又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR,它是在同一PCR反應(yīng)體系

多重PCR（multiplexPCR）,又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR,它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同.DNA引物引物的選擇遵從簡單的規(guī)則：引物長度為18-24bp或更長，GC含量為35%-60%,退火溫度55°C-58C或更高。長些的引物（如DMD基因的引物，28-30bp）使反應(yīng)在更高的退火溫度下進(jìn)行并產(chǎn)生較少的非特異性產(chǎn)物。使用軟件Primers1.29（從/下載的免費(fèi)軟件）來計(jì)算熔點(diǎn)并檢測可能的引物間的相互作用。使用BLAST工具在NCBI序列數(shù)據(jù)庫中對多對引物進(jìn)行比對，以檢測可能的重復(fù)序列。單基因的PCR.首先設(shè)計(jì)了一個(gè)分別單獨(dú)擴(kuò)增所有基因的PCR程序。反應(yīng)混合物包括：1xPCR緩沖液，0.4gM引物，5%DMSO和1UTaqDNA聚合酶，共25gL反應(yīng)體積。將在同一臺PCR儀，在同型號的不同PCR儀上，在不同型號PCR儀上及在不同制造商的PCR儀上進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行比較。在同一臺PCR儀上或在同型號的不同PCR儀上擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性很好，但在不同制造商的PCR儀上進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果有明顯差異，但是通過對循環(huán)條件的調(diào)節(jié)可以得到好的重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)表明對于100-300bp的基因擴(kuò)增產(chǎn)物，通過降低延伸溫度可以增加某些產(chǎn)物的產(chǎn)量。對于單一PCR反應(yīng)，退火時(shí)間與延伸時(shí)間并不明顯影響結(jié)果，但改變退火溫度可以改變PCR產(chǎn)物的特異性和產(chǎn)量。對于擴(kuò)增22Y特異基因（Figure2a），PCR程序A得到最佳結(jié)果（Table2）。ILL醐rtfprimtrxIH-dlnthrMUHpki林幄fmHNam*恤Lffi)S^u際N寸m導(dǎo)<Eocjus)Sf?(bp)(g時(shí)t叩）Nairn<IOCJUB>SizeY-1Y-EY-3Y-4泗4SY1433-113蹈aT14472D7S273DYS231DYS1JSSRY301SY15-?涎sY10G3013C3DY5Z24□YSMO口丫別DYS2BOSY1T7262sY81?ogsYB2264SY127274心潴DVS271DVK7SW地怕武海瀏玫1快譜Y-6HP3E舔獺KA1YDYS274DVF43S1sVI&t183?￥147100Y6PHc&41CBs￥1^9T32KALfDVS232na.DZS115Dh￥153133DYS275DY^2J7sraa123sY97104DYS27EDY■里網(wǎng)HMDebfiSi眼□MDfxo-nSizeKIflM：&Si*No.Cbp)(rocus)(bp]iz.1No.45547Ft1535AFU263;d1Dl2SSt3231.7-541PME35No.3AFU2&E^DT2S43271-231No.19459No.5C271AFIJ2&hxg3P13S310243^25?No.174UNa.6AFMiilYvb&D12S&522fl-?3CPdo.S1明8N9,p睥qUd.12331Nq.44-絕&No.fl19Gna_-IoclieiislssignHiPM-promalarF&g-ionNo.601駟AFUZWzeiD心MAPLf?99zd$□125349AFM135x&3DIW孫7AfW躥訊胳D12S8￡183-?01佛睥142-1fi8105-126I-§0多重PCR多重PCR:等物質(zhì)量的引物混合物（步驟4）.將引物以各種方式混合在同一反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)基因要求對某些反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行改變或優(yōu)化（Table1和Figure2b）。初次進(jìn)行多重反應(yīng)時(shí)，各種引物按相等的摩爾數(shù)添加是很有必要的。結(jié)果將會(huì)揭示哪些引物的濃度或是哪些參數(shù)需要改變。下面將解釋并討論一些優(yōu)化的例子，由于許多參數(shù)被提及不止一次，因此這些例子并未嚴(yán)格遵照Figure1中所列的步驟。

TtMeZ.C)clln(CoBilltlon^FC'RPr理ruimProgramAPr-ogramBProgramCFtrstDenaturing94C,4mtn94G4min94C,4minDfwIu咫&4C,30s94C.加94C,-305Anilol&4-5&C,30礦54C,1Min54C,45sExtend65C,1minT2°Cr1min,20s6&X.2mm32cycles32cycles32cyclesFhfkal￡j(teri&iori65C,3irm72C3min6&C,-3rtih、ProgramDProgramEProgramFFirstDenalurirtg94C,4min94'C,4minnc>neDenature54C.3CsWCJOsMC.30-45sAnn^at55C,30s54C.45&W-58C,車隊(duì)Extend65C,Ahrtirt65C,2min&8C,2m岫30a32cycles45cycles35cyclesFinalExtension65C,3min65C,5minnoneBoldcharactensshowmosttmportantmodifications\vtienprogramsarecompared.*Pr令9「沙〕Awitht缶中different&nnsoling1自mp^wlure^atcordiing1othe-typeofPCRamplification[seeResultsandDiscussion'i.J海亨猬F(xiàn)igureL(a}Singl-e-kaeusPC'll.ArnpiiVrAtjoncfttiflsY心iuWngt-PCRbufteranidprugminA.OriheBjet,tbepnwlLifftsarearrangedinuicreusingorderofs^rnumber:1—3Y]4.2-^￥B!.J-sY82.4--s￥B4.5-ff￥^6^-3￥S8h7-sY94,S-s￥?5.9-ff￥97,IQ-sYl-OU.IL-EYIO5.口?&丫1睥，]3-sYI17hM-t￥]2J.I5-5Y13J.(6"*YI4.\l7-!>n-47LIBrYIJ%|9-(￥l2J-5Y157and22-iYlS2).AllprodLictsJiadtheexpectedandtheremisnovisiblenilspecificHinpliticaliDn.LnallIsjihwithoutsk&elBhffii-thesi?nurlceri]-fcbI:LifeTstinol雌谷).fb)OptionizedmuLbp]esre^Gfions.\rulLipk?iPCRwilhpritnermwliirBY-lftYM.(YLM.iYI]7,iY102.(YtSlhnlWnnd(YBS).Y^214^tHE57,lYrfl,sY!1U±ndsV147)TV^l怛￥食％sVLUJriYM,VftHPJJ；.￥6Ptic54riVl緊沖』(sYI4.i￥95.eY127.SYL0*?卵應(yīng)inI.&*PCRbuffedPCRprotramEj.Mix￥-?*i&rniKtui'?Y-JwilMnprimersY61^1FJSnndYtFhc^4.Arrawdi^idkntetlieffiipejctedam.plhonproi(c)以眥籃buheiupri制m巳MulDplcxPtftwithniiiturfii￥■I始Y-4with.PCftpnogrunuAliiiiJUiTihLfi2'j.AlIaiiiplipreducareiuiirIsiustextmLionit65t'J.InliieL醐LlourhneBfexlDnsiorsi72C).bardsaremissiiifinY-1and￥-2.andunspecificpradudisappearinY-]mdY'S*,Lengthmark^iniilJfigyre?-I-kbladder.Inall；xjvsIr^mi廿bottomiSllLs.j*JCe|!1.犯.j多重PCR反應(yīng)循環(huán)條件的優(yōu)化編輯本段回目錄延伸溫度.Figure2c展示了當(dāng)加入相等量(0.4JMeach)的四種用于擴(kuò)增Y染色體上不同基因的引物進(jìn)行多重PCR時(shí)，用程序A和程序B擴(kuò)增得到的結(jié)果(Table2)，程序B有更高的延伸溫度(72°C)和更長的退火和延伸時(shí)間?？偟膩碚f，用程序A對Y-1,Y-3*和Y-4的擴(kuò)增得到了更高產(chǎn)量的PCR產(chǎn)物。此外，用程序B擴(kuò)增時(shí)某些產(chǎn)物消失(Y-1、Y-2)，同時(shí)出現(xiàn)了某些非特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物(Y-1、Y-3*)。程序B得到的結(jié)果更差一些，表明高的延伸溫度減少了某些基因的擴(kuò)增，盡管我們試圖用長的退火時(shí)間和延伸時(shí)間來消除這種影響。延伸時(shí)間.在多重PCR中，由于同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)基因，酶和dNTP的缺乏就成為限制因素，就需要更多的時(shí)間來完成所有產(chǎn)物的合成。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)表明了延伸時(shí)間的影響。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，一對Y染色體引物(Y6BaH34pr,910bp)被加入X染色體引物混合物(X-3)中。結(jié)果表明(Figure3b)，多重PCR中增加延伸時(shí)間(程序A與程序D)可以增加較長的PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用程序C和A(Figure3a和Table2)擴(kuò)增四個(gè)Y染色體上的基因。當(dāng)延長延伸時(shí)間時(shí)，所有基因的PCR產(chǎn)物量都增加了。退火時(shí)間和退火溫度.將退火時(shí)間從20秒改為兩分鐘并未改變擴(kuò)增效率，但退火溫度卻是最重要的參

數(shù)之一。盡管許多基因能在退火溫度為56°C-60°C被特異的擴(kuò)增，我們的經(jīng)驗(yàn)表明將退火溫度降低4C-6C對于在多重PCR中擴(kuò)增出同樣的基因是必需的。Figure3,d-f展示了這種情況，單獨(dú)擴(kuò)增時(shí)退火溫度為60C的基因在多重PCR中退火溫度為54C時(shí)最優(yōu)。盡管在54C時(shí)可能出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增(如Figure3c)，但多重反應(yīng)中并發(fā)的其他基因的特異擴(kuò)增會(huì)消除非特異性擴(kuò)增的影響。相似的，當(dāng)同時(shí)擴(kuò)增許多特異的基因時(shí)，擴(kuò)增效率高的基因會(huì)使擴(kuò)增效率低的基因的擴(kuò)增產(chǎn)量降低。這是由于在PCR反應(yīng)中酶和dNTP的供應(yīng)是有限的，所有的產(chǎn)物都是由同樣的一組原料生成。PCR循環(huán)數(shù).引物混合物Y-3*被用于擴(kuò)增兩個(gè)不同的基因組DNA樣品，以不同的循環(huán)次數(shù)做多次實(shí)驗(yàn)(Figure4a)。其中的一個(gè)基因組模板質(zhì)量更高或DNA含量更高?？梢钥闯?，當(dāng)循環(huán)數(shù)增加時(shí)，兩組樣品的各擴(kuò)增帶的產(chǎn)量都逐漸增加。PCR產(chǎn)物量增加最明顯是在25個(gè)循環(huán)附近。通常對于一個(gè)反應(yīng)，28至30個(gè)循環(huán)足矣，增加至60個(gè)循環(huán)對產(chǎn)物量無明顯影響。多重反應(yīng)中試劑組分的優(yōu)化編輯本段回目錄當(dāng)使用同樣的擴(kuò)增程序時(shí)，不同的實(shí)驗(yàn)間存在差異(Figures2c和3a)。解決重復(fù)性問題要求調(diào)節(jié)PCR反應(yīng)組分。多重反應(yīng)中試劑組分的優(yōu)化編輯本段回目錄引物的量.最初，在多重PCR反應(yīng)中使用了相等物質(zhì)量的引物(每種引物為0.2-0.4四M)(Figure3c)。但是擴(kuò)增并非均一的，即使在優(yōu)化了循環(huán)條件后，某些基因的擴(kuò)增產(chǎn)物仍不明顯。解決這一問題，要求改變反應(yīng)中各種引物的比例，要增加"弱”基因的引物量，而要減少”強(qiáng)”基因的引物量。不同基因相對的引物終濃度有明顯的差異(0.04-0.6四M)，這完全取決于經(jīng)驗(yàn)。

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2mMMgCl2，而濃度為每種800gM的dNTP要得到最好的擴(kuò)增結(jié)果至少需要6-7mM的MgCl2。濃度為每種200gM的dNTP擴(kuò)增反應(yīng)要求的閾值為1mMMgCl2，當(dāng)MgCl2低于這一閾值時(shí)，擴(kuò)增會(huì)減少。PCR緩沖液（Kcl）的濃度.KCl或PCR緩沖液濃度.提高PCR緩沖液的濃度為2x（或僅將KCl的濃度增加到100mM）可以提高多重PCR的效率（Figure4d及Figure3,d-f），這種調(diào)節(jié)作用比調(diào)節(jié)DMSO，甘油或BSA更重要。通常產(chǎn)生長片斷擴(kuò)增產(chǎn)物的引物在低鹽濃度下擴(kuò)增結(jié)果更好，而產(chǎn)生短片斷擴(kuò)增產(chǎn)物的引物在高鹽濃度下擴(kuò)增結(jié)果更好，高鹽濃度會(huì)使長片斷擴(kuò)增產(chǎn)物難于變性解鏈（比較Figure4d中0.4x緩沖液與2.8x緩沖液）。例如，sY94引物對（熔點(diǎn)為58°C）在緩沖液的濃度為0.8x時(shí)擴(kuò)增效果優(yōu)于sY88引物對（熔點(diǎn)為58C）和SY151引物對（熔點(diǎn)為52C），但在高的鹽濃度條件下，SY94引物對的擴(kuò)增效果無明顯優(yōu)勢。合適的緩沖液濃度可以克服產(chǎn)物大小和GC含量等因素的影響。PCR緩沖液的比較?我們還比較了原先提到的被稱為DMD的多重PCR緩沖液（6）和相對簡單的KCl緩沖液在多重PCR反應(yīng)中的差異。5x的DMD緩沖液含有83mM（NH4）2SO4,335mMTris-HCl（pH8.8）,33.5mMMgCl2,50mM-mercaptoethanol叩一巰基乙醇）和850gg/mLBSA，緩沖液DMD的使用終濃度為1x，與10%DMSO和1.5mMeachdNTP同時(shí)使用（1,2,4）。實(shí)驗(yàn)表明用1.6x的常規(guī)KCl緩沖液比用DMD緩沖液擴(kuò)增DMD基因（引物混合物X-1）效果更好，明顯見到更多的PCR產(chǎn)物（Figure4e）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用病人的DNA樣品做了十二次重復(fù)，重復(fù)性很好。KCl緩沖液相對簡單，便于調(diào)節(jié)和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。低dNTP濃度時(shí)TaqDNA聚合酶的保真性更高（9）。使用KCl緩沖液（要求更少的dNTP）有利于對PCR產(chǎn)物做進(jìn)一步的突變分析。模板DNA的量和TaqDNA聚合酶.當(dāng)每25gL反應(yīng)體積中DNA的模板量為30ng到500ng時(shí)，混合物Y-3*未表現(xiàn)出明顯差異（Figure4f），然而當(dāng)模板量低于30ng時(shí)，某些PCR產(chǎn)物的量會(huì)減少。當(dāng)模板量很低時(shí)（pg級的DNA），擴(kuò)增的效率與特異性可以通過進(jìn)一步降低退火溫度來優(yōu)化，有時(shí)甚至要降低10C-12C（數(shù)據(jù)未顯示）。使用引物混合物Y-3（Figure5a）來測試不同TaqDNA聚合酶的濃度（Perkin-Elmer）。TaqDNA聚合酶的最適濃度為每25gL反應(yīng)體積中0.4gL或2U。也許是由于TaqDNA聚合酶中甘油濃度過高，加入過多的TaqDNA聚合酶會(huì)導(dǎo)致不同基因擴(kuò)增不平衡及背景的輕微增高。在1.6xPCR緩沖液中使用自制的五種不同來源的TaqDNA聚合酶（每25gL反應(yīng)體積中加入2U）對Y-4引物混合物的反應(yīng)體系擴(kuò)增得到了相似的結(jié)果（Figure5b）。佐劑的使用：DMSO,甘油,BSA（Step5E）.許多作者建議使用濃度范圍為5%-10%（v/v）的DMSO和甘油來改善擴(kuò)增的效率（提高產(chǎn)物量）和特異性（沒有非特異性產(chǎn)物）（9）。然而在多重反應(yīng)中，DMSO的使用會(huì)給出矛盾的結(jié)果。例如，5%DMSO增加了某些基因的產(chǎn)物量，減少了另一些基因的產(chǎn)物量，而對某些基因卻沒有任何影響（Figure5c）。使用5%的甘油也得到了相似的結(jié)果。因此，DMSO和甘油的調(diào)節(jié)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)來摸索。加入濃度達(dá)0.8gg/gLBSA（比以前描述得更高）比加入DMSO和甘油更能提高PCR擴(kuò)增的效率。BSA對任何基因的擴(kuò)增都未產(chǎn)生抑制作用。4.〔町AmaiLnta(etizymi.Aniplitiratjanpiuduui!,eKmiiuueV-.irLiningtl.5,I,2,4andSU.25piLrenrlionvolumeareabawiLAitowsindicat已theespectedposltioltsoftheajnpSsficaticnprod-uclEThetticslippnoprimeenzymetonkientraliofiwasbetTi^en1-21'2pL.[bfSourceofenz^TiieMul-hjjJcRI'CflofmtxiuwY-4in1.6>Ptril如10usm啊SUplvnerA^u成m頃呻蝦ihawsthepradLctsobtJinKlwhenlheeiiz^Tiierrcmilajje-3waiusedmttiebuflerpruYidedtrydievaitioLAnugpeciScpivducl呷匏舊d,lc)Umeufsdjuvanh.CCTRpara.ti^'entiilliplexTCRl舊ijigiheY-specifkniixlfiretuilh5"..&MEOthtpBifoiptD)nndwithnulDMSflJn】?buffer】oeisYlSl■andW腫fromimtlunuY*