體內(nèi)藥物分析方法

體內(nèi)藥品分析Biopharmaceuticalanalysis體內(nèi)藥物分析方法第1頁第一章體內(nèi)藥品分析概述一、體內(nèi)藥品分析定義狹義：利用當代分析儀器和分離伎倆對人和動物血液、尿和組織等樣品進行定性定量分析廣義：經(jīng)過體內(nèi)藥品濃度分析，了解藥品在體內(nèi)數(shù)量和質(zhì)量改變，取得藥代動力學(xué)參數(shù)，為藥品生產(chǎn)、臨床應(yīng)用作出評價體內(nèi)藥物分析方法第2頁二、體內(nèi)藥品分析意義（一）在新藥評價和開發(fā)中意義1．全方面質(zhì)量控制2．新藥報批3．為設(shè)計新藥提供信息①從代謝產(chǎn)物中開發(fā)新藥保泰松→羥基保泰松（作用強、副作用小）非那西丁→撲熱息痛②前藥設(shè)計③新劑型研究，緩控釋、經(jīng)皮制劑等以上內(nèi)容必須經(jīng)過測定體內(nèi)藥品濃度得以處理體內(nèi)藥物分析方法第3頁（二）臨床合理用藥中意義

1．血藥濃度與藥理作用體內(nèi)藥物分析方法第4頁2.影響血藥濃度原因（1）機體原因a．生理原因年紀、性別、生理情況b．病理原因c．遺傳原因（2）藥品原因a．劑型原因（生物利用度問題）b．藥品合并使用（酶抑、酶促）c．時間原因體內(nèi)藥物分析方法第5頁（三）藥品中毒解救意義（四）興奮劑檢測意義體內(nèi)藥物分析方法第6頁三、體內(nèi)藥品分析對象3．從樣品起源分1．從分析物分母體藥品代謝物內(nèi)源性物質(zhì)2．從生物樣品種類分均勻樣品非均勻樣品人體試驗動物體內(nèi)藥物分析方法第7頁四、體內(nèi)藥品分析任務(wù)（一）方法學(xué)研究（二）治療藥品監(jiān)測TDM，therapeuticalDrugMonitoring1．定義2．哪些藥品需進行體內(nèi)血藥濃度監(jiān)測體內(nèi)藥物分析方法第8頁①有效血藥濃度范圍窄，稍高毒性大，稍低無療效②劑量小，毒性大藥品③個體差異大，劑量難以控制④藥品毒性反應(yīng)與疾病癥狀相同⑤各種藥品合并應(yīng)用，有中毒危險⑥胃腸道、肝臟、腎臟疾病⑦呈非線性動力學(xué)藥品⑧判斷患者用藥依從性體內(nèi)藥物分析方法第9頁（三）藥代動力學(xué)研究（四）代謝分型應(yīng)用（五）內(nèi)源性物質(zhì)測定

體內(nèi)藥物分析方法第10頁五、體內(nèi)藥品分析特點1．干擾雜質(zhì)多2．樣品濃度低3．取樣量少4．工作量大5．時間短6．有一定設(shè)備體內(nèi)藥物分析方法第11頁六、體內(nèi)藥品分析發(fā)展1．國外發(fā)展概況60年代初 發(fā)覺藥效與血藥濃度關(guān)系70年代 體內(nèi)藥品分析方法建立80年代~至今 發(fā)展迅猛，新儀器不停涌現(xiàn)書籍出版《DrugLevelMonitoring》 1980《TherapeuticalDrugMonitoring》 1981《TextbookofBiopharmaceuticAnalysis》 1981體內(nèi)藥物分析方法第12頁2．國內(nèi)情況80年代初，藥品分析工作者提倡，1980年版《藥品分析》教材中納入部分內(nèi)容，第二、三版增加體內(nèi)藥品分析一章。第四版、第五版取消，各學(xué)校開設(shè)體內(nèi)藥品分析課程。80年代開始在醫(yī)院進行臨床藥學(xué)工作，主要測定藥品濃度。體內(nèi)藥物分析方法第13頁相關(guān)書籍吳如金《體內(nèi)藥品分析》 人衛(wèi)版 1984陸明廉《血藥濃度測定與臨床應(yīng)用》上?？萍?1986陳剛《治療藥品監(jiān)測理論與實踐》人民軍醫(yī) 1988吳萊文《治療藥品監(jiān)測》 人衛(wèi)版 1989曾經(jīng)澤《生物藥品分析》 北京大學(xué)出版社1998姚彤煒《體內(nèi)藥品分析》 浙大 張君仁《體內(nèi)藥品分析》 化學(xué)工業(yè)出版社 體內(nèi)藥物分析方法第14頁3．學(xué)科前沿游離藥品濃度測定直接進樣方法研究代謝物測定對映體分析體內(nèi)藥物分析方法第15頁第二章體內(nèi)藥品存在狀態(tài)與

體內(nèi)藥品分析關(guān)系一、藥品體內(nèi)改變吸收→分布→代謝→排泄ADME過程發(fā)生兩種改變物理改變可逆改變化學(xué)改變結(jié)構(gòu)和數(shù)量發(fā)生改變體內(nèi)藥物分析方法第16頁二、藥品與血漿蛋白結(jié)合1．游離型藥品與結(jié)合型藥品（非特異性結(jié)合）①在血漿、組織中均存在游離型和結(jié)合型藥品②尿液中含微量P，血漿中含大量P，唾液中P為血漿1/10③與藥品結(jié)合蛋白主要有白蛋白，a1-酸性糖蛋白、脂蛋白弱酸性藥品主要與白蛋白結(jié)合弱堿性藥品與白蛋白、a1-酸性糖蛋白結(jié)合④藥品與蛋白質(zhì)結(jié)合經(jīng)過共價鍵（氫鍵，離子間靜電力等）體內(nèi)藥物分析方法第17頁2．血漿蛋白結(jié)合率Df+PDbK=解離常數(shù)血漿蛋白結(jié)合率：Β==[P]·[Df]DbDbDb+Df11+K/np+Df/np體內(nèi)藥物分析方法第18頁結(jié)協(xié)力強藥品能夠置換結(jié)協(xié)力弱藥品，經(jīng)過競爭蛋白是藥品相互作用類型之一。由此可見，K、np是影響β主要原因np↓β↓K↓β↑藥品在足夠高濃度時使結(jié)合部位飽和，濃度再增高，多出藥品均呈游離狀態(tài)，結(jié)合部分比率降低，藥品血漿蛋白結(jié)合率是藥代動力學(xué)主要參數(shù)之一。體內(nèi)藥物分析方法第19頁3．血漿蛋白結(jié)合測定平衡透析法、超濾法、凝膠過濾法、光譜法等。（1）平衡透析法①原理②計算β=×100%=Ct-Cf/Ct×100%袋內(nèi)-袋外袋內(nèi)藥品體內(nèi)藥物分析方法第20頁③注意事項a.蛋白質(zhì)溶液新鮮血漿pH7.4，最少三個濃度測定b.緩沖液0.13mol/L磷酸鹽緩沖液，因為Na3PO4抑制酸性藥品與蛋白質(zhì)結(jié)合c.溫度與平衡時間37℃16~48h注意防腐劑加入，藥品分解d.透析袋滲漏檢測3%三氯醋酸e.攪拌保持動態(tài)平衡體內(nèi)藥物分析方法第21頁④影響原因a.藥品膜上吸附b.Donnan效應(yīng)因為電荷影響，可造成平衡時半透膜兩側(cè)游離藥濃不一樣，donnan效應(yīng)，加入中性鹽可消除。c.空白值增加d.緩沖液體積改變，水分進入血漿游離藥濃↑此法用于測定藥品時，花費時間太長，普通少采取體內(nèi)藥物分析方法第22頁（2）超濾法原理計算注意事項a．裝置50μl→5ml，選擇不一樣型號超濾膜，保濕。b．速度與時間3000~10000r/min5~15minc．溫度37℃，25℃，4℃影響原因a．膜吸附b．超濾液體積超濾液/總體積≈0.3~0.6c．超濾膜溫度體內(nèi)藥物分析方法第23頁三、藥品與血漿蛋白結(jié)合對體內(nèi)藥品分析影響1．血漿不一樣對體內(nèi)藥品分析影響2．平衡狀態(tài)不一樣對體內(nèi)藥品分析影響3．平衡狀態(tài)受破壞對體內(nèi)藥品分析影響4．游離與結(jié)協(xié)議時出現(xiàn)時對體內(nèi)藥品分析影響體內(nèi)藥物分析方法第24頁四、藥品代謝1．研究藥品代謝意義了解藥品在體內(nèi)命運及相互作用，確保臨床用藥安全有效研究藥品代謝路徑、藥品結(jié)構(gòu)與藥理作用關(guān)系，尋找新藥研究藥品相互作用機制有利于建立體內(nèi)藥品分析新方法，防止代謝物干擾體內(nèi)藥物分析方法第25頁2．藥品代謝路徑第一相反應(yīng)：在酶作用下發(fā)生氧化、還原、水解，使極性增加，水溶性增強第二相反應(yīng)：藥品或經(jīng)一相反應(yīng)后代謝物與葡萄糖醛酸、硫酸鹽結(jié)合等，使分子極性深入加大，有利于從尿中排出，結(jié)合過程通常使藥品滅活。體內(nèi)藥物分析方法第26頁氧化反應(yīng)還原反應(yīng)水解反應(yīng)結(jié)合反應(yīng)a．葡萄糖醛酸結(jié)合b．硫酸酯化c．谷胱甘肽綴合d．乙?；Y(jié)合e．氨基酸結(jié)合體內(nèi)藥物分析方法第27頁五、藥品代謝與體內(nèi)藥品分析關(guān)系1．樣品保留樣品可能會分解，如血漿酯酶可使酯類藥品水解，酶類可使藥品繼續(xù)代謝，加入酶抑制劑和冷藏保留。2．分析方法選擇光譜法色譜法免疫法3．樣品提取、分離法代謝物極性大、水溶性強，pH緩沖系統(tǒng)分開尿液中藥品多以結(jié)合型存在，要進行水解（酸水解、酶水解，溶劑解）體內(nèi)藥物分析方法第28頁第三章生物樣品預(yù)處理一、生物樣品采集與貯藏體內(nèi)藥品分析慣用分析品種有血液、尿液、唾液，也可用乳汁、淚液、腦脊液、膽汁等。體內(nèi)藥物分析方法第29頁（一）樣品采集1．血樣血樣濃度與作用點濃度親密相關(guān)，能夠反應(yīng)靶器官濃度。血細胞血漿（plasma）血小板血清（serum）血細胞測定血樣中平均分布于細胞內(nèi)和細胞外藥濃抗凝自然全血血液體內(nèi)藥物分析方法第30頁2．尿樣目標：藥品劑量回收，藥品去除，藥品代謝和生物利用度特點：濃度高，易于搜集，體內(nèi)代謝研究，應(yīng)水解分離3．唾液唾液中藥濃與血濃相關(guān)性搜集方法離心搜集體內(nèi)藥物分析方法第31頁（二）樣品貯藏1．血樣（血漿、血清）及時分離→冷藏，-70℃加入穩(wěn)定劑NaF2．尿樣①尿中水、無機鹽、尿素等細菌生長，4℃保留②加入防腐劑a．1%甲苯b．飽和氯仿c．pH改變3．唾液：同血樣體內(nèi)藥物分析方法第32頁二、生物樣品預(yù)處理（一）預(yù)處理目標①存在形式多樣性游離結(jié)合代謝物②濃度低，雜質(zhì)多（分離濃縮）③出現(xiàn)渾濁和沉淀④與試劑起反應(yīng)⑤影響色譜柱壽命體內(nèi)藥物分析方法第33頁（二）處理方法選擇普通標準1．藥品理化性質(zhì)pKa親脂性揮發(fā)性溶解度光譜特征穩(wěn)定性2．濃度范圍靈敏方法3．測定目標定性定量母體代謝4．生物樣品種類5．樣品處理與分析方法選擇①專一性②靈敏性體內(nèi)藥物分析方法第34頁（三）生物樣品去蛋白處理1．加入與水能混溶有機溶劑及中性鹽甲醇乙腈甲醇1:2乙腈1:1.5（NH4）2SO4NaCl2．加入酸性沉淀劑三氯醋酸高氯酸苦味酸等使蛋白質(zhì)分子陽離子形成不溶性鹽而↓，pH低于等電點體內(nèi)藥物分析方法第35頁3．組織酶消化法加入酶使蛋白質(zhì)水解優(yōu)點：①平衡條件下進行，可防止反應(yīng)和降解②可改進對蛋白結(jié)合率強藥品回收率③不產(chǎn)生乳化4．其它加熱超濾體內(nèi)藥物分析方法第36頁（四）生物樣品綴合物水解1．酸水解2．酶水解β-葡萄糖醛酸苷酶芳基硫酸酯酶混合酶pH4.5-7.037℃3．溶劑解一些藥品硫酸酯，往往加入率取溶劑時發(fā)生分解，同時提取有機溶劑中體內(nèi)藥物分析方法第37頁（五）生物樣品萃取1．液-液萃?。?）優(yōu)點：①與雜質(zhì)分離②簡便③濃集④提取率高（2）提取率：在有機相與水相中溶解度比值分配系數(shù)，普通少許屢次，對生物樣品普通一次萃取，>70%重現(xiàn)性體內(nèi)藥物分析方法第38頁（3）影響提取率原因①pH堿性藥品在堿性pH酸性酸性pH②提取溶劑相同相溶原理沸點低，不影響檢測,性質(zhì)穩(wěn)定，不起化學(xué)反應(yīng)③離子強度加入中性鹽增加離子強度，與水結(jié)合強，便于有機溶劑提取體內(nèi)藥物分析方法第39頁（4）離子對提取對于離子性特強，水溶性極大藥品，可采取離子對提?、僭恝趹?yīng)用陰離子：COOH+SO3H-反離子四丁基銨陽離子：NH2+反離子烷基或芳基磺酸鹽（5）提取技術(shù)普通在試管中進行有機相與水相比1:1或2:1體內(nèi)藥物分析方法第40頁（6）乳化問題辦法①輕緩振搖②含有分散度大或不溶物應(yīng)過濾掉③防止在高pH條件下，從水中提取藥品④防止使用易發(fā)生乳化溶劑⑤萃取劑水中加入少許NaCl體內(nèi)藥物分析方法第41頁破孔方法①機械法②加入少許高級脂肪醇改變表面張力③改進混合溶劑百分比，增加分散相分數(shù)體內(nèi)藥物分析方法第42頁（7）藥品吸附①玻璃容器吸附1%三甲一氯硅烷10%二甲二氯硅烷②血漿體內(nèi)藥物分析方法第43頁2．液固萃取固相萃取[solidphaseextractionSPE]針管式抽閑減壓加壓過濾體內(nèi)藥物分析方法第44頁（1）固相萃取步驟①固相選擇樣品1ml1ml規(guī)格固相1~25ml3ml規(guī)格固相②固相處理反相C18固定相6~10倍體積甲醇洗柱，使溶劑化6~10倍水緩沖服液沖洗達分離狀態(tài)③上樣④分離用適當弱溶劑洗滌洗去雜質(zhì)，通N2干燥固相⑤洗脫待測物改變pH或極性體內(nèi)藥物分析方法第45頁（2）影響固相萃取原因（1）流速流速快，按觸不充分，樣品流失回收率低柱處理5~10ml·min-1洗脫0.2~1ml·min-1（〈300mg〉2~5ml·min-1（>300mg）（2）裝樣過載突破性試驗已知濃度樣品液①小體積上柱→洗脫回收百分率②加大致積→洗脫回收百分率③繪圖當回收率下降時為過載體內(nèi)藥物分析方法第46頁（六）生物樣品組分濃集（七）衍生化處理GC衍生化HPLC衍生化體內(nèi)藥物分析方法第47頁第四章體內(nèi)藥品分析方法建立與評價一、分析方法靈敏度專屬性光譜法++剛開始應(yīng)用較多雙波長，導(dǎo)數(shù)色譜法++++++HPLCGC免疫法++++++疫交叉反應(yīng)，重現(xiàn)性依據(jù)藥品理化性質(zhì)，結(jié)構(gòu)特征，藥品濃度，干擾成份大小，試驗?zāi)繕梭w內(nèi)藥物分析方法第48頁二、分析方法設(shè)計依據(jù)方法建立原始方法改進→創(chuàng)新創(chuàng)建方法體內(nèi)藥物分析方法第49頁1．做好文件總結(jié)2．充分了解藥品特征及體內(nèi)情況pH、親脂性、溶解度、極性、光譜特征、藥動學(xué)參數(shù)、體內(nèi)代謝情況3．明確測定目標、要求目標4．結(jié)合試驗室條件

設(shè)備條件

預(yù)處理方法藥濃監(jiān)測藥代動力學(xué)研究母體藥品和代謝物體內(nèi)藥物分析方法第50頁三、分析方法建立1．純品進行測定確定線性范圍、靈敏度、反應(yīng)條件（pH、t、T）2．空白樣品測定確定空白樣品是否有干擾3．以水代替空白樣品，加標準液后測定了解提取率、檢測濃度確定萃取條件、pH、揮發(fā)濃縮等4．空白樣品加入標準液測定標準曲線建立

回歸方程

回收率5．試驗樣品測定

體內(nèi)藥物分析方法第51頁四、分析方法評價可行性和可靠性1．準確度accuracy

測定結(jié)果與真實性差異用回收率表示

①靠近100%②相對恒定體內(nèi)藥物分析方法第52頁①絕對回收率也稱萃取回收率、提取回收率測定血漿樣品中藥品濃度/相同濃度標準液=絕對回收率考慮3個濃度（高、中、低）

分布在標準曲線成上、中、下普通要求絕對回收率在≥70%普通方法 HPLC內(nèi)標內(nèi)標法時注意：藥品與內(nèi)標用各自外標法測定回收率應(yīng)相近，差值<10%體內(nèi)藥物分析方法第53頁②相對回收率方法回收率藥品系列濃度+血樣→標準曲線取高、中、低三濃度加入到空白血漿中，處理后測定，與加入標準量相比，得方法回收率，測定值<15%，定量限<20%體內(nèi)藥物分析方法第54頁注意問題：a．加入藥量與實際測定值相近b．加入物與實際存在狀態(tài)相近c．空白試驗

與已確定方法進行比較體內(nèi)藥物分析方法第55頁2．精密度precision

①標準差SD②相對標準性偏差RSD小于15%，定量限小于20%②日間精密度 日內(nèi)精密度體內(nèi)藥物分析方法第56頁3．靈敏度（sensitivit