線蟲的分類鑒定

線蟲的分類鑒定第1頁/共39頁2一、植物線蟲分類的基本概念和內(nèi)容二、植物線蟲的形態(tài)分類特征三、植物線蟲的分類地位和分類系統(tǒng)概述四、常見植物線蟲屬的的鑒定特征和一般生物學(xué)特性

第三節(jié)植物病原線蟲的分類要求：了解植物病原線蟲分類的基本概念和內(nèi)容，掌握植物線蟲的形態(tài)分類特征，分類地位和分類系統(tǒng)，了解常見植物線蟲屬的鑒定特征和鑒定方法。第2頁/共39頁3一、植物線蟲分類的基本概念和內(nèi)容植物線蟲分類的目的和內(nèi)容主要包括以下幾個方面:

(1)鑒定：研究區(qū)分和確定植物線蟲的各個種類，按照國際動物命名法規(guī)予以命名，并加以描述，提供正確識別和辨別線蟲種類的知識和資料。

(2)分類：根據(jù)線蟲種類之間的異同及親緣關(guān)系，確定其所屬的分類階元層次，制定分類系統(tǒng)。

(3)系統(tǒng)學(xué)：探尋線蟲種類的起緣及其之間的親緣關(guān)系，追溯其進(jìn)化過程。

(4)分類學(xué)：狹義的植物線蟲分類學(xué)是研究植物線蟲分類的方法和理論，廣義的植物線蟲分類學(xué)就是研究上述諸內(nèi)容的一門科學(xué)。第3頁/共39頁4

植物線蟲分類的基本概念和內(nèi)容

植物線蟲分類學(xué)：是運(yùn)用比較、分析和歸納等方法，依據(jù)線蟲表達(dá)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的性狀或性狀組合，對植物線蟲進(jìn)行鑒定、命名和排序，制定可以反映植物線蟲進(jìn)化過程或闡明各類群內(nèi)在關(guān)系的分類系統(tǒng)，進(jìn)而揭示植物線蟲的起源及各種群之間的親緣關(guān)系，同時不斷探索新的分類方法和理論。

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植物線蟲分類鑒定的依據(jù)形態(tài)學(xué)生物化學(xué)細(xì)胞遺傳學(xué)鑒別寄主分子生物學(xué)第5頁/共39頁6二、植物線蟲的形態(tài)分類特征形態(tài)特征是最直觀、最常用的分類特征。但僅僅依靠形態(tài)特征難以區(qū)別一些種類，特別是一些近緣種。所以有必要使用形態(tài)以外的其他性狀特征，如遺傳學(xué)性狀、生理生化性狀、分子性狀以及生態(tài)、行為、地理等性狀都已開始應(yīng)用于植物線蟲的分類鑒定。形態(tài)性狀往往明顯地反映生物進(jìn)化、反映物類(或物種)的親緣關(guān)系及生活關(guān)系，所以目前植物線蟲分類，主要還是以形態(tài)性狀為基礎(chǔ)的形態(tài)分類。第6頁/共39頁7

植物線蟲的形態(tài)分類特征目前，植物線蟲形態(tài)分類所依據(jù)的特征，主要是外部和內(nèi)部形態(tài)特征。外部形態(tài)特征主要包括體形、角質(zhì)層結(jié)構(gòu)、頭部和尾部特征，內(nèi)部形態(tài)特征主要包括消化系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)特征等。植物線蟲各發(fā)育時期的形態(tài)以及雌、雄蟲的形態(tài)均有差異，分類定種，多數(shù)是依據(jù)成熟雌蟲的形態(tài)，異形蟲的年青雌蟲形態(tài)也是重要定種依據(jù)。幼蟲和雄蟲形態(tài)一般不作為定種的主要依據(jù)，只作為參考和輔助依據(jù)。第7頁/共39頁8

植物線蟲的形態(tài)分類特征在植物線蟲的分類鑒定中，數(shù)量特征和質(zhì)量特征均用于種的鑒定上；屬及其以上高級階元的鑒定一般主要依據(jù)質(zhì)量特征。第8頁/共39頁9

植物線蟲的形態(tài)分類特征（一）形態(tài)特征測計(數(shù)量特征)關(guān)于數(shù)量特征的測量計算，DeMan(1880)提出一套公式，后來該公式又得到補(bǔ)充和完善。第9頁/共39頁10

植物線蟲的形態(tài)分類特征（二）形態(tài)特征描述(質(zhì)量特征)

1.外部形態(tài)結(jié)構(gòu)

(1)體形和死態(tài)

(2)角質(zhì)層

①環(huán)紋：細(xì)、粗、中等，表面光滑或有外生附著物；②側(cè)區(qū)：縱線或刻線數(shù)，是否有網(wǎng)紋，網(wǎng)紋所在部位、寬度及其占蟲體寬的比例；③縱脊或縱線：側(cè)區(qū)以外是否有縱脊或縱線。

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植物線蟲的形態(tài)分類特征(3)頭部①總的形態(tài)：球形、半圓形、圓錐形等，前緣平、平圓、圓等，高、低環(huán)紋數(shù)等；②與體部有無明顯界限：無縊縮(連續(xù))、微縊縮、縊縮；③唇區(qū)結(jié)構(gòu)及形態(tài)：唇區(qū)位于頭部前端，其模式結(jié)構(gòu)是兩個側(cè)唇瓣、兩個亞背唇瓣和兩個亞腹唇瓣；呈輻射狀排列，唇區(qū)的形態(tài)特征是重要的依據(jù)；④頭架：角質(zhì)化或骨化或硬化的程度(強(qiáng)、弱或顯著、不顯著)；⑤側(cè)器：口腔兩側(cè)各有一個側(cè)器，側(cè)器口的形狀也是重要的分類依據(jù)。第11頁/共39頁12

植物線蟲的形態(tài)分類特征

(4)乳突(papilla)：頭乳突、頸乳突、交配乳突、泄殖腔唇乳突和尾乳突等是常用的鑒定特征。

(5)尾部(tail)①尾部長度：長、短；②尾形：細(xì)或?qū)拡A筒形、細(xì)或?qū)拡A錐形(對稱或不對稱)、絲狀、棒狀、桿狀等；③尾末端形態(tài)：銳尖、尖、細(xì)尖、鈍尖、平、平圓、半圓，光滑、有環(huán)紋等；④尾端上有無附著結(jié)構(gòu)：尾突(尾末端上突起)、尾尖突(尾突上的突起或很細(xì)的尾突)及其形態(tài)和個數(shù)等；⑤尾腹環(huán)數(shù)：尾部較短并且環(huán)紋清楚的類群常要數(shù)尾腹部環(huán)紋數(shù)。第12頁/共39頁13

植物線蟲的形態(tài)分類特征2.內(nèi)部結(jié)構(gòu)(1)消化系統(tǒng)(digestivesystem)①口針：粗、細(xì)，有無基部球及基部球形態(tài)(球形、凸緣狀、郁金香形、錨狀等)。②食道：食道類型及結(jié)構(gòu)在高級階元的分類上非常重要。③食道腺開口：滑刃目線蟲背食道腺開口位于中食道球，墊刃目線蟲背食道腺開口位于口針基部球后的食道前體部，這兩類線蟲的2個亞腹食道腺開口位于中食道球，墊刃目線蟲的背食道腺開口與口針基部球的距離是一些種、屬的重要鑒定特征。④腸：在分類鑒定中意義不大。⑤肛門：常描述的是該處體寬，有的肛門略凸起，也只作為描述特征，不作為鑒定檢索特征。第13頁/共39頁14

植物線蟲的形態(tài)分類特征(2)生殖系統(tǒng)：線蟲的生殖系統(tǒng)很發(fā)達(dá)，是分類上重要性狀。雌蟲生殖系統(tǒng)的描述：

①生殖腺單個(前伸或后伸)、1對(對伸或前伸)；②單個生殖腺的是否有后陰子宮囊，后陰子宮囊長度；③生殖腺的長、短；④卵巢直伸或轉(zhuǎn)折(1、2或多個轉(zhuǎn)折)；⑤卵母細(xì)胞單行、雙行或多行排列；⑥受精囊有或無；⑦子宮：是否有卵、卵的多少、長度(較少描述)；⑧陰道：長度(占陰門處體寬的比)，垂直體中軸或斜向前(后)伸；⑨陰門：位置，陰門形態(tài)：橫裂、縱裂、孔狀。第14頁/共39頁15

植物線蟲的形態(tài)分類特征雄蟲生殖系統(tǒng)的描述：

①生殖腺單或雙，長度，若單生殖腺則其前伸或后伸(一般前伸)，是否轉(zhuǎn)折；②貯精囊是否明顯；③交合刺形態(tài)：瑰玫刺狀、新月狀、鐮刀狀等；④引帶有無；⑤交合傘有無及其長度，與尾的位置關(guān)系。貯精囊第15頁/共39頁16

植物線蟲的形態(tài)分類特征(3)排泄系統(tǒng)：排泄孔的位置，有時要描述排泄管角質(zhì)化程度。(4)神經(jīng)系統(tǒng)：側(cè)尾腺是線蟲高級階元的重要分類特征，在紐帶科中，側(cè)尾腺口的形態(tài)和位置也是種、屬的重要鑒定特征；雄蟲泄殖腔前后的乳突統(tǒng)稱生殖乳突，也是重要的分類鑒定特征；神經(jīng)環(huán)和半月體通常作為描述特征，有時也作為種的鑒定特征。第16頁/共39頁17

植物線蟲的其他鑒定方法1.生物化學(xué)鑒定法（雌蟲的同功酶圖譜）第17頁/共39頁18

植物線蟲的其他鑒定方法2.鑒別寄主方法：鑒別寄主反應(yīng)：煙草、棉花、辣椒、西瓜、花生、番茄等。鑒別寄主

Differentialhost煙草

Tobacco棉花

Cotton辣椒

Pepper西瓜

Watermelon花生

Peanut番茄

Tomato結(jié)果Results+--+-+鑒別寄主反應(yīng)注：“+”表示該植物能被侵染；“-”表示該植物不能被侵染第18頁/共39頁19

植物線蟲的其他鑒定方法3.分子生物學(xué)方法（1）PCR

（2）rDNA-ITS

（3）PCR-RFLP

（4）RAPD

（5）SSR-PCR

（6）分子雜交第19頁/共39頁20近年來，越來越多的分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用到植物病原線蟲學(xué)研究領(lǐng)域,在植物線蟲病害診斷、分類以及流行學(xué)調(diào)查方面得到廣泛應(yīng)用，下面詳細(xì)介紹PCR、PCR-RFLP、RAPD、分子雜交等目前常用的分子技術(shù)。第20頁/共39頁21（1）多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）PCR技術(shù)基本原理：類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使之成為單鏈；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；第21頁/共39頁22引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，2～3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。第22頁/共39頁23最后這種DNA片段能在普通瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。觀察瓊脂糖凝膠中DNA最常用的方法是利用熒光染料溴化乙錠進(jìn)行染色，它含有一個可以嵌入DNA堆積堿基之間的一個三環(huán)平面基團(tuán)。溴化乙錠在標(biāo)準(zhǔn)302nm紫外光透射儀激發(fā)下放射出橙紅色信號，可用凝膠成像處理系統(tǒng)拍攝。第23頁/共39頁24PCR電泳圖第24頁/共39頁25應(yīng)用實(shí)例：第25頁/共39頁26rDNA-ITS鑒定根結(jié)線蟲（2）rDNA-ITS鑒定根結(jié)線蟲第26頁/共39頁27rDNA-ITS測序后同源性聚類分析的系統(tǒng)進(jìn)化樹第27頁/共39頁28（3）PCR-RFLP方法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）法的原理是：采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增目的DNA片段，然后將待檢測的DNA片段用限制性內(nèi)切酶酶切，限制性內(nèi)切酶識別并切割特異的序列，然后將酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，再由限制酶圖譜分析此段序列的特異切位點(diǎn)，由片段的多樣性來比對不同來源基因序列的差異性。第28頁/共39頁29第29頁/共39頁30應(yīng)用實(shí)例第30頁/共39頁31（4）RAPD技術(shù)隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA，RAPD技術(shù)建立于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上,它是利用一系列(通常數(shù)百個)不同的隨機(jī)排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常為10聚體)為引物,對所研究基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增.聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離,經(jīng)EB染色或放射性自顯影來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性,這些擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。第31頁/共39頁32

植物線蟲的其他鑒定方法M.incognitaM.javanicaM.arenariaRAPD-PCR鑒定根結(jié)線蟲第32頁/共39頁33應(yīng)用實(shí)例第33頁/共39頁34（5）SSR-PCR技術(shù)由于真核生物中富含CA重復(fù)序列，SSR－PCR就是針對高度密集的CA微衛(wèi)星體簡單重復(fù)序列，設(shè)計與之互補(bǔ)的重復(fù)CA堿基作引物擴(kuò)增其重復(fù)片段，從而揭示其多態(tài)性。第34頁/共39頁35（6）分子雜交技術(shù)核酸的分子雜交(molecularhybridization)技術(shù)是目前生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，是定性或定量檢測特異RNA或DNA序列片段的有力工具。它是利用核酸分子的堿基互補(bǔ)原則而發(fā)展起來的。在堿性環(huán)境中加熱或加入變性劑等條件下，雙鏈DNA之間的氫鍵被破壞(變性)，雙鏈解開成兩條單鏈。這時加入異源的DNA或RNA(單鏈)并在一定離子強(qiáng)度和溫度下保溫(復(fù)性)，若異源DNA或RNA之間的某些區(qū)域有互補(bǔ)的堿基序列，則在復(fù)性時