核酸檢測技術及其在國內(nèi)外血液篩檢中的應用

核酸檢測技術及其在國內(nèi)外血液篩檢中的應用輸血相關傳染病的預防和控制已經(jīng)成為全社會關注的焦點,新技術的引進是進一步提高血液安全性的重要一環(huán)。本文就病原體核酸檢測技術(nucleicacidtesting,NAT)及其在國內(nèi)外血液篩檢中的應用情況和結(jié)果作一介紹,并對該方法在我國推廣和應用的必要性和可行性作初步探討。NAT酶免檢測(EIA)技術已經(jīng)廣泛運用于血液篩檢,該方法的靈敏度和特異性也HBV、HCVHIV1∶66000、1∶103000silentinfection)以及人工操作錯誤[2]是指從感染病原開始,直至用某種檢測方法能夠檢測到該病原存在為止的這一段時間[3]HBsAg、抗-HIV、抗45-56ｄ22ｄ72ｄ[4,5]90%HIVHBV75HCV[6]原或抗體血清學檢測不能有效地保障血液安全。NATNATNATHBVHCVHIV感染的平均“窗口期”縮短9d(縮短“窗口期”20%)、59d(82%)和11d(50%[5,]NAT3NAT1504HCVRNA1[8]NAT性疾病[9]。因此,NAT的引入可使輸血傳播疾病的危險性降到最低[10]。NAT1985(polymerasechainreaction,PCR)NATPCRNAT這些技術靈敏度和特異性或高或低,操作或簡單或復雜,適合在各PCRTMAPCRPCRDNAPCRRNAPCR(RTPCR)PCR(nestedPCR)PCRPCRPCR(PCRELISA)、PCR酸探針雜交技術(PCRSSOP)PCRPCR目前在臨床檢測中使用較多的是熒光定量PCR,PCR雖然國內(nèi)許多生物技術企業(yè)已經(jīng)利用熒光PCRNAT2止正式通過美國FDA2RocheCOBASScreenHBV/HCV/HIVHIV1/HCV,FDA50copies/ml>95%PCR20copies/ml95%檢出低病毒載量標本的要求。相信不斷提高檢測靈敏度,早日研發(fā)并注冊成功我國自己的NAT血液篩檢用試劑也是國內(nèi)生物技術企業(yè)的發(fā)展目標。轉(zhuǎn)錄介導的擴增方法包括轉(zhuǎn)錄介導的擴增系統(tǒng)(transcriptionmediatedamplification,TMA)和核酸序列依賴擴增系統(tǒng)(nucleicacidｓsequencebased amplification,NASBA)。TMA是一種利用Money鼠白血病病毒（MMLV）逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA多聚酶2種酶的共同作用,在等溫條件下來擴增RNA或DNA的反應系統(tǒng),主要擴增原理為:目標序列在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下,以引物為引導進行逆轉(zhuǎn)錄,逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H活性將雜合鏈上的RNA降解以后,合成雙鏈的DNA,并在T7RNA多聚酶作用下,轉(zhuǎn)錄出成千上萬個目標RNA序列,這些RNA又可以作為模板進行下一個循環(huán),整反應是一個自催化過程。NASBA的原理與TMA相似,只是在核酸提取和擴增產(chǎn)物檢測的方法上有所不同。這兩種方法的特異性強,靈敏度高,反應條件簡單,擴增效率高,無需專門的擴增儀器,且因整個反應在1個試管中進行,也減少了污染。NATDNA(branchedDNAsignalamplificationassay,bDNA)環(huán)介導的等溫擴增技術(loopmediatedisothermalamplification,LAMP)、連接酶鏈技術(ligasechainreaction,(stranddisplacementamplification,SDA)等。這些技術或因為自身原因,或因為剛研發(fā)出來尚未進入bDNA1995DNAbDNAPCR,故該項技術實際上不適合用于血液篩檢,bDNAHBVHCVNAT在國內(nèi)外血液篩檢中的應用NATNAT在國外特別是一些發(fā)達國家和地區(qū)已普遍應用于血液篩檢[1例如,日本是世界HBV、HCV、HIVNAT[1]新加坡、中NAT1997起就開始NAT2000NAT19993FDANAT1：國家或地區(qū)技術混合檢測／單檢?Germany德國(1997年起部分,?PCR?國家或地區(qū)技術混合檢測／單檢?Germany德國(1997年起部分,?PCR?Pool1999年４月起，全部）?Netherlands荷蘭(1997年起）?PCR?Pool?U.K.英國(2000年起）?PCR?Pool?Switzerland?PCR?Pool?Japan日本(1997年１月起對原料?PCR?Pool漿；1999年初起獻血者）?PCR?pool?Canada?TMA/PCR?pool/IDT?韓國（20051）?USA美國(19993）?TMA?IDTNewZealandTMApool/IDTAustraliaTMAIDTSingaporeTMAIDTPortugalTMA/PCRPool/IDTFrance(2000）TMA/PCRPoolSpainTMA/PCRPoolItalyTMApoolHongKongTMA/PCRPool?臺灣（2005年準備中）?TMA/PCR?Pool各國采用的技術各不相同（參見表1。日本使用的方法為羅氏公司與日本AmpliNATＴＭNPX（PCRHBV,HCVHIVChironTMAARCChironTMA(ABC)羅氏COBASAmpliScreen;荷蘭及部分歐洲國家將荷蘭阿克蘇公司推出的NucliesensCOBASAmpliScreen2000QiagenCOBASAmpliScreenChironTMA進行評估,目的是尋求一種最適合的NAT技術,既保障血液安全,又能保證血液的及時供給,還要做到省時省力。NATNAT的血液安全水平已經(jīng)大幅度提高,但是由于EIA“窗口期”所致的漏檢概率仍然2。1/34.8萬；HIV-11/34.8萬；HIV-1NAT+6160121751/266.9國家試劑檢測方式血清學陰性、NAT單獨陽性檢出情況文獻美國ChironProcleixChiron: 16人1999.03-2002.03:文獻14TMAHIV-1/HCVassay;Roche Cobas份，TMA,化學發(fā)光檢測；Roche：24人份HCVNAT+：170/39,721,404，即1/23萬；HIV-1NAT+：12/37,164,054，即AmpliScreenHIV-1 and HCV混 合 ，PCR-ELISA1/310萬tests日本 Multiplex1999年7月11999.7–2000.4：文 獻HBV/HCV/HIV-1日-2000年1月HBVNAT+15,16reagent(Roche31日，500人：26／2560977，即1/9.8萬；與日本共同研制)份；HCVNAT+2002年2月1：9／2560977,即1/28.4萬；日起，50人份HIV-1NAT+：0／256.1萬?；鞓?2000.2.1–2002.12.31：合格血液檢測HBVNAT+308160121751/5.2萬；HCVNAT+：46／16012175,即澳大利亞ChironProcleixTMA HIV-1/HCVassay;個點單人份，個點16人份TMA, 化學發(fā)2000.06.07-2004.11.14：HCVNAT+-：9/4,489,550，即1/49.9萬；17及個交 光檢測；HIV-1 NAT+1/4,489,5504（1/449.0萬4,489,55018）中歐HCVPCR:RocheCobasAmplicon;96人份混合HCVNAT+：6/360萬，1/60萬；HIVNAT+：2/360萬，1/180萬19HIVPCR:自己研制的PCR法國ChironProcleix單檢，或8人2001.07-2003.12：20TMAHIV-1/HCV；份，或16人份,HCVNAT+：3/6141/205或RocheCobas不考慮血清學HIVNAT+：2/614萬，即1/307萬Nuclisens核酸提取儀新加坡ChironProcleixTMA assay;單人份檢測2000.10-2004.10:HCVNAT+：4／304,715,即萬；1/7.6個人交流（21）HIV-10/30.5萬韓國ChironProcleix16人份2004.06.14-2004.12.03，前期評個人交TMAassay;HIV-1/HCV估：單采獻漿者24599，獻血者15597:流（22）HCVNAT+：1/40196；HIVNAT陽性：1/40196；2005.01.01起，常規(guī)檢測南非ChironProcleix單人份1999年:文獻23TMAHIV-1/HCVHIVNAT+:2/19709,即1/1.0萬；assay;HCVNAT＋:0/19709AmpliscreenHIV-1andHCVAmpliscreenHIV-1andHCV合the我國核酸篩查技術應用NATPCR的問題很難控制。有關我國獻血者及原料漿中NAT檢測工作的情況總結(jié)于表4。表3國內(nèi)血液中心開展NAT檢測研究的情況單位深圳保安區(qū)中心血站廈門血液

試劑美 國BiotronicsTechHBV,HCVAmpliSensor試劑盒自行設計引

檢測方式2015000rpm離心濃縮，半自動熒光定量PCR50人份混合，

NAT陽性HCVNAT+:1/8805(ALT390U/L)；HBVNAT+:抗-HBc陽性中：5/495(1％)HCVNAT+:2/10000,即

文獻25中心物，HCVNucliSensExtractorNASBA技ECL檢測1／5000江蘇省血液中心華美HCV試劑盒RNA單人份，PCR,電泳HCVNAT+:／3752/750，即126上海血液美國Chiron8人份或24人份混HCVNAT+:0／103539;文獻7中心ProcleixHIV-1/HCV光檢測HIVNAT+:0／103539;北京血液匹 基24人份混合，26000gHCVNAT+:0/34373;27中心HCV/HIV-1熒光PCR核酸檢測試劑Roche提取柱，熒光PCRHIVNAT+:0/34373多單位參加的國際合作深圳血液中心沈陽血液中心

美國ChironProcleixHIV/HCVRocheAmpliscreenHBV/HCV/HIV匹基HCV光PCR測試劑

16EDTA自動混樣；TMA化學發(fā)光檢測24人份混合，STAR2000自動混樣;RocheMPLC自動提取核酸；RocheAmplicor擴增和檢測24Roche提取柱，熒光PCR

HCVNAT+：2/80259(其中1個ALT254IU/ml)HIVNAT+：0/80259HCVNAT+:0/16512;HIVNAT+:0/16512;HBVNAT+:8/16512,即1/2064HCVNAT+:0/8.3萬

文獻2829人交流(深圳血液中心,王20056中ft廈門長城，無單人份，PCR,電泳HCVNAT+:30血站及蕪錫三星，上海77/28098(1/365)湖中心血正業(yè)HCVPCR站表4 國內(nèi)原料漿開展NAT檢測研究情況單位試劑檢測方式NAT陽性文獻中國藥品匹基HCV/HIV-12426000gHCVNAT+:0/19196;文獻31生物制品檢定所熒光PCR核酸檢測試劑離心濃縮，Roche酸提取柱，熒光PCRHIVNAT+:0/19196上海萊士血制品有限公司匹 基HBV/HCV/HIV-1熒光PCR核酸檢測試劑48離心濃縮，Roche酸提取柱，熒光PCRHBVNAT+:1/1401718(1/140萬);HCVNAT+:31/1401718(1/4.5萬);文獻32HIVNAT+:3/1250007(1/41.7萬)中國藥品生物制品檢定所

ChironProcleixHCV/HIV-1Assay

16人份混合技HCVNAT+:1/10032; 個人交（術；化學發(fā)光檢測 HIVNAT+:0/10032 定所白堅2005年1月）我國核酸篩查技術應用工作小結(jié)：NATNATHCV NAT+檢出率結(jié)果差異很大，從1/365（國產(chǎn)試劑,電泳）～1/4.0萬～0/10.4HIVNAT+0/10.4NAT+為～1/2088NATHCVNAT+:1/1.0～1/4.5HIVNAT+：1/41.7；HBVNAT+：1/140（48。必須重視核酸檢測的質(zhì)量控制體系：注重避免交叉污染：檢測方法：傳統(tǒng)的電泳檢測為開放式，不適合；嚴格的核酸檢測實驗室設置和管理。注重試劑質(zhì)量：為適應血液混樣檢測對靈敏度的要求，一些國產(chǎn)血篩試劑在臨床診斷試劑的基礎上已做樣品處理的改良，靈敏度（如匹基）在考察期間不錯。但仍有待完善，表現(xiàn)在：NAT波動?。粐a(chǎn)試劑批間差異