細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥

細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥第1頁/共45頁2第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指通過實(shí)驗(yàn)方法，人工地把人們想要研究的動(dòng)物或人類基因，或者是有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的藥物蛋白質(zhì)基因等，通常稱為外源基因，導(dǎo)入動(dòng)物的受精卵（或早期胚胎細(xì)胞），使之與動(dòng)物本身的基因組整合在一起，這樣外源基因能隨細(xì)胞的分裂而增殖，并能穩(wěn)定地遺傳給下一代的一類動(dòng)物。第2頁/共45頁外源目的基因的制備外源目的基因有效導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞選擇獲得攜有目的基因的細(xì)胞選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞胚胎發(fā)育及鑒定篩選所得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系第3頁/共45頁以綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠為例：Geneconstruct

pEGFP-N1載體是一種把異源性的蛋白質(zhì)融合至EGFP的N端的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，含有人類巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動(dòng)子，SV40PolyA尾，pUC復(fù)制起始點(diǎn)（原核）和SV40復(fù)制起始點(diǎn)（真核），20個(gè)多克隆位點(diǎn)，具有篩選標(biāo)志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因。異源性蛋白與EGFP閱讀框一致地克隆入pEGFP-N1，形成的表達(dá)重組體在CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)下，表達(dá)EGFP和目標(biāo)蛋白的融合蛋白。波長(zhǎng)490nm的紫外線激發(fā)后，可在熒光顯微鏡下,觀察到綠色熒光，在多種異源生物中表達(dá)且無細(xì)胞毒性。第4頁/共45頁microinjection

受精卵準(zhǔn)備胚胎操作過程顯微注射假孕母鼠準(zhǔn)備(養(yǎng)母)

胚胎移植第5頁/共45頁TransgeneanalysisBiopsyPCRanalysisSouthernblot第6頁/共45頁P(yáng)henotypicanalysisPhenotypicAnalysisonfoundersharboringGFPgene(9.5dpc)GFP+,GFP-embryosGFP+tailGFP-,GFP+mice第7頁/共45頁Gurdonetal,Nature,1971,(蛙卵和小鼠胚胎注射mRNA)---顯微注射技術(shù)的嘗試Jaenisch，PNAS,1974,1976，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠的囊胚，使病毒DNA整合到小鼠的基因組中，并傳遞給后代---不能廣泛應(yīng)用，只是少數(shù)ES細(xì)胞整合外源基因，部分組織有外源基因

Gordonetal,PNAS,1980;Brinsteretal,Cell,1981;Costantini&Lacy,Nature,1981;Wagneretal,PNAS,1981---顯微注射技術(shù)建立，基因結(jié)構(gòu)沒有合理和認(rèn)真的設(shè)計(jì)，不能分析基因的生理功能第一階段：方法的建立第8頁/共45頁P(yáng)almiter,Brinster,Hammeretal,1982,Nature(MT-GH)---超級(jí)小鼠其它功能基因---基礎(chǔ)研究中一直使用Hammeretal,1985,Nature(rabbit,sheep,pig)GH為主，開始關(guān)注轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的病理變化第二階段：轉(zhuǎn)基因小鼠模型及快速生長(zhǎng)家畜第9頁/共45頁TMtransgenemiceDenningetal2001,NatBiotech.(GT&PrP)Daietal,2002,NatBiotech(GT-outpig)Laietal,2002,Science(GT-outpig)GT:半乳糖轉(zhuǎn)移酶第三階段：異種器官移植(pig)和乳腺反應(yīng)器第10頁/共45頁外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞的方法：

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備：核心技是如何把目的基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物早期胚胎細(xì)胞中原核期胚胎顯微注射法反轉(zhuǎn)錄病毒感染法胚胎干細(xì)胞法精子載體法人工酵母染色體法受精前卵細(xì)胞顯微注射法第11頁/共45頁

原核期胚胎顯微注射：

創(chuàng)始人Jaenish（1974),主要步驟：公母畜交配（或通過人工授精）獲得原核期受精卵，外源裸露DNA通過徽注射導(dǎo)入受精卵，然后將徽注射后的受精卵移入受體輸卵管中繼續(xù)發(fā)育。第12頁/共45頁通過激素療法使小鼠超數(shù)排卵，開始時(shí)注射雌性妊娠血清，48小時(shí)后再注射人絨毛膜促進(jìn)腺激素，這時(shí)小鼠便會(huì)超數(shù)排卵，一般情況下5-10個(gè)，超數(shù)排卵為35個(gè)；與雄性小鼠交配，然后殺掉小鼠，從其輸卵管內(nèi)取出受精卵將經(jīng)純化的轉(zhuǎn)基因樣品迅速注射入受精卵中變大雄性原核內(nèi)將25-40個(gè)注射了轉(zhuǎn)基因的受精卵移植入代孕小鼠體內(nèi)；受精卵發(fā)育成胚胎，并繁殖成轉(zhuǎn)基因小鼠子代；從小鼠子代體內(nèi)取出DNA樣品，進(jìn)行雜交，鑒定轉(zhuǎn)基因的整合與否及位點(diǎn)；子代小鼠間進(jìn)行再交配，繁殖，觀察轉(zhuǎn)基因是否遺傳及表達(dá)2023/4/2313第13頁/共45頁2023/4/23141.可靠性高、重復(fù)性好2.對(duì)于小鼠來說，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的效率比較高3.導(dǎo)入DNA片段的大小和類型不受限制4.轉(zhuǎn)基因在代與代之間傳遞的穩(wěn)定性好5.整合位點(diǎn)的隨意性可能對(duì)轉(zhuǎn)基因表達(dá)造成影響6.可能會(huì)出現(xiàn)不希望的插入突變7.開發(fā)裝置和技術(shù)的花費(fèi)大時(shí)間長(zhǎng)第14頁/共45頁2023/4/2315顯微注射法獲得轉(zhuǎn)基因鼠的成活率第15頁/共45頁2023/4/2316利用脈沖電場(chǎng)提高細(xì)胞膜的通透性，從而使外源DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中。此法簡(jiǎn)單、效率較高，廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移。電穿孔法實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移第16頁/共45頁

反轉(zhuǎn)錄病毒感染法：

利用反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs（長(zhǎng)末端重復(fù)序列）區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性特點(diǎn)，將外源基因連接到LTR下部進(jìn)行重組，再包裝成為高滴度病毒顆粒，去直接感染受精卵或徽注入囊胚腔中，攜帶外源基因的反轉(zhuǎn)錄病毒DNA可以整合到宿主染色體上。轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子第17頁/共45頁2023/4/2318

缺點(diǎn)：低拷貝數(shù)需要逆轉(zhuǎn)錄病毒插入DNA大小有限可能產(chǎn)生不希望的重組高頻的鑲嵌現(xiàn)象逆轉(zhuǎn)錄病毒的序列可能干擾轉(zhuǎn)基因表達(dá)第18頁/共45頁

胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法：將目的基因轉(zhuǎn)移入ES，重新導(dǎo)入囊胚或經(jīng)篩選后對(duì)轉(zhuǎn)入外源基因ES進(jìn)行克隆，可培育轉(zhuǎn)基因個(gè)體。在小鼠上應(yīng)用成熟，大動(dòng)物較晚。從豬胚胎中獲得了干細(xì)胞克隆系1988，牛的胚胎干細(xì)胞1990。建立大家畜ES細(xì)胞系仍很困難，但隨著一些相關(guān)關(guān)鍵技術(shù)的成熟，ES細(xì)胞介導(dǎo)法將會(huì)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究中起到更加重要的作用第19頁/共45頁精子載體法

直接用精子作為外源DNA載體的基因轉(zhuǎn)移方法。精子直接與外源DNA混合培養(yǎng)，外源基因可以進(jìn)入精子頭部，受精后能發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其整合率低（雞為6.0%），但表達(dá)率高達(dá)50%。許多因素影響DNA與精子結(jié)合。較長(zhǎng)的DNA片段比較短的DNA片段（150～750dp）更容易被精子所攝取。對(duì)精子和附睪精子的清洗可提高精子與DNA的結(jié)合率。目前已采用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法，脂質(zhì)體借靜電作用吸附于細(xì)胞表面，通過與細(xì)胞膜融合，細(xì)胞內(nèi)吞而將結(jié)合的基因?qū)爰?xì)胞。第20頁/共45頁受精前卵細(xì)胞顯微注射法

Anthony等（1999）嘗試一種新方法：預(yù)先將小鼠精子進(jìn)行破膜處理，與編碼綠色熒光蛋白GFP報(bào)告分子的外源DNA短時(shí)間（1min）共孵育，然后徽注射入減數(shù)分裂II期的卵母細(xì)胞質(zhì)中，取得64%～94%轉(zhuǎn)基因表達(dá)胚胎。將轉(zhuǎn)GFP的胚胎移植，20%的后代表現(xiàn)為基因整合。此項(xiàng)研究揭示，精子膜經(jīng)冷凍干燥或解凍處理后，外源DNA可穿過外膜，吸附于內(nèi)膜。因此外源DNA能通過精子的徽注射有效轉(zhuǎn)入卵母細(xì)胞，經(jīng)膜處理的攜外源DNA精子的徽注射是一種有效的轉(zhuǎn)基因手段。第21頁/共45頁2023/4/2322四種方法比較方法顯微注射胚胎干細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒精子介導(dǎo)優(yōu)點(diǎn)外源基因整合效率較高，不需要載體，目的基因的長(zhǎng)度可達(dá)100Kb外源DNA的整合率高；

整合在生殖細(xì)胞中的比例也很高?？稍谡宵c(diǎn)整合轉(zhuǎn)移基因的單個(gè)拷貝；該方法簡(jiǎn)單、方便缺點(diǎn)精密儀器，技術(shù)操作較難，易造成宿主動(dòng)物基因組的插入突變ES細(xì)胞株不易建立，長(zhǎng)期培養(yǎng)后出現(xiàn)分化現(xiàn)象；生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物都是嵌合體插入的基因有大小限度；嵌合性很高；外源DNA在動(dòng)物各種組織中的分布不均有些結(jié)果不能重復(fù)第22頁/共45頁

酵母人工染色體(YAC)載體是近年發(fā)展起來的新型載體,它能克隆百萬對(duì)堿基的大片段DNA。作為制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物載體具有以下優(yōu)點(diǎn)：A.

保證大片段DNA的完整性B.

提高較長(zhǎng)外源片段在動(dòng)物轉(zhuǎn)基因時(shí)的整合率C.

保證目的基因上下游的側(cè)翼序列的完整性，因而可以消除或減弱基因整合后的位置效應(yīng).因此，YAC介導(dǎo)法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有廣闊的應(yīng)用前景

酵母人工染色體(YAC)法第23頁/共45頁

一般把目的片段在器官或組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物叫動(dòng)物生物反應(yīng)器（bioreactor），幾乎任何有生命的器官、組織或其中一部分都可經(jīng)過人為馴化為生物反應(yīng)器,從生產(chǎn)的角度考慮，生物反應(yīng)器選擇的組織和器官要方便產(chǎn)物的獲得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此發(fā)展了動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器,動(dòng)物血液生物反應(yīng)器和動(dòng)物膀胱生物反應(yīng)器等。其中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的研究最為引人注目。第二節(jié)動(dòng)物生物反應(yīng)器第24頁/共45頁※醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

a.抗出血藥物

b.抗凝血藥物

c.血栓治療藥物

d.肺氣腫治療藥物

e.免疫治療藥物

f.人型化單克隆抗體荷蘭：GenPharm公司用轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)EPO，產(chǎn)值40億美元英國：生產(chǎn)1-抗胰蛋白酶制劑（治療肺氣腫?。┑霓D(zhuǎn)基因羊,一升羊奶6000美元1999年，只有三種產(chǎn)品進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)；到2009年，已經(jīng)有70多種進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)或即將進(jìn)入市場(chǎng)。第25頁/共45頁

應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物/乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白是藥物生產(chǎn)的一種全新模式，具有投資成本低、藥物開發(fā)周期短和經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn)，將成為21世紀(jì)最具有巨額經(jīng)濟(jì)利潤(rùn)的新型醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)。

第26頁/共45頁動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器

通過家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉價(jià)的人體藥用蛋白，是研究的熱點(diǎn)。從1987年Gordon等在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中得到人組織型纖維蛋白溶酶原激活因子（tPA），到現(xiàn)在已有數(shù)十種人體蛋白在家畜乳腺中表達(dá)。我國已構(gòu)建了30多種乳腺特異表達(dá)載體，在表達(dá)載體構(gòu)建的合理性和有效性方面取得了成效。在轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁中，人血清白蛋白的表達(dá)量達(dá)到3.5g/L，人凝血因子IX的表達(dá)量已達(dá)到50mg/L以上，人EPO的表達(dá)量達(dá)到100mg/L以上，BLG的表達(dá)量達(dá)到25g/L，均屬于國際領(lǐng)先水平。第27頁/共45頁2023/4/2328應(yīng)用重組DNA技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù),先將外源基因置于乳腺特異性調(diào)控序列之下,再將該基因轉(zhuǎn)移到尚處于原核階段或1～2細(xì)胞的受精卵的動(dòng)物胚胎中,經(jīng)胚胎移植得到轉(zhuǎn)基因乳腺表達(dá)的動(dòng)物個(gè)體,通過回收乳汁獲得表達(dá)產(chǎn)物。

動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器第28頁/共45頁

表達(dá)載體的構(gòu)建

制備乳腺生物反應(yīng)器的關(guān)鍵是保證目的蛋白特異性在乳腺中的高效表達(dá)，外源基因在乳腺表達(dá)需要有一個(gè)引導(dǎo)泌乳期乳蛋白基因表達(dá)的序列。傳統(tǒng)表達(dá)載體都是選用某種乳蛋白基因的調(diào)控序列作為啟動(dòng)子元件。這些基因的調(diào)控區(qū)主要包括啟動(dòng)子區(qū)、增強(qiáng)子序列和其他眾多轉(zhuǎn)錄、翻譯相關(guān)元件。第29頁/共45頁

目前用于表達(dá)載體的啟動(dòng)子調(diào)控元件主要有四類乳腺定位表達(dá)調(diào)控元件：第一類是B2乳球蛋白(BLG)，第二類是酪蛋白基因調(diào)控序列：第三類是乳清酸蛋白(WAP)基因調(diào)控序列；第四類是乳清白蛋白基因調(diào)控序列。

2023/4/2330第30頁/共45頁

目前已克隆并用作構(gòu)建載體的乳蛋白基因有：

β-乳球蛋白(BLG)基因、αSl-酪蛋白基因、β-酪蛋白基因、乳清酸蛋白(WAP)及乳清白蛋白基因。反芻動(dòng)物一般采用牛的β-乳球蛋白（BLG）基因，該基因非常穩(wěn)定，并能在乳腺中特異性表達(dá)；家兔、豬和鼠類則采用乳清酸蛋白WAP

第31頁/共45頁抗凝血藥物：抗凝血酶Ⅲ

第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因蛋白產(chǎn)物。將半乳糖β-酪蛋白的啟動(dòng)子和含抗凝血酶Ⅲ基因序列相連，轉(zhuǎn)入綿羊胚胎細(xì)胞，在轉(zhuǎn)基因綿羊的乳液中得到有生物活性抗凝血酶Ⅲ蛋白，產(chǎn)量可達(dá)7g/L。2006年6月2日上市。治療先天性抗凝血酶缺失癥病，我國2008年11月首次用乳腺生物反應(yīng)器獲得抗凝血酶Ⅲ蛋白純品第32頁/共45頁

α1-抗胰蛋白酶:

抑制肺氣腫釋放的蛋白酶對(duì)肺組織的破壞.

是一個(gè)利用BLG基因構(gòu)建的重組蛋白。將BLG5末端4.0kb序列與人的α1-抗胰蛋白酶（α1AT）基因的6.5kb片段（去掉第一個(gè)內(nèi)含子）融合，再連接羊的BLG啟動(dòng)子，以pPOLYⅢ-Ⅰ為載體，轉(zhuǎn)入羊的胚胎細(xì)胞，可在轉(zhuǎn)基因羊分泌的乳液中得到含量高達(dá)60.0mg/ml的重組蛋白α1AT。第33頁/共45頁

從轉(zhuǎn)基因羊的羊奶中提取出治療心臟病的藥物人組織型纖維蛋白溶酶原激活因子（tPA）。第34頁/共45頁紅細(xì)胞生成素（EPO）

目前國內(nèi)外均采用CHO細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)人EPO，成本比較昂貴，而用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的EPO，可能是一條理想的途徑。將EPODNA分別以HindⅢ和BamHI酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳回收5.4kb的HinⅢ/BamHI片段，插入pGEM-7zf(+)載體，再將867bp的β-乳球蛋白（BLG）啟動(dòng)子插入EPO基因之前EcoR、ClaI位點(diǎn)，構(gòu)建表達(dá)載體pGEM-3zf(+)β-LG-EPO。通過顯微注射方法得到轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中的EPO含量可達(dá)0.5μg/ml。第35頁/共45頁問題及展望

目前，生產(chǎn)實(shí)踐中動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用已嶄露頭角，但這項(xiàng)技術(shù)還存在著眾多問題，※研發(fā)周期長(zhǎng)、前期投資大及技術(shù)難度高等，導(dǎo)致所有產(chǎn)品都未商品化；※有關(guān)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基礎(chǔ)理論研究還比較薄弱；※乳腺生物反應(yīng)器的異位表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的泄露問題也需要各種新技術(shù)來解決；※人們對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)所涉及的倫理道德問題的考慮，對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品接受