生物技術(shù)-基因工程原理課件 9第九章 PCR技術(shù)及其應(yīng)用

2023/4/241第九章PCR技術(shù)及其應(yīng)用2023/4/242

PCR(PolymeraseChainReaction)

Polymerase:DNA聚合酶PeoplesChoiceReactionThreesteps:

DenaturationAnnealingExtension2023/4/243基因組DNA引物DNA聚合酶DNA片段體外擴(kuò)增引物2023/4/244PCR技術(shù)的創(chuàng)建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當(dāng)引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)。1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶引入了PCR技術(shù)1989年美國(guó)《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年，Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。2023/4/245KaryB.Mullis（1944－）2023/4/246三篇重要論文TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction(ScientificAmerican,1990,262(4):56-61,64-5)Primer-directedEnzymaticAmplificationofDNAwithaThermostableDNAPolymerase(Science,1988,239(4839):487-91

)SpecificSynthesisofDNAInVitroviaaPolymeraseCatalyzedChainReaction(MethodsinEnzymology,1987,155:335-50)生物樣品DNA片段基因診斷基因治療基因工程產(chǎn)品法醫(yī)學(xué)檢測(cè)人類學(xué)研究……PCR技術(shù)誕生所依賴的社會(huì)需求和研究需要基因組DNA獲取特定DNA片段擴(kuò)增特定DNA片段2023/4/249限制性內(nèi)切酶裂解基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝基因組DNA文庫(kù)DNA文庫(kù)20kBfragments插入噬菌體載體細(xì)菌擴(kuò)增2023/4/2410裂解變性顯影從基因組文庫(kù)中篩選目的基因probe放射性核素標(biāo)記轉(zhuǎn)印2023/4/2411DNA克隆目的基因載體復(fù)制子宿主細(xì)胞擴(kuò)增擴(kuò)增提取DNA分子2023/4/2412DNA聚合酶引物引物M13噬菌體Sanger的測(cè)序技術(shù)引物DNA聚合酶1977年2023/4/2413引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段1983年2023/4/241494℃變性50-65℃退火XX℃延伸2023/4/241594℃55℃37℃PCR循環(huán)2023/4/2416Taq

DNA聚合酶(Thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)405060708090100100806040201988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)2023/4/241772℃94℃55℃PCR循環(huán)2023/4/24181、PCR技術(shù)的基本原理在合適的緩沖體系中,通過加熱使模板DNA雙鏈中的氫鍵斷裂形成單鏈，這個(gè)過程稱為變性。在合適的溫度條件下，特異性引物與模板DNA根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則形成雙鏈，這個(gè)過程稱為退火。在DNA聚合酶的作用下，引物延伸，形成新的。如此循環(huán)往復(fù)，經(jīng)過多個(gè)循環(huán)后，模板DNA在2個(gè)特異性引物之間的序列就會(huì)大量擴(kuò)增。2023/4/2419

體內(nèi)DNA的復(fù)制DNA聚合酶

dNTP解旋酶類引物5’3’2023/4/2420加熱變性復(fù)性復(fù)溫DNA的變性和復(fù)性加熱或強(qiáng)酸、堿性作用可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,雙鏈解離,形成單鏈DNA,這稱為DNA的變性。解除變性的條件后,變性的單鏈可以重新結(jié)合起來,形成雙鏈,其原有的特性和活性可以恢復(fù),這稱DNA復(fù)性,也叫退火。

2023/4/2421PCR擴(kuò)增原理引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退火2023/4/24222PCR技術(shù)的特點(diǎn)1）高度的靈敏性30輪循環(huán)后擴(kuò)增量達(dá)230個(gè)拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍2023/4/24232）特異性引物引物

引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)的最大原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性；同時(shí)盡可能減少非特異性擴(kuò)增。2023/4/2424引物設(shè)計(jì)原則：序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列。引物長(zhǎng)度以18-40bp為宜。堿基盡可能隨機(jī)分布,G+C占50-60%，Tm值應(yīng)相同。引物內(nèi)部避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。兩引物間避免有互補(bǔ)序列。引物3’端決定產(chǎn)物的特異性，不可加以修飾；合成簡(jiǎn)并引物時(shí)，引物的3’端應(yīng)該位于密碼子的第1、2位上，不能位于第3位。引物的5’端僅決定產(chǎn)物的長(zhǎng)度，可以加以修飾。2023/4/24253’5’3’5’限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列啟動(dòng)子序列定點(diǎn)突變探針標(biāo)記2023/4/24263）操作簡(jiǎn)便易行PCR擴(kuò)增法,只需要數(shù)小時(shí),就可以用電泳法檢出待檢樣本中僅僅有的數(shù)個(gè)拷貝的模板序列。只要經(jīng)過簡(jiǎn)單的訓(xùn)練，任何一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的工作人員都可以熟練掌握。2023/4/24274）用途廣泛生命學(xué)科醫(yī)學(xué)工程遺傳工程疾病診斷法醫(yī)學(xué)考古學(xué)2023/4/2428PCR的反應(yīng)體系和方法PCR管加熱使模板變性,退火使引物與模板DNA互補(bǔ),延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫(72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP為原料,以引物為復(fù)制的起點(diǎn),合成新鏈。如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,即高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴(kuò)增特異區(qū)段的DNA帶。2023/4/2429

總體積

50-100lBuffer緩沖液

dNTP原料

Primer引物

DNA分子模板

Taq酶DNA聚合酶1反應(yīng)體系2023/4/2430PCR技術(shù)的基本過程(1)模板DNAdNTP引物Buffer預(yù)變性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5’2基本過程2023/4/2431PCR技術(shù)的基本過程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循環(huán)儀94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7min循環(huán)25～35次2023/4/2432瓊脂糖凝膠電泳PCR技術(shù)的基本過程(3)2023/4/24331）PCR反應(yīng)成分（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。3PCR反應(yīng)條件2023/4/2434（2）引物濃度

0.1-0.5mol/L

濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反應(yīng)特異性下降。（3）Taq

DNA聚合酶(Thermusaquaticus)0.5-2.5U/50l

酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。2023/4/2435（4）dNTPdNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量

dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。2023/4/2436（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的輔酶。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。2023/4/24372）循環(huán)參數(shù)變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈

94oC20-30秒(2)退火溫度由引物長(zhǎng)度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。2023/4/2438（3）延伸

70-75℃,一般為72℃

延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定（4）循環(huán)次數(shù)主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低錯(cuò)誤摻入率增加2023/4/2439經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內(nèi)）94℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃7min42℃forever2023/4/24401）不對(duì)稱PCR

目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長(zhǎng)度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對(duì)量。用途：制備核酸序列測(cè)定的模板制備雜交探針

基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究PCR的類型

高濃度引物低濃度引物2023/4/24422)反向PCR(reversePCR)

是用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增?？蓪?duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長(zhǎng)cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫(kù)的插入DNA；建立基因組步移文庫(kù)。已知序列未知序列未知序列已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶2023/4/24443）多重PCR（復(fù)合PCR）用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。2023/4/2445電泳引物123412342023/4/24464）LP-PCR(Labelledprimers)

利用同位素、熒光素等對(duì)PCR引物進(jìn)行標(biāo)記,用以直觀地檢測(cè)目的基因。特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷可同時(shí)檢測(cè)多種基因成分病毒1病毒2病毒3病毒4標(biāo)記引物ＰＣＲ觀察PCR產(chǎn)物2023/4/24485）錨定PCR(anchoredPCR,A-PCR)PCR的局限：需了解靶基因片段兩測(cè)的序列

對(duì)于未知序列和具有不同末端序列怎么辦？cDNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶3’GG…GG5’CC…CC錨定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC錨定PCR首先合成第一鏈cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),與同聚物尾配對(duì)的3’錨定引物（帶有限制性內(nèi)切位點(diǎn)polydC)一起作PCR擴(kuò)增6）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR擴(kuò)增探針親和固相介質(zhì)檢測(cè)探針信號(hào)可用于基因芯片的制作7）原位ＰＣＲ原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(InSituPCR,Is-PCR)是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段,在不破壞細(xì)胞的前提下,利用一些特定的檢測(cè)手段來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行PCR擴(kuò)增?？蛇M(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。適用于檢測(cè)病理切片中含量較少的靶序列2023/4/2452

原位PCR的作用既往鑒定細(xì)胞內(nèi)特異序列一般采用原位雜交(ISH),但在每個(gè)細(xì)胞中目的片段的拷貝數(shù)少于10的情況下,該方法的敏感度就明顯下降。而標(biāo)準(zhǔn)的PCR則可擴(kuò)增出細(xì)胞內(nèi)單拷貝的序列,敏感度很高,但卻未能與細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合。ISPCR則可把這兩者結(jié)合起來,成為細(xì)胞學(xué)診斷中一種嶄新的檢測(cè)技術(shù)。利用該法可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒感染、細(xì)胞內(nèi)基因重排、以及分析細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)產(chǎn)物等方面發(fā)揮一定作用。在檢測(cè)細(xì)胞的潛在感染方面也具有重要意義。2023/4/2453操作步驟1.細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進(jìn)入2.PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段3.原位雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物A.陽(yáng)性對(duì)照B.陰性對(duì)照C.原位檢測(cè)mRNA表達(dá)8）反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscript-PCR逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增基因mRNA蛋白質(zhì)多肽鏈2023/4/24569)熒光定量PCR（real-timePCR)

通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板量熒光定量PCR儀光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)的PCR儀,通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件。2023/4/2457ThresholdCycle：Ct值，起始循環(huán)數(shù)2023/4/24582023/4/24592023/4/24602023/4/24612023/4/2462ThresholdCycle：Ct值，起始循環(huán)數(shù)2023/4/24632023/4/24642023/4/24652023/4/2466Ct值與模板起始濃度的關(guān)系模板起始濃度越高，Ct值越小Ct值與模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系如果模板濃度增加1倍，Ct值就提前1個(gè)循環(huán)到達(dá)如果模板濃度減少1倍，Ct值就滯后1個(gè)循環(huán)到達(dá)2023/4/24672023/4/24682023/4/24692023/4/24702023/4/24712023/4/24722023/4/24732023/4/24742023/4/24752023/4/24762023/4/24772023/4/24782023/4/24792023/4/24802023/4/24812023/4/24822023/4/24832023/4/24842023/4/24852023/4/24862023/4/24872023/4/24882023/4/24892023/4/24902023/4/24912023/4/24922023/4/24932023/4/24942023/4/24952023/4/24962023/4/2497熒光標(biāo)記2023/4/2498熒光定量PCR標(biāo)記方法內(nèi)摻式染料 SYBRGreenI序列特異性探針 Taqman MolecularBeacons DualProbes(FRET)引物特異性探針 Amplifluor(Intergen)2023/4/24995’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI

2023/4/241005’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

2023/4/24101Taqman探針3’端Q熒光分子能夠吸收5’端R熒光分子發(fā)出的熒光,因此,正常情況下該探針檢測(cè)不到5’端熒光分子發(fā)出的熒光,只能檢測(cè)到3’端熒光分子的熒光信號(hào),但當(dāng)溶液中有PCR產(chǎn)物(模板)時(shí),探針與模板退火,即產(chǎn)生了適合于核酸外切酶活性的底物,從而激活Taq酶的5’外切酶活性,將探針5’端連接的R熒光分子從探針上切割下來,破壞了兩個(gè)熒光分子間的FRET,從而發(fā)出熒光,切割的R熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始模板的數(shù)量熒光能量傳遞技術(shù)(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)2023/4/24102Oligo1:FluoresceinOligo2:LCRed640ExcitationEmissionTransfer熒光共振能量傳遞（FRETProbe）2023/4/24103RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation雙標(biāo)記探針（TaqmanProbe）2023/4/24104RQExcitationXRQQRExcitationEmission分子信標(biāo)（MolecularBeaconProbe）2023/4/24105引物特異性探針（AmplisenorProbe）2023/4/241065’3’5’3’5’3’5’3’3’RQ5’RQRQ3’5’QRRREmissionExcitationQR引物特異性探針（AmplifluorProbe）2023/4/24107熒光定量實(shí)時(shí)PCR與普通PCR的比較實(shí)時(shí)在線監(jiān)控對(duì)樣品擴(kuò)增的整個(gè)過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控,能夠?qū)崟r(shí)地觀察到產(chǎn)物的增加,直觀地看到反應(yīng)的對(duì)數(shù)期降低反應(yīng)的非特異性使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合,提高了PCR反應(yīng)的特異性增加定量的精確性全程監(jiān)控,準(zhǔn)確的算法進(jìn)行定量結(jié)果分析更加快捷方便,無需跑膠

2023/4/24108全新4通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀

普通梯度PCR儀PCR技術(shù)的應(yīng)用1)基因克隆重組DNA質(zhì)粒DNA基因片段2023/4/24110大腸桿菌胰島素重組體+胰島素基因基因工程產(chǎn)品2023/4/241115’5’BamHIBamHIBamHIBamHI2023/4/24112GTCCGGACCCTGCAGGGTCCGGACCCTGCAGGCCTGGGACGTCCCAGG質(zhì)粒DNA目的基因限