淋巴細胞水平會受到一些因素的影響，采血前應(yīng)了解患者的狀況。服用腎上腺皮質(zhì)激素，急性病毒感染以及術(shù)后病人等均不宜采血。影響因素影響結(jié)果Zidovudine(AZT)使細胞易碎性增加使紅細胞對裂解試劑的敏感性降低散射光變暗(粒細胞和RBC污染淋巴細胞門)一些抗菌素(如頭孢菌素cephalosporins)使細胞的自身熒光增強增強自身熒光皮質(zhì)醇類Corticosteroids降低CD4+T淋巴細胞水平降低CD4+T淋巴細胞百分率和絕對值強烈的鍛煉降低淋巴細胞數(shù)降低淋巴細胞亞群絕對數(shù)每天的變化淋巴細胞絕對值的改變淋巴細胞亞群絕對數(shù)變化32現(xiàn)在是32頁\一共有34頁\編輯于星期一檢測項目樣品類型抗凝劑采