細(xì)胞工程整理

細(xì)胞工程整理第1頁/共76頁1、概念:應(yīng)用的原理和方法研究的水平研究的目的細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)細(xì)胞整體水平或細(xì)胞器水平按照人們的意愿來改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲得細(xì)胞產(chǎn)品2、分類植物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程

指應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的原理和方法，通過細(xì)胞水平或細(xì)胞器水平上的操作，按照人們的意愿來改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲得細(xì)胞產(chǎn)品的一門綜合科學(xué)技術(shù)。第2頁/共76頁考點(diǎn)一植物細(xì)胞工程第3頁/共76頁所采用技術(shù)的理論基礎(chǔ)

植物細(xì)胞工程通常采用的技術(shù)手段

植物組織培養(yǎng)

植物體細(xì)胞雜交植物細(xì)胞的全能性一、植物細(xì)胞工程

第4頁/共76頁(離體的植物

器官、組織或細(xì)胞)脫分化避光再分化光照愈傷組織根、芽（胚狀體）植物體

培養(yǎng)條件：離體、含有全部營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基、激素、一定的溫度、空氣、無菌環(huán)境、適合的PH、適合的光照等外植體舉例：花藥離體培養(yǎng)；基因工程培育的抗棉鈴蟲的棉花植株；細(xì)胞工程中培育的“番茄-馬鈴薯”雜種植株等。(一)、植物組織培養(yǎng)

第5頁/共76頁實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用順序簡(jiǎn)記為：先“生”分裂不分化，后“生”分裂又分化，同“使”分化頻率高分化頻率提高同時(shí)使用細(xì)胞既分裂也分化先使用細(xì)胞分裂素，后使用生長(zhǎng)素有利于細(xì)胞分裂，但細(xì)胞不分化先使用生長(zhǎng)素，后使用細(xì)胞分裂素第6頁/共76頁簡(jiǎn)記為：“高”根，“低”芽，“中”愈傷促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)適中有利于芽的分化、抑制根的形成低有利于根的分化、抑制芽的形成高植物細(xì)胞的發(fā)育方向生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素第7頁/共76頁第8頁/共76頁去壁去壁纖維素酶果膠酶原生質(zhì)體植物細(xì)胞融合的原生質(zhì)體離心、振動(dòng)、電刺激聚乙二醇再生細(xì)胞壁雜種細(xì)胞脫分化愈傷組織雜種植株激素篩選激素再分化（二）、植物體細(xì)胞雜交過程示意圖植物體細(xì)胞雜交原理：細(xì)胞膜流動(dòng)性植物組織培養(yǎng)原理：植物細(xì)胞全能性AB第9頁/共76頁你認(rèn)為兩個(gè)來自不同植物的體細(xì)胞完成融合，遇到的第一個(gè)障礙是什么？(1)分離原生質(zhì)體---酶解法(2)原生質(zhì)體融合---物、化法(3)新細(xì)胞壁形成---雜交細(xì)胞形成標(biāo)志(4)植物組織培養(yǎng)---植物體細(xì)胞雜交的技術(shù)環(huán)節(jié)之一意義：克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙、培育新品種第10頁/共76頁第11頁/共76頁（三）、植物組織培養(yǎng)技術(shù)有哪些應(yīng)用？⑴.植物繁殖的新途徑①微型繁殖：

不僅可以保持優(yōu)良品種的遺傳特性,還可以高效快速地實(shí)現(xiàn)種苗的大量繁殖。②作物脫毒：利用植物分生組織(如莖尖、根尖)進(jìn)行培養(yǎng),可以使新長(zhǎng)成的植株脫除病毒。第12頁/共76頁注意

人工種皮中可以加入適量的養(yǎng)分、無機(jī)鹽、有機(jī)碳源以及農(nóng)藥、抗生素、有益菌等,以利于胚狀體生長(zhǎng)發(fā)育成幼苗。③人工種子：

植物組織培養(yǎng)得到的胚狀體、不定芽、頂芽或腋芽,包上人工種皮就可以形成人工種子。右圖是人工種子的結(jié)構(gòu)示意圖。第13頁/共76頁人工種子自然種子胚狀體人工種皮人工胚乳胚種皮胚乳第14頁/共76頁胚狀體包埋在膠囊內(nèi)形成球狀結(jié)構(gòu)：膠質(zhì)化合物薄膜——種皮營(yíng)養(yǎng)成分和植物激素

——人工胚乳胚狀體——新植物的幼體優(yōu)點(diǎn)：

快速繁殖，解決作物繁殖能力差、結(jié)子困難或發(fā)芽率低等問題。保持雜種優(yōu)勢(shì)。第15頁/共76頁②突變體的利用：

在植物組織培養(yǎng)過程中,由于培養(yǎng)細(xì)胞一直處于不斷的分生狀態(tài),因此容易受到培養(yǎng)條件和外界壓力(如射線、化學(xué)物質(zhì)等)的影響而發(fā)生突變。

從這些產(chǎn)生突變的個(gè)體中可以篩選出對(duì)人們有用的突變體,進(jìn)而培育成新品種。③細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)：

可以利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)大量生產(chǎn)某些細(xì)胞產(chǎn)物,如蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、藥物、香料、生物堿等。第16頁/共76頁

④培育轉(zhuǎn)基因植物

（如抗蟲棉等）(2)作物新品種的培育①單倍體育種：

花藥離體培養(yǎng)過程就是植物組織培養(yǎng)過程。

單倍體育種的優(yōu)點(diǎn)是后代不發(fā)生性狀分離,都是純合子，能夠穩(wěn)定遺傳,明顯縮短了育種年限。第17頁/共76頁第18頁/共76頁6.下圖為植物體細(xì)胞雜交過程示意圖，據(jù)圖回答：

⑴步驟①是去掉

，最常用的方法是用

酶去除，使植物細(xì)胞成為

。⑵步驟②一般常用的化學(xué)試劑是

，目的是

。⑶在利用雜種細(xì)胞培育成為雜種植株的過程中，運(yùn)用的技術(shù)手段是

，其中步驟④相當(dāng)于

，步驟⑤相當(dāng)于

。細(xì)胞壁纖維素酶和果膠酶

原生質(zhì)體

聚乙二醇誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合

植物組織培養(yǎng)

脫分化

再分化第19頁/共76頁⑷植物體細(xì)胞雜交的目的是獲得新的雜種植株，使兩株植物的性狀能夠在新的植物體上有所表現(xiàn)，其根本原因是

。⑸從理論上講，雜種植株的育性為

。若運(yùn)用傳統(tǒng)有性雜交方法能否實(shí)現(xiàn)？

因此，這項(xiàng)研究對(duì)于培養(yǎng)作物新品種方面的重大意義在于

。⑹利用植物體細(xì)胞雜交的方法培育作物新品種的過程中，遺傳物質(zhì)的傳遞是否遵循孟德爾的遺傳規(guī)律？為什么？雜種細(xì)胞具有兩個(gè)親本的遺傳物質(zhì)

可育

不能克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙

不遵循，植物體細(xì)胞雜交屬于無性生殖。第20頁/共76頁(1)③過程是

，實(shí)際融合的過程中原生質(zhì)體可能會(huì)形成

種細(xì)胞團(tuán)(只考慮兩個(gè)細(xì)胞融合的情況)。與④過程密切相關(guān)的細(xì)胞器是

。3高爾基體和線粒體課堂練習(xí)原生質(zhì)體融合第21頁/共76頁第22頁/共76頁第23頁/共76頁第24頁/共76頁第25頁/共76頁纖維素果膠原生質(zhì)體愈傷再分化(或分化)植物體細(xì)胞雜交技術(shù)體細(xì)胞中含有三個(gè)或三個(gè)以上染色體組的個(gè)體在減數(shù)分裂過程中，前者染色體聯(lián)會(huì)異常，而后者染色體聯(lián)會(huì)正常胚狀體、不定芽、頂芽、腋芽第26頁/共76頁第27頁/共76頁第28頁/共76頁二、動(dòng)物細(xì)胞工程

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

動(dòng)物細(xì)胞核移植

動(dòng)物細(xì)胞融合

單克隆抗體制備等常用的技術(shù)手段：第29頁/共76頁動(dòng)物組織塊細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個(gè)細(xì)胞幼齡動(dòng)物的器官組織；動(dòng)物胚胎動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程細(xì)胞貼壁接觸抑制原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)加入培養(yǎng)液用胰蛋白酶等處理貼壁細(xì)胞適宜條件不死性細(xì)胞第30頁/共76頁1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理是什么？2.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？3.進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的材料一般有何特點(diǎn)？離體的細(xì)胞在適宜的條件下可以增殖（細(xì)胞增殖）通常含有葡萄糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無機(jī)鹽、微量元素、動(dòng)物血清等。一般取胚胎組織或幼齡動(dòng)物的組織做動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。因?yàn)榕咛ソM織或幼齡動(dòng)物的組織的細(xì)胞生命力旺盛，分裂能力強(qiáng)。第31頁/共76頁4.哪些細(xì)胞會(huì)失去接觸抑制？5.在體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞需要什么物質(zhì)和環(huán)境條件？6.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)有何應(yīng)用價(jià)值？

腫瘤細(xì)胞無菌無毒環(huán)境、充足營(yíng)養(yǎng)（血清或血漿）、適宜溫度、PH、氣體環(huán)境（O2和CO2，C02的主要作用是維持培養(yǎng)液的PH）。①.大規(guī)模生產(chǎn)生物制品，如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等；②.藥性、毒性檢測(cè)；③.培養(yǎng)基因工程中的受體細(xì)胞第32頁/共76頁動(dòng)物組織單個(gè)細(xì)胞細(xì)胞懸液貼壁生長(zhǎng)分瓶培養(yǎng)10代細(xì)胞50代細(xì)胞不死細(xì)胞原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)胰蛋白酶剪碎加培養(yǎng)液接觸抑制少數(shù)癌變動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)流程畸形分化第33頁/共76頁動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)比較項(xiàng)目細(xì)胞增殖和癌變細(xì)胞的脫分化和再分化關(guān)鍵環(huán)節(jié)動(dòng)物胚胎或出生不久的幼齡動(dòng)物的器官或組織植物幼嫩部位或花藥等取材葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素、促生長(zhǎng)因子、動(dòng)物血清等水、礦質(zhì)元素、維生素、蔗糖、氨基酸、瓊脂成分液體培養(yǎng)基固體或半固體培養(yǎng)基類型培養(yǎng)基細(xì)胞增殖植物細(xì)胞全能性理論基礎(chǔ)第34頁/共76頁動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)比較項(xiàng)目①兩技術(shù)手段培養(yǎng)過程中細(xì)胞都進(jìn)行有絲分裂，都是無性繁殖，都可稱克隆，都不涉及減數(shù)分裂②均為無菌操作，需要適宜的溫度、pH等條件相同點(diǎn)①蛋白質(zhì)生物制品的生產(chǎn)②皮膚移植材料的培育③檢測(cè)有毒物質(zhì)④生理、病理、藥理學(xué)研究①植株快速繁殖②脫毒植株的培育③制備人工種子④生產(chǎn)藥物、殺蟲劑等⑤轉(zhuǎn)基因植物的培育應(yīng)用新的細(xì)胞系或細(xì)胞株，不形成個(gè)體，不體現(xiàn)全能性新的組織或植株個(gè)體，可以體現(xiàn)全能性結(jié)果第35頁/共76頁卵細(xì)胞Ａ母綿羊Ｂ母綿羊乳腺細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核細(xì)胞核移植早期胚胎卵裂C母綿羊子宮（代孕母體）胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育過程重組細(xì)胞第36頁/共76頁動(dòng)物細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動(dòng)物動(dòng)物細(xì)胞核移植：是將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞核，移入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，使其重組并發(fā)育成為一個(gè)新的胚胎，這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育為動(dòng)物個(gè)體（克隆動(dòng)物）分類：胚胎細(xì)胞核移植：體細(xì)胞核移植：細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)全能性容易

細(xì)胞分化程度高，恢復(fù)全能性困難第37頁/共76頁體細(xì)胞核移植的過程卵母細(xì)胞去核體細(xì)胞取核電刺激使兩細(xì)胞融合重組細(xì)胞重組胚胎新個(gè)體第38頁/共76頁體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景1、在畜牧業(yè)中可以加速家畜遺傳改良的進(jìn)程2、保護(hù)瀕危物種3、醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)及組織器官的移植第39頁/共76頁細(xì)胞膜的流動(dòng)性滅活病毒、PEG、電激等融合后的細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，形成完整的雜交細(xì)胞誘導(dǎo)的手段？融合后細(xì)胞的類型？AB雜種細(xì)胞遺傳物質(zhì)有什么特點(diǎn)？三種AA、AB、BB含兩種生物的遺傳物質(zhì)1.2動(dòng)物細(xì)胞融合過程原理？第40頁/共76頁1.2動(dòng)物細(xì)胞融合過程為什么滅活的病毒能作誘導(dǎo)劑？滅活喪失感染性保留融合活性第41頁/共76頁比較項(xiàng)目細(xì)胞融合的原理細(xì)胞融合的方法誘導(dǎo)手段用途植物體細(xì)胞雜交細(xì)胞膜的流動(dòng)性纖維素酶、果膠酶去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合離心、電刺激、振動(dòng)、聚乙二醇克服遠(yuǎn)源雜交不親和，獲得雜種植株動(dòng)物細(xì)胞融合細(xì)胞膜的流動(dòng)性用胰蛋白酶使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合除應(yīng)用植物細(xì)胞雜交手段外，還有滅活病毒獲得雜種細(xì)胞、制備單克隆抗體1.4比較動(dòng)、植物細(xì)胞雜交技術(shù)第42頁/共76頁抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法抗原反復(fù)注射動(dòng)物從動(dòng)物的血清中分離抗體該法制備抗體的缺點(diǎn)：產(chǎn)量低、純度低，且抗體的特異性差、靈敏度低。如何解決這個(gè)問題呢？單克隆抗體！第43頁/共76頁讀下面一段資料，找出單克隆抗體的概念

人們發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物發(fā)生免疫反應(yīng)的過程中，體內(nèi)的B細(xì)胞可以產(chǎn)生多達(dá)百萬種以上的特異性抗體，但是每個(gè)B細(xì)胞只分泌一種化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體。要想獲得大量的單一抗體，必須用單個(gè)B細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖，即克隆。2.1單克隆抗體的概念單克隆抗體：?jiǎn)蝹€(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體第44頁/共76頁一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖雜交瘤細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)設(shè)計(jì)方案：動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)單克隆抗體既能產(chǎn)生特異性抗體，又能大量增殖的細(xì)胞1975年英國(guó)科學(xué)家米爾斯坦和柯勒的實(shí)驗(yàn)第45頁/共76頁①為什么給小鼠注射特定的抗原蛋白？②會(huì)有幾種融合方式？③雜交瘤細(xì)胞是如何篩選出來的？有何特點(diǎn)？④是否所有的雜交瘤細(xì)胞都能產(chǎn)生專一性抗體？⑤如何大規(guī)模進(jìn)行培養(yǎng)得到大量的單克隆抗體？第46頁/共76頁BB

、B瘤、瘤瘤（B、瘤）（一選）選擇性培養(yǎng)基：只有雜交瘤細(xì)胞才能存活獲得產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B細(xì)胞（二選）：選能產(chǎn)生所需專一抗體的雜交瘤細(xì)胞√體外培養(yǎng)小鼠腹腔內(nèi)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞特點(diǎn)：既能產(chǎn)生特異性抗體，又能大量增殖。第47頁/共76頁單克隆抗體篩選雜交細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞體外或體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)篩選骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞融合特異性雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞系提取經(jīng)過免疫的B淋巴細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體的制備過程：特點(diǎn)：既能產(chǎn)生專一抗體又能大量繁殖特點(diǎn)：特異性強(qiáng)靈敏度高可大量制備注射抗原免疫第48頁/共76頁第二次篩選第一次篩選項(xiàng)目得到能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞得到雜交瘤細(xì)胞篩選目的用多孔培養(yǎng)皿培養(yǎng)，在每個(gè)孔只有一個(gè)雜交瘤細(xì)胞的情況下開始克隆化培養(yǎng)和抗體檢測(cè)，經(jīng)多次篩選得到能產(chǎn)生特異性抗體的細(xì)胞群用特定的選擇培養(yǎng)基篩選：未融合的細(xì)胞和同種細(xì)胞融合后形成的細(xì)胞(“BB”細(xì)胞、“瘤瘤”細(xì)胞)都會(huì)死亡，只有融合的雜交瘤細(xì)胞(“B瘤”細(xì)胞)才能生長(zhǎng)篩選方法由于小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，所以經(jīng)選擇性培養(yǎng)獲得的雜交瘤細(xì)胞中有能產(chǎn)生其他抗體的細(xì)胞誘導(dǎo)融合后會(huì)得到多種雜交細(xì)胞，另外還有未融合的細(xì)胞篩選原因第49頁/共76頁強(qiáng)調(diào)：

是其他動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)。

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)第50頁/共76頁單抗制備過程分哪幾步？請(qǐng)用箭頭把以下代表單克隆抗體制備過程步驟的圖解的字母按正確順序連接起來。順序是？

你學(xué)會(huì)了嗎？第51頁/共76頁2.3單克隆抗體的應(yīng)用1、診斷試劑——最廣泛應(yīng)用準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)易、快速單克隆抗體最主要的優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，靈敏度高，并能大量制備。第52頁/共76頁“生物導(dǎo)彈”＝單克隆抗體＋藥物單抗導(dǎo)向，藥物為彈頭2、治療疾病和運(yùn)載藥物主要用于治療癌癥治療，單克隆抗體作為載體，運(yùn)載抗癌藥物，形成“生物導(dǎo)彈”，準(zhǔn)確殺傷癌變細(xì)胞。第53頁/共76頁第54頁/共76頁第55頁/共76頁第56頁/共76頁第57頁/共76頁第58頁/共76頁例．下圖是單克隆抗體制備流程階段示意圖。（1）_______________技術(shù)是單克隆抗體技術(shù)的基礎(chǔ)。（2）根據(jù)培養(yǎng)基的用途分類，圖中HAT培養(yǎng)基屬于________培養(yǎng)基。（3）單克隆抗體與常規(guī)的血清抗體相比，最大的優(yōu)越性是________________。（4）動(dòng)物細(xì)胞融合除了采用植物細(xì)胞原生質(zhì)體融合常用的誘導(dǎo)劑外，還可以采用________________。（5）選出的雜交瘤細(xì)胞既具備骨髓瘤細(xì)胞的_______________特點(diǎn)，又具備淋巴細(xì)胞的_______________特點(diǎn)。（6）淋巴細(xì)胞是由動(dòng)物體_________中的______________細(xì)胞分化、發(fā)育而來。（7）雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是____________。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)選擇特異性強(qiáng),靈敏度高滅活的病毒在體外大量增殖分泌特異性抗體骨髓造血干細(xì)胞主動(dòng)運(yùn)輸?shù)?9頁/共76頁1975年Kohler和Milstein的單克隆抗體技術(shù)在生產(chǎn)和使用抗體方面開創(chuàng)了新紀(jì)元，圖10示單克隆抗體制