Waters高效液相色譜維護(hù)與保養(yǎng)

Waters液相色譜維護(hù)保養(yǎng)以下課件是我在使用、操作、高效液相色譜儀十年中積累的經(jīng)驗(yàn)，以及集合外部學(xué)習(xí)的經(jīng)驗(yàn)所寫，如有講的不好、錯(cuò)誤之處，請(qǐng)大家及時(shí)指出，我們共同學(xué)習(xí)！質(zhì)檢：現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一Waters高效液相色譜常見(jiàn)故障與解析第一部分常用術(shù)語(yǔ)第二部簡(jiǎn)述HPLC的組成第三部分主要講液相常見(jiàn)故障與解析|第四部分簡(jiǎn)談示差檢測(cè)的原理第五部分：色譜柱的維護(hù)與保養(yǎng)現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一第一部分術(shù)語(yǔ)1、液相色譜法：就是用液體作為流動(dòng)相的色譜法。2、固定相：在色譜法中，靜止不動(dòng)的一相（固體或液體）稱為固定相3、流動(dòng)相：能運(yùn)動(dòng)的一相（一般是氣體或液體）稱為流動(dòng)相4、色譜圖：色譜柱流出物通過(guò)檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間的曲線圖。縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度（通常我們所說(shuō)的樣品濃度），橫坐標(biāo)為保留時(shí)間。

5、基線：在無(wú)組分通過(guò)色譜柱時(shí)，檢測(cè)器的噪音隨時(shí)間變化而產(chǎn)生的曲線現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一術(shù)語(yǔ)6、基線噪聲:沒(méi)有溶質(zhì)通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，檢測(cè)器輸出信號(hào)的隨機(jī)擾動(dòng)變化。（就是沒(méi)有打進(jìn)樣品而直接查看基線時(shí)所產(chǎn)生的雜峰）

7、基線漂移：基線隨時(shí)間的增加朝單一方向的偏離稱為漂移。反映的是信號(hào)連續(xù)的遞增和遞減。產(chǎn)生原因：電源電壓不穩(wěn)、色譜系統(tǒng)未達(dá)到平衡、固定相流失、流動(dòng)相的變化、溫度和流量的波動(dòng)現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一術(shù)語(yǔ)8、色譜峰：色譜柱流出組分通過(guò)檢測(cè)器時(shí)產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)的微分曲線。9、峰底：峰的起點(diǎn)與終點(diǎn)間的直線10、峰高：在峰的兩側(cè)拐點(diǎn)處所作切線與峰底相交兩點(diǎn)之間的距離。

11、半峰寬（W1/2）：通過(guò)峰高的中點(diǎn)做平行與峰底的直線，與其峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)間的距離。

12、峰面積（A）：峰與峰底間的面積，又稱作響應(yīng)值。13、拖尾峰：后沿較前沿平緩的不對(duì)稱峰。14、前伸峰：前沿較后沿平緩的不對(duì)稱峰現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一術(shù)語(yǔ)15、死時(shí)間（t0）:不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出峰最大之所需的時(shí)間16、保留時(shí)間（tR）：組分從進(jìn)樣到出峰最大之所需的時(shí)間。17、死體積（V0）：不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出峰最大之所需的流動(dòng)相的體積18、柱外體積

：從進(jìn)樣系統(tǒng)到檢測(cè)器之間色譜柱以外的液路部分中流動(dòng)相所占有的體積。19、淋洗體積

：從進(jìn)樣開(kāi)始計(jì)算的通過(guò)色譜柱的實(shí)際淋洗體積現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一術(shù)語(yǔ)20、反相色譜柱

反相色譜填料常是以硅膠為基礎(chǔ)，表面鍵合有極性相對(duì)較弱的官能團(tuán)的鍵合相。反相色譜所使用的流動(dòng)相極性較強(qiáng)，通常為水，緩沖液與甲醇，已腈等混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)組合最先被沖出，而極性弱的組份會(huì)在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一術(shù)語(yǔ)21、排阻色譜又稱凝膠色譜或凝膠滲透色譜，是利用被分離物質(zhì)分子量大小的不同和在填料上滲透程度的不同，以使組分分離。它類似于分子篩的作用，按分子大小進(jìn)行分離。試樣進(jìn)入色譜柱后，隨流動(dòng)相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過(guò)。在試樣中一些太大的分子不能進(jìn)入膠孔而受到排阻，因此就直接通過(guò)柱子，首先在色譜圖上出現(xiàn)，一些很小的分子可以進(jìn)入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最后出現(xiàn)。例如：我們常用的ks-802色譜柱現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一第一部分術(shù)語(yǔ)22、面積歸一法：將所有峰的面積總和定為1，測(cè)量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計(jì)算各峰面積占總峰面積的百分率。是包含水分在內(nèi)的一個(gè)計(jì)算結(jié)果?，F(xiàn)在是9頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一第一大部分術(shù)語(yǔ)23.面積外標(biāo)法：外表法就是用標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積或峰高與其對(duì)應(yīng)的濃度做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)出樣品的峰面積或峰高,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其對(duì)應(yīng)的濃度,這是最常用的一種定量方法通過(guò)進(jìn)標(biāo)樣建立一個(gè)校正曲線（一般是6針標(biāo)樣）。校正曲線的橫坐標(biāo)是標(biāo)樣的濃度（含量），縱坐標(biāo)是峰面積；校正曲線就相當(dāng)于：Y=aX+b的公式。校正曲線建立好后樣品的峰面積帶入方程就可以得到相應(yīng)的濃度（含量）。現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)輸液系統(tǒng)泵以及流動(dòng)相進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣閥分離系統(tǒng)-色譜柱檢測(cè)系統(tǒng)11第二部分HPLC的組成數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一Waters515泵現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一輸液系統(tǒng)——輸13輸出流量恒定壓力平穩(wěn)足夠的動(dòng)力高壓輸液泵現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一Waters2414示差檢測(cè)器現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一15檢測(cè)系統(tǒng)現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一進(jìn)樣系統(tǒng)16手動(dòng)進(jìn)樣現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)N2000色譜工作站現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一18第三部分液相常見(jiàn)故障及解決方案現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一19從泵的壓力變化推測(cè)

原因解決方法1、電源問(wèn)題1、接通電源，開(kāi)機(jī)2、保險(xiǎn)絲被燒壞2、更換保險(xiǎn)絲3、柱塞桿折斷4、更換柱塞桿4、泵頭內(nèi)有空氣5、啟動(dòng)泵抽出空氣5、流動(dòng)相不足6、吸濾頭堵5、補(bǔ)充流動(dòng)相6、更換或超聲入口濾頭7、單向閥損壞7、更換單向閥8、漏液8、擰緊或更換手緊接頭A、泵內(nèi)沒(méi)有壓力顯示，沒(méi)有流動(dòng)相流動(dòng)現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一20從壓力變化推測(cè)

原因解決方法1、電源問(wèn)題1、接通電源，開(kāi)機(jī)2、保險(xiǎn)絲被燒壞2、更換保險(xiǎn)絲3、柱塞桿折斷4、更換柱塞桿4、泵頭內(nèi)有空氣5、啟動(dòng)泵抽出空氣5、流動(dòng)相不足6、吸濾頭堵5、補(bǔ)充流動(dòng)相6、更換或超聲入口濾頭7、單向閥損壞7、更換單向閥8、漏液8、擰緊或更換手緊接頭A、沒(méi)有壓力顯示，沒(méi)有流動(dòng)相流動(dòng)現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一21原因解決方法1、柱塞桿折斷1、更換柱塞桿2、壓力傳感器損壞2、更換壓力傳感器B、流動(dòng)相流動(dòng)正常，但沒(méi)有壓力顯示B、泵內(nèi)有液流出，但使沒(méi)有壓力顯示現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一22原因解決方法1、流速設(shè)定過(guò)高1、調(diào)整流速設(shè)定2、柱前篩板堵塞2、a、反沖色譜柱b、更換色譜柱3、流動(dòng)相使用不當(dāng)或緩沖鹽的結(jié)晶沉淀3、a、使用恰當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相b、沖洗色譜柱4、色譜柱選擇不當(dāng)4、選擇恰當(dāng)?shù)纳V柱5、柱溫過(guò)低5、提高溫度6、保護(hù)柱阻塞6、清洗或更換保護(hù)柱7、在線過(guò)濾器阻塞7、清洗或更換在線過(guò)濾器C、壓力高“堵”現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一23原因解決方法1、流速設(shè)定過(guò)低1、調(diào)整流速2、系統(tǒng)漏液2、確定漏液位置并維修3、色譜柱選擇不當(dāng)3、選擇恰當(dāng)?shù)纳V柱4、柱溫過(guò)高4、降低溫度5、壓力傳感器或工作站失常5、更換壓力傳感器，重裝工作站或系統(tǒng)。D、壓力低“漏”現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一24H、壓力波動(dòng)原因解決方法1、泵中有氣體1、a、溶劑脫氣b、從泵中除去氣體2、單向閥損壞2、超聲或更換單向閥3、泵密封損壞3、更換泵密封圈4、系統(tǒng)漏液4、確定漏液位置并維修5、使用梯度洗脫5、由于流動(dòng)相粘度的變化引起，充分平衡系統(tǒng)

E、壓力波動(dòng)現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一25從色譜圖的異常情況推測(cè)A、基線漂移原因解決方法1、溫度變化1、室內(nèi)恒溫，或使用柱溫箱2、系統(tǒng)未平衡2、充分用流動(dòng)相平衡3、流動(dòng)相組成變化3、溶劑瓶密封，現(xiàn)用現(xiàn)配4、梯度洗脫4、空白梯度充分平衡系統(tǒng)5、色譜柱鍵合相流失5、更換色譜柱現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一26B、基線噪聲“氣泡，污染”原因解決方法1、系統(tǒng)內(nèi)存在氣泡（流動(dòng)相，檢測(cè)器，管路，泵）1、流動(dòng)相脫氣，沖洗系統(tǒng)2、系統(tǒng)污染2、逐一排查，沖洗系統(tǒng)3、流動(dòng)相不互溶3、選擇互溶的流動(dòng)相4、混合器混合效果不好4、維修或更換混合器，或者不走梯度時(shí)用單一泵5、氘燈能量不足5、更換氘燈現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一27C.保留時(shí)間變化“柱壓，流速”原因解決方法1、溫度變化1、室內(nèi)恒溫，或使用柱溫箱2、系統(tǒng)未平衡2、充分用流動(dòng)相平衡3、流動(dòng)相組成變化3、溶劑瓶密封，現(xiàn)用現(xiàn)配4、色譜柱污染4、強(qiáng)溶劑洗脫5、色譜柱壽命6、流速變化7、柱壓變化5、更換色譜柱6、排查引起流速改變的因素7、排查引起柱壓改變的因素現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一如何判斷入口單向閥是否正常的簡(jiǎn)易方法？

在泵運(yùn)行過(guò)程中將溶劑吸濾頭從流動(dòng)相中拿出，放進(jìn)一小段氣泡進(jìn)入溶劑管路，進(jìn)行觀察。氣泡運(yùn)行狀態(tài)判斷措施一走一停正常一走一停一退入口單向閥受到污染，單向效果不好，有部分回流超聲清洗一走一退入口單向閥失效，無(wú)單向作用清洗或更換現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一樣品處理：使用流動(dòng)相溶解樣品，保證樣品的溶解度，減少溶劑峰；進(jìn)樣前使用0.45um或更小的膜進(jìn)行過(guò)濾。手動(dòng)進(jìn)樣：應(yīng)使用液相色譜專用平頭進(jìn)樣針吸液至少大于5-10倍定量環(huán)體積

轉(zhuǎn)動(dòng)閥芯時(shí)不能太慢，更不能停留在中間位置29進(jìn)樣的注意事項(xiàng)現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一2414示差檢測(cè)器原理示差檢測(cè)器是基于連續(xù)測(cè)定樣品流路和參比流路之間折射率的變化來(lái)測(cè)定樣品含量的。光從一種介質(zhì)進(jìn)入另一種介質(zhì)時(shí)，由于兩種物質(zhì)的折射率不同就會(huì)產(chǎn)生折射。只要樣品組分與流動(dòng)相的折光指數(shù)不同，就可被檢測(cè)，二者相差愈大，靈敏度愈高，在一定濃度范圍內(nèi)檢測(cè)器的輸出與溶質(zhì)濃度成正比現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一示差折光檢測(cè)器原理檢測(cè)器的光路是由光源、凸鏡、檢測(cè)池、反射鏡、平板玻璃、雙光敏電阻等主要部件組成，檢測(cè)池有參比，測(cè)量?jī)蓚€(gè)池室，它們對(duì)光路來(lái)說(shuō)是串聯(lián)的?，F(xiàn)在是31頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一示差檢測(cè)器原理現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一第四部分色譜柱的維護(hù)與保養(yǎng)1、鈣柱：此色譜柱由鈣基樹(shù)脂填裝而成，氫離子或其它離子會(huì)取代鈣離子，或是引起與柱中糖的轉(zhuǎn)換，尤其是像蔗糖這樣易于轉(zhuǎn)換的糖，因此推薦在流動(dòng)相中加入一定量的鈣離子不保持平衡和防止與樣品的轉(zhuǎn)換。

要保持裝流動(dòng)相的瓶子干凈，有蓋子，且新鮮，流動(dòng)相需要每24小時(shí)重新配制?，F(xiàn)在是33頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一新的鈣柱使用注意事項(xiàng)2新色譜柱的使用：為了保證新柱子能在分析使用之前得到足夠的鈣離子的平衡1）將柱子按照通常使用的反方向安裝（標(biāo)簽上的箭頭指向柱子的入端口）；2）用至少100ml的0.001MEDTA鈣鹽溶液在90℃用0.5ml/min流速反沖柱子，500mg/L的鈣鹽的濃度大約為0.001M；

3）將柱子反過(guò)來(lái)（回到通常的流動(dòng)方向）用分析所用流動(dòng)相沖柱子，（用與上一上步驟同樣的條件）直到基線平穩(wěn)方可使用。

現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一鈣柱再生的時(shí)間3、柱子再生的時(shí)間：根據(jù)相關(guān)的樣品含有較多重金屬和過(guò)渡金屬元素或是有機(jī)酸的樣品越是需要經(jīng)常地對(duì)柱子進(jìn)行再生，因?yàn)樗鼈儠?huì)與柱子發(fā)生轉(zhuǎn)換。

檢測(cè)是否需要再生可以通過(guò)注射蔗糖來(lái)測(cè)試柱子的置換，如果蔗糖的峰有明顯拖尾，那么柱子需要做以下處理：現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一第四部分色譜柱的維護(hù)與保養(yǎng)4柱子的再生步驟：1）

配制500ml的再生溶液（500mgEDTA_Ca/L

2）

把柱子流路方向反過(guò)來(lái)，在90℃下以0.5ml/min的流速?zèng)_洗一整夜；

3）

再生之后回到正常方向使用。

當(dāng)柱子反沖時(shí)，很重要的一點(diǎn)是需要保持溶劑的溫度從而確保正確的沖洗，用冷的溶劑將會(huì)延緩沖洗的過(guò)程?，F(xiàn)在是36頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一使用鈣柱注意的事項(xiàng)5、通常推薦壓力不超過(guò)2000psi，最大流速不超過(guò)0.6ml/min(70℃)。

⊙不要在流動(dòng)相中使用氯化鈣，硝酸鈣以及其它強(qiáng)酸的鈣鹽，這樣會(huì)腐蝕柱子，破壞填料?！阎拥臏囟炔灰^(guò)95℃。通常高溫會(huì)帶來(lái)高的分辨率，但在90~95℃之間幾乎沒(méi)有變化，70℃以下對(duì)許多糖的異構(gòu)體的分離不能提供足夠的分離度，對(duì)于乙醇的定量，柱溫應(yīng)在75℃現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一KS-802鈉型柱新色譜柱鈉型柱以ks802柱子為代表：1、新色譜柱的使用：為了保證新柱子能在分析使用之前要得到足夠的鈉離子的平衡1）將柱子按照通常使用的反方向安裝（標(biāo)簽上的箭頭指向柱子的入端口）；2）用至少100ml的0.002MNAOH溶液在50℃用0.2ml/min流速反沖柱子，4h以上。

3）將柱子反過(guò)來(lái)（回到通常的流動(dòng)方向）用分析所用流動(dòng)相沖即無(wú)二氧化碳的純水沖洗柱子，（用與上一上步驟同樣的條件）直到基線平穩(wěn)方可使用。

現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一KS-802色譜柱再生的時(shí)間柱子再生的時(shí)間：根據(jù)相關(guān)的樣品含有較多