生物技術制藥展示PPT課件 楊然-何倩檸-蒙太鑫-棘白菌素Ｂ脫?；腹こ叹?/h1>

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棘白菌素Ｂ脫?；腹こ叹臉嫿懊笇W性質研究HereologousexpressionandenzymaticpropertiesofechinocandinsBdeacylaseinStreptomycescoelicolor小組成員：楊然、何倩檸、蒙太鑫日期：2017-06-08Contents目錄ResearchBackground研究背景1EchinocandinsBdeacylaseinStreptomycescoelicolor工程菌的構建2Enzymaticproperties酶學性質3References&QA參考文獻4研究背景ResearchBackground1免疫低下患者人數(shù)增多真菌發(fā)病率升高深部真菌感染發(fā)病率和病死率顯著增多棘白菌素類抗真菌藥物非競爭性抑制真菌細胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶的活性作用機制獨特毒副作用低對一些唑類和兩性霉素Ｂ耐藥的真菌具有很強的抗菌活性臨床治療系統(tǒng)性真菌感染的“王牌抗生素”研究背景ResearchBackground研究背景ResearchBackground棘白菌素Ｂ（ECB）構巢曲霉次級代謝產(chǎn)物阿尼芬凈ECB脫酰基酶ECB母核猶他游動放線菌及鏈霉菌屬表達產(chǎn)量低，活性不高改進過程研究背景ResearchBackground改進過程改進過程結論：天藍色鏈霉菌(S.coelicolorA3)具有遺傳穩(wěn)定性高，胞外分泌能力強，能夠正確表達高GC％的基因片段等優(yōu)點，是理想的鏈霉菌表達宿主S.lividansTK24S.lividans1236猶他游動放線菌ECB脫?；富?.1倍250倍FR901379脫?；富虿煌磉_系統(tǒng)中酶的表達量及活性均存在顯著差異放線菌①②③研究背景ResearchBackground猶他游動放線菌DNA克隆ECB脫?；富蛱焖{色鏈霉菌工程菌分析酶學性質ECB脫?；父咝П磉_產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工程菌的構建EchinocandinsBdeacylaseinStreptomycescoelicolor2一、重組質粒pSET152-ecbD的構建二、重組S.coelicolorA3/pSET152-ecbD的構建三、重組S.coelicolorA3/pSET152-ecbD的復選四、重組ECB脫?；冈赟.coelicolorA3中表達五、ECB脫?；该富顧z測棘白菌素Ｂ脫酰基酶工程菌的構建EchinocandinsBdeacylaseinStreptomycescoelicolor一、重組質粒pSET152-ecbD的構建正向引物為5’-AAAACTAGATCTTGTTGGTCGAGAGGAAAGATC-3’反向引物為5’-AAACCGCGGTGGCAGGTCCATGGGC-3’棘白菌素Ｂ脫?；腹こ叹臉嫿‥chinocandinsBdeacylaseinStreptomycescoelicolor猶他游動放線菌ZJB-0801基因組引物各200ngPrimix50ng25μLPCR擴增正向反向一、重組質粒pSET152-ecbD的構建棘白菌素Ｂ脫酰基酶工程菌的構建EchinocandinsBdeacylaseinStreptomycescoelicolor大腸桿菌JM109表達質粒pSET152-ecbD

序列正確T4DNA連接酶轉化二、重組S.coelicolorA3/pSET152-ecbD的構建棘白菌素Ｂ脫酰基酶工程菌的構建EchinocandinsBdeacylaseinStreptomycescoelicolor表達質粒pSET152-ecbD

導入E.coliET12567/pUZ8002S.coelicolorA3孢子2×YT打散懸浮50℃水浴熱激處理10min置于37℃的搖床預萌發(fā)3h直至長出芽管稀釋涂布，28℃培養(yǎng)抗生素覆蓋，培養(yǎng)7~10d菌落面積穩(wěn)定三、重組S.coelicolorA3/pSET152-ecbD的復選棘白菌素Ｂ脫酰基酶工程菌的構建EchinocandinsBdeacylaseinStreptomycescoelicolor30℃培養(yǎng)7~10d轉移帶抗性的MS平板定時觀察并記錄生長直徑單菌落轉化子篩選接種含抗生素液體TSBY培養(yǎng)基培養(yǎng)48h收集菌絲體提取DNApSET152-ecbD質粒為陽性對照S.coelicolorA3總DNA為銀性對照PCR擴增驗證一、重組質粒pSET152-ecbD的構建二、重組S.coelicolorA3/pSET152-ecbD的構建三、重組S.coelicolorA3/pSET152-ecbD的復選四、重組ECB脫?；冈赟.coelicolorA3中表達五、ECB脫?；该富顧z測棘白菌素Ｂ脫?；腹こ叹臉嫿‥chinocandinsBdeacylaseinStreptomycescoelicolor酶學性質Enzymaticproperties3酶學性質Enzymaticproperties不同宿主菌對酶活性的影響最適溫度在酶促反應中，溫度對催化劑的活性和穩(wěn)定性都會產(chǎn)生影響，同時溫度還會對反應的平衡產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)，不同宿主菌表達的ECB脫?；傅淖钸m溫度不同。最適pH在酶促反應中，相緩沖液的pH值不僅改變了反應中底物和帶有電荷的酶的離子狀態(tài)，還會對酶的催化活性產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)，不同宿主菌表達的ECB脫酰基酶的最適pH不同。總結Conclusion從A.utahensisZJB-0801中克隆到ECB脫?；富蛞詐SET152作為表達質粒構建重組天藍色鏈霉菌基因工程菌能夠高效表達ECB脫?；该富?30mU/mL目前已報道ECB脫酰基酶活性的較高水平參考文獻References&QA4References&QA參考文獻[1]ZOUShuping,LIAOSixing,NIUKun,ZHENGYuguo,SHENYinchu.HereologousexpressionandenzymaticpropertiesofechinocandinsBdeacylaseinStreptomycescoelicolor[J].JournalofZhejiangUniversityofTechnology,2016,(01):99-103.

[2]SHAOLei,LIJian,LIU

Aijuan,etal.EfficientBioconversionofEchinocandinBtoItsNucleusbyOverexpressionofDeacylasegenes