分子標(biāo)記輔助選擇育種

第十四章分子標(biāo)記輔助選擇育種作物育種：創(chuàng)造變異，選擇優(yōu)良變異傳統(tǒng)育種選擇方法：根據(jù)植株的表現(xiàn)型選擇缺點：依靠育種家經(jīng)驗；育種年限長；受環(huán)境條件影響大（如抗病、抗蟲等）通過與目標(biāo)性狀的基因連鎖的、易于識別的性狀作為標(biāo)記，對目標(biāo)性狀進(jìn)行間接選擇（相關(guān)選擇）第一節(jié)分子標(biāo)記輔助選擇的意義現(xiàn)在是1頁\一共有90頁\編輯于星期一遺傳標(biāo)記：可遺傳的、特殊的、易于識別的表現(xiàn)形式遺傳標(biāo)記類型：形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記、分子標(biāo)記分子標(biāo)記：直接反應(yīng)基因組間DNA差異的遺傳標(biāo)記分子標(biāo)記輔助選擇：通過與目標(biāo)性狀的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記來判斷控制目標(biāo)性狀的基因是否存在優(yōu)點：不需要考慮作物生長條件和環(huán)境條件；減少基因互作干擾；快速壘集目標(biāo)基因，加快育種進(jìn)程；減少群體種植規(guī)模等現(xiàn)在是2頁\一共有90頁\編輯于星期一簡稱RFLP標(biāo)記第二節(jié)分子標(biāo)記的類型及原理一、分子標(biāo)記的類型1、以DNA-DNA雜交為基礎(chǔ)的DNA標(biāo)記技術(shù)（insituhybridization）限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記（Restrictionfragmentlengthpolymorphisms）可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)記（Variablenumberoftandemrepeats）簡稱VNTR標(biāo)記原位雜交簡稱ISH現(xiàn)在是3頁\一共有90頁\編輯于星期一2、基于PCR的DNA標(biāo)記1）單引物PCR標(biāo)記2）雙引物選擇性擴增的PCR標(biāo)記3）通過克隆、測序來構(gòu)建特殊雙引物的PCR標(biāo)記。

現(xiàn)在是4頁\一共有90頁\編輯于星期一限制性酶切片段的選擇性擴增3、基于PCR與限制性內(nèi)切酶技術(shù)相結(jié)合的DNA標(biāo)記分為兩類PCR擴增片段的限制性酶切如AFLP如CAPs現(xiàn)在是5頁\一共有90頁\編輯于星期一Singlenucleotidepolymorphism，4、基于單核苷多態(tài)性的DNA標(biāo)記單核苷酸多態(tài)性簡稱SNP現(xiàn)在是6頁\一共有90頁\編輯于星期一用限制性內(nèi)切酶酶切不同個體的基因組DNA后，含有與探針序列同源的酶切片段在長度上的差異。二、主要分子標(biāo)記1、RFLP（RestrictionFragmentLengthpo1ymorpams）限制性片段長度多態(tài)性1980，Bostein現(xiàn)在是7頁\一共有90頁\編輯于星期一堿基替換、插入、缺失或重復(fù)造成某種限制性內(nèi)切酶（restrictionenzymes）酶切位點的增加或喪失以及內(nèi)切酶酶切位點間DNA片段變化基因組DNA序列上的變化（1）RFLP標(biāo)記的原理現(xiàn)在是8頁\一共有90頁\編輯于星期一（2）RFLP標(biāo)記的分析步驟現(xiàn)在是9頁\一共有90頁\編輯于星期一

（3）RFLP標(biāo)記的特點優(yōu)點①數(shù)目幾乎無限②共顯性③可以利用現(xiàn)有探針，具有種族特異性④RFLP標(biāo)記遍及全基因組⑥重復(fù)性好現(xiàn)在是10頁\一共有90頁\編輯于星期一缺點成本較高;需要許多克隆探針；一個探針只能產(chǎn)生一個多態(tài)位點；所需DNA量大(5～15μg)；易造成環(huán)境污染現(xiàn)在是11頁\一共有90頁\編輯于星期一隨機排列的寡聚脫氧核苷酸單鏈引物（10個核苷酸）。通過PCR擴增染色體組DNA所獲得的長度不同的多態(tài)性DNA片段。2、RAPD（RandomAmplificationPolymorphismDNA）隨機擴增多態(tài)性DNA1990,Williams現(xiàn)在是12頁\一共有90頁\編輯于星期一特異性取決于引物與模板DNA結(jié)合的特異性。PCR，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）Mullis等(1985)PCR反應(yīng)：變性、復(fù)性、延伸?，F(xiàn)在是13頁\一共有90頁\編輯于星期一RAPD與經(jīng)典的PCR反應(yīng)的區(qū)別①引物②反應(yīng)條件③擴增產(chǎn)物現(xiàn)在是14頁\一共有90頁\編輯于星期一（2）RAPD標(biāo)記的特點優(yōu)點1）可檢測未知序列的基因組DNA2）引物無種族特異性3）RAPD技術(shù)簡單現(xiàn)在是15頁\一共有90頁\編輯于星期一4）單個引物可產(chǎn)生幾個多態(tài)位點現(xiàn)在是16頁\一共有90頁\編輯于星期一5）通過克隆測序可轉(zhuǎn)化成SCARSCAR（SequenceCharacterizedAmplificationRegion）特異序列擴增區(qū)域標(biāo)記現(xiàn)在是17頁\一共有90頁\編輯于星期一缺點1）再現(xiàn)性差2）顯性遺傳3）存在共遷移問題現(xiàn)在是18頁\一共有90頁\編輯于星期一3、AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphisms）擴增片段長度多態(tài)性1993，Zabeaumarc和Vospieter是對限制性酶切片段的選擇性擴增現(xiàn)在是19頁\一共有90頁\編輯于星期一（1）AFLP標(biāo)記的原理基因組的DNA進(jìn)行雙酶切人工接頭連接PCR反應(yīng)的引物凝膠電泳現(xiàn)在是20頁\一共有90頁\編輯于星期一AFLP擴增數(shù)量由酶切頻率較低的限制酶在基因組中的酶切位點數(shù)量決定。限制性酶酶切頻率較高的限制性酶（frequentcutter），酶切頻率較低的限制性酶（rarecutter）產(chǎn)生易于擴增基因組DNA限制擴增模板DNA片段的數(shù)量現(xiàn)在是21頁\一共有90頁\編輯于星期一3）選擇擴增AFLP分析的基本步驟1）限制性核酸酶雙酶切基因組DNA2）DNA片段兩端連接上特定的接頭(oligonucleotideadapters)現(xiàn)在是22頁\一共有90頁\編輯于星期一6）自顯影4）聚丙烯酰胺凝膠電泳5）凝膠轉(zhuǎn)移，干膠處理熒光標(biāo)記、銀染現(xiàn)在是23頁\一共有90頁\編輯于星期一（2）AFLP標(biāo)記的特點優(yōu)點

1）數(shù)目和種類很多

2）一次PCR反應(yīng)可檢測多個遺傳位點3）AFLP分析模板用量少4）分辨率高5）假陽性低，可靠性高6）AFLP標(biāo)記多數(shù)為顯性現(xiàn)在是24頁\一共有90頁\編輯于星期一缺點分析成本高DNA的純度及內(nèi)切酶質(zhì)量要求也比較高甲基化敏感酶易產(chǎn)生假假陽性現(xiàn)在是25頁\一共有90頁\編輯于星期一(Variablenumbertandemrepeat)4、SSR（SimpleSequenceRepeat）1987，Nakamura生物基因組內(nèi)有一種短的重復(fù)次數(shù)不同的核心序列可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列簡稱VNTR小衛(wèi)星（minisatellites）微衛(wèi)星（microsatellites）現(xiàn)在是26頁\一共有90頁\編輯于星期一簡單重復(fù)序列，又稱微衛(wèi)星DNA一類由1—6個堿基組成的基序（motif）串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列如（CA）n、（AT）n、（CC）n、（GATA）nn代表重復(fù)次數(shù)，其大小在10～60之間現(xiàn)在是27頁\一共有90頁\編輯于星期一微衛(wèi)星DNA兩端的序列是相對保守的單拷貝序列（1）SSR標(biāo)記的原理根據(jù)微衛(wèi)星DNA兩端的單拷貝序列設(shè)計一對特異引物，利用PCR技術(shù)，擴增每個位點的微衛(wèi)星DNA序列，通過電泳分析核心序列的長度多態(tài)性。現(xiàn)在是28頁\一共有90頁\編輯于星期一2）檢測一個單一的多等位基因位點。（2）SSR標(biāo)記的特點1）數(shù)量幾乎無限，檢測出多態(tài)性的頻率極高3）多數(shù)為共顯性標(biāo)記現(xiàn)在是29頁\一共有90頁\編輯于星期一使用SSR技術(shù)的前提是需要知道重復(fù)序列兩翼的DNA序列。4）重復(fù)性高，穩(wěn)定可靠5）需DNA樣品量少，對DNA質(zhì)量要求亦不苛刻現(xiàn)在是30頁\一共有90頁\編輯于星期一引物設(shè)計采用2－4個核苷酸序列為基序（motifs），以其不同重復(fù)次數(shù)再加上幾個非重復(fù)的錨定堿基Inter-simplesequencerepeatpolymorphicDNAISSR標(biāo)記相鄰SSR區(qū)域內(nèi)的引物去擴增中間的單拷貝序列現(xiàn)在是31頁\一共有90頁\編輯于星期一共顯性遺傳5、SCAR（SequenceCharacterizedAmplificationRegion）特異序列擴增區(qū)域標(biāo)記一般步驟RAPD分析克隆片段兩端測序設(shè)計長為18～24bp的引物PCR擴增檢測高的重復(fù)性優(yōu)點現(xiàn)在是32頁\一共有90頁\編輯于星期一6、CAPS（CleavedAmplificationPolymorphismSequence-taggedSite）切割擴增多態(tài)序列標(biāo)簽位點技術(shù)又稱PCR-RFLP基本步驟特定引物PCR擴增PCR擴增產(chǎn)物限制性內(nèi)切酶酶切酶切產(chǎn)物凝膠電泳檢測現(xiàn)在是33頁\一共有90頁\編輯于星期一CAPs標(biāo)記的優(yōu)點①引物與限制酶組合非常多②

CAPS標(biāo)記呈共顯性③所需DNA量極少④結(jié)果穩(wěn)定可靠⑤操作簡便、快捷現(xiàn)在是34頁\一共有90頁\編輯于星期一指基因組中長度為200—500bp，且核苷酸順序已知的單拷貝序列，可采用PCR技術(shù)將其專一擴增出來。7、STS（Sequence-taggedSites）序列標(biāo)簽位點簡稱序標(biāo)位YAC或cosmid插入末端序列引物來源RFLP單拷貝的探針序列微衛(wèi)星序列表達(dá)基因序列現(xiàn)在是35頁\一共有90頁\編輯于星期一很容易在不同組合的遺傳圖譜間進(jìn)行標(biāo)記的轉(zhuǎn)移，且是溝通植物遺傳圖譜和物理圖譜的中介。

8、表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressedsequencetags，ESTs）表達(dá)基因的部分序列共顯性遺傳突出優(yōu)點現(xiàn)在是36頁\一共有90頁\編輯于星期一擴增基因開發(fā)閱讀框（openreadingframes,ORFs）。引物17-18個堿基，包括13-14個堿基的核心區(qū)域（5’的10-11個堿基為填充區(qū)，隨后正向為CCGG，反向為AATT），核心區(qū)域后為3個選擇堿基。9、SRAP（Sequence-relatedamplifiedpolymorphism）相關(guān)序列擴增多態(tài)性現(xiàn)在是37頁\一共有90頁\編輯于星期一現(xiàn)在是38頁\一共有90頁\編輯于星期一SRAP的特點優(yōu)點1）每一反應(yīng)可得大量多態(tài)位點2）不需克隆任何序列，引物可用于不同生物；3）便利、簡單；4）重復(fù)性好；5）PCR產(chǎn)物可直接測序。現(xiàn)在是39頁\一共有90頁\編輯于星期一基因組中每隔1000個堿基就存在一單堿基差異。一般通過對PCR產(chǎn)物、基因組文庫、表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）文庫測序而獲得10、SNP（simplenucleotidepolymorphisms）單核苷酸多態(tài)性等位基因遺傳密碼的單堿基差異。特點：數(shù)量大現(xiàn)在是40頁\一共有90頁\編輯于星期一AChromosomeMapofTomato第三節(jié)重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選一、遺傳圖譜的構(gòu)建現(xiàn)在是41頁\一共有90頁\編輯于星期一1、作圖群體的建立（1）親本的選配親本選擇的原則親本間的DNA多態(tài)性豐富；親本純度高；雜交后代可育?，F(xiàn)在是42頁\一共有90頁\編輯于星期一（2）群體的類型×F1P1P2F2F2群體現(xiàn)在是43頁\一共有90頁\編輯于星期一BC1群體現(xiàn)在是44頁\一共有90頁\編輯于星期一RIL群體是雜交后代經(jīng)過多代自交而產(chǎn)生的一種作圖群體，通常從F2代開始，采用單粒的方法建立。常自交6-7代。重組近交系群體（recombinantinbredlines，RIL

）現(xiàn)在是45頁\一共有90頁\編輯于星期一DH群體單倍體經(jīng)過染色體加倍形成的二倍體現(xiàn)在是46頁\一共有90頁\編輯于星期一一組遺傳背景相同或相近，只在個別區(qū)段存在差異的株系近等基因系群體（Near-isogeneiclinesNIL）現(xiàn)在是47頁\一共有90頁\編輯于星期一擬測交（Pseudo-testcross）群體復(fù)合雜交群體（CP群體）現(xiàn)在是48頁\一共有90頁\編輯于星期一（3）群體的大小構(gòu)建分子標(biāo)記骨架連鎖圖可用小群體150單株或家系。現(xiàn)在是49頁\一共有90頁\編輯于星期一連鎖圖譜構(gòu)建的理論是染色體的交換和重組。AABB×abababABABabABba重組率可用來表示遺傳圖距，重組型配子的最大比例為50%，變化0-50%。圖距單位用厘摩（centi-Mergan,cM）表示，1cM的大小大致符合1%的重組率。2、圖譜構(gòu)建的理論基礎(chǔ)現(xiàn)在是50頁\一共有90頁\編輯于星期一兩位點存在連鎖(r＜0.5)的概率與不連鎖的概率(r=0.5)比

為確定兩位點之間存在連鎖，一般要求似然比大于1000，即LOD＞3；而否定連鎖的存在，則要求似然比小于100，即LOD＜2。圖譜制作的統(tǒng)計學(xué)原理①兩點測驗L(r)/L(0.5)概率之比可用似然比統(tǒng)計量來表示似然函數(shù)L()②多點測驗現(xiàn)在是51頁\一共有90頁\編輯于星期一檢測作圖群體的個體（株系）的分子標(biāo)記基因型P1P2F112345678910111213141516171819202122BHAAHHAHBAAHHHABHABAHH123456789101112??????3、標(biāo)記基因型檢測現(xiàn)在是52頁\一共有90頁\編輯于星期一4、圖譜構(gòu)建軟件利用DNA標(biāo)記數(shù)據(jù)，通過作圖軟件構(gòu)建連鎖圖譜。MAPMKER/EXE3.0MapmangerQTX20Joinmap現(xiàn)在是53頁\一共有90頁\編輯于星期一陸地棉（渝棉1號×T586）F2:7群體現(xiàn)在是54頁\一共有90頁\編輯于星期一1、質(zhì)量性狀的基因定位二、基因定位現(xiàn)在是55頁\一共有90頁\編輯于星期一（1）近等基因系分析現(xiàn)在是56頁\一共有90頁\編輯于星期一（2）分離群體分組混合分析

現(xiàn)在是57頁\一共有90頁\編輯于星期一

1

11170

12135

131480

14215

15710

CMS育性恢復(fù)基因的分子標(biāo)記現(xiàn)在是58頁\一共有90頁\編輯于星期一控制數(shù)量性狀的基因2、數(shù)量性狀的基因定位數(shù)量性狀的基因座（quantitativetraitloci,QTL）現(xiàn)在是59頁\一共有90頁\編輯于星期一檢驗同一標(biāo)記不同基因型間數(shù)量性狀均值的差異（1）QTL定位方法1）基于標(biāo)記的分析方法均值差檢測法若差異顯著，則表明標(biāo)記與QTL連鎖?，F(xiàn)在是60頁\一共有90頁\編輯于星期一陸地棉（渝棉1號×T586）F2:7群體QTL定位現(xiàn)在是61頁\一共有90頁\編輯于星期一2）基于性狀的分析方法分離群體分群分析法現(xiàn)在是62頁\一共有90頁\編輯于星期一選擇性基因型分析法現(xiàn)在是63頁\一共有90頁\編輯于星期一

3、QTL定位軟件Mapmaker/QTL1.0MapManagerQTXQTLCartographerMapQTLWindowsCartographer現(xiàn)在是64頁\一共有90頁\編輯于星期一4、QTL精細(xì)定位1）單個QTL的精細(xì)定位連續(xù)用渝棉1號回交分子標(biāo)記輔助選擇渝棉1號T586T586渝棉1號群體大于1000現(xiàn)在是65頁\一共有90頁\編輯于星期一可靠性取決于標(biāo)記與目標(biāo)基因的連鎖程度。若只用一個標(biāo)記對目標(biāo)基因進(jìn)行選擇，則標(biāo)記與目標(biāo)基因間的連鎖必須非常緊密，才能夠達(dá)到較高的正確率。第四節(jié)分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）育種一、分子標(biāo)記輔助選擇的遺傳基礎(chǔ)1、前景選擇對目標(biāo)基因的選擇稱為前景選擇(foregroundselection)Hospital&Charcosset(1997)提出現(xiàn)在是66頁\一共有90頁\編輯于星期一供體受體RRRrrr(1-r)22r(1-r)r2MRmrMRmr目標(biāo)基因與DNA標(biāo)記間的遺傳距離位p親本中DNA標(biāo)記的帶型F1雜種中DNA標(biāo)記的帶型在F2分離群體中分子標(biāo)記類型即MM,Mm,mmMM類型的分子標(biāo)記所代表的目標(biāo)基因型及其頻率利用MAS的遺傳基礎(chǔ)（以RFLP為例）M—抗性標(biāo)記R—抗性基因m—感病標(biāo)記r—感病基因現(xiàn)在是67頁\一共有90頁\編輯于星期一

選擇的正確率隨重組率的增加而迅速下降。重組值越小，其錯選率越低。如果要求至少選到一株目標(biāo)基因型的概率為P，則必須選擇具有標(biāo)記基因型MM的植株至少為：n＝log（1-P）/log（1-p）式中p＝（1－r）2現(xiàn)在是68頁\一共有90頁\編輯于星期一現(xiàn)在是69頁\一共有90頁\編輯于星期一對基因組中其他部分（即遺傳背景）選擇，稱為背景選擇（backgroundselections）。背景選擇的對象幾乎包括了整個基因組，因此，這里牽涉到一個全基因組選擇的問題，在分離群體中，由于在上一代形成配子時同源染色體之間會發(fā)生交換，因此每條染色體都可能是由雙親染色體重新組裝的雜合體。2、背景選擇現(xiàn)在是70頁\一共有90頁\編輯于星期一現(xiàn)在是71頁\一共有90頁\編輯于星期一二、分子標(biāo)記輔助選擇的優(yōu)越性1.克服性狀表現(xiàn)型鑒定的困難2.允許早期選擇3.控制單一性狀的多個（等位）基因的利用4.允許同時選擇多個性狀5.可進(jìn)行性狀非破壞性評價和選擇6.從育種進(jìn)程考慮，可加快育種進(jìn)程，提高育種效率現(xiàn)在是72頁\一共有90頁\編輯于星期一三.分子標(biāo)記輔助選擇應(yīng)具備的主要條件

A：與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記B:簡便快捷的標(biāo)記檢測方法現(xiàn)在是73頁\一共有90頁\編輯于星期一Howtouseageneticmarkerformarker-assistedselectionWeaverCarrierSire+WW+++M1M2M1M2M3M3W=Weaver+=Normal現(xiàn)在是74頁\一共有90頁\編輯于星期一目標(biāo)基因的標(biāo)記篩選（genetagging）是進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）育種的基礎(chǔ)。用于MAS育種的分子標(biāo)記須具備三個條件：分子標(biāo)記與目標(biāo)基因緊密連鎖標(biāo)記實用性強，重復(fù)性好，而且能夠經(jīng)濟簡便地檢測大量個體。不同遺傳背景選擇有效?，F(xiàn)在是75頁\一共有90頁\編輯于星期一作物MAS育種須具備的條件

分子標(biāo)記與目標(biāo)基因共分離或緊密連鎖，一般要求兩者間的遺傳距離小于5cM,最好1cM或更小。具有在大群體中利用分子標(biāo)記進(jìn)行篩選的有效手段，主要是應(yīng)用PCR技術(shù)。篩選技術(shù)在不同實驗室間重復(fù)性好，且具有經(jīng)濟、易操作的特點。具有實用化程度高并能協(xié)助育種家作出抉擇的計算機數(shù)據(jù)處理軟件?，F(xiàn)在是76頁\一共有90頁\編輯于星期一四、MAS育種方法（一）回交育種（二）SLS-MAS（三）MAS聚合育種現(xiàn)在是77頁\一共有90頁\編輯于星期一受體親本×供體親本(不含優(yōu)質(zhì)基因)(含優(yōu)質(zhì)基因)F1×受體親本BC1目標(biāo)基因定位標(biāo)記輔助選擇中選BC1×受體親本(含優(yōu)質(zhì)基因)BC2BC3標(biāo)記輔助選擇標(biāo)記輔助選擇中選BC3(含優(yōu)質(zhì)基因)新育成的優(yōu)質(zhì)品種(受體親本遺傳本背景+優(yōu)質(zhì)基因)自交目標(biāo)基因的定位與標(biāo)記輔助回交育種相結(jié)合程序圖中選BC1×受體親本(含優(yōu)質(zhì)基因)現(xiàn)在是78頁\一共有90頁\編輯于星期一

受體親本×供體親本A(無優(yōu)質(zhì)基因)(含優(yōu)質(zhì)基因A)

受體親本×供體親本B(無優(yōu)質(zhì)基因)(含優(yōu)質(zhì)基因B)F1(含優(yōu)質(zhì)基因A)×F1(含優(yōu)質(zhì)基因B)復(fù)雜雜種(分離群體)

受體親本×供體親本C(無優(yōu)質(zhì)基因)(含優(yōu)質(zhì)基因C)

中選雜種個體×F1(含優(yōu)質(zhì)基因A和B)(含優(yōu)質(zhì)基因C)復(fù)雜雜種(分離群體)

中選雜種個體×受體親本(含優(yōu)質(zhì)基因A、B和C)

新育成的優(yōu)質(zhì)品種(受體親本遺傳背景+優(yōu)質(zhì)基因A、B和C)回交1~2代，標(biāo)記輔助選擇自交標(biāo)記輔助選擇標(biāo)記輔助選擇標(biāo)記輔助基因聚合與品質(zhì)改良相結(jié)合程序圖現(xiàn)在是79頁\一共有90頁\編輯于星期一五、提高分子標(biāo)記的篩選效率（一）多重PCR方法（二）用相斥相分子標(biāo)記進(jìn)行育種選擇（三）克服連鎖累贅（四）降低MAS育種的成本現(xiàn)在是80頁\一共有90頁\編輯于星期一

MAS育種研究范圍：1.分子標(biāo)記與資源評價（度量遺傳多樣性）2.分子標(biāo)記與親本選配3.MAS增強作物抗病性（轉(zhuǎn)移新的抗性基因，抗性基因的累加或聚合）4.MAS提高作物雜種產(chǎn)量

現(xiàn)在是81頁\一共有90頁\編輯于星期一

品質(zhì)性狀分子標(biāo)記