基因功能研究技術(shù)之基因敲除及基因編輯技術(shù)

博士專題：基因功能研究技術(shù)之

——基因敲除、基因編輯技術(shù)1編輯pptII、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失

基因敲除，又稱基因打靶，是一種遺傳工程技術(shù)，是在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中發(fā)生外源打靶基因與核基因組目標(biāo)基因之間的DNA同源重組，能夠使外源基因定點(diǎn)地整合到核基因組的特定位置上，從而達(dá)到改變細(xì)胞遺傳特性的目的。傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)依賴于細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生的同源染色體的隨機(jī)交換，但在體細(xì)胞內(nèi)，基因同源重組的效率特別低（低于10-6），增加了實(shí)際操作的工作量，限制了該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用。1987年，Thompsson首次建立了完整的ES細(xì)胞基因敲除的小鼠模型，此后基因敲除技術(shù)得到進(jìn)一步的發(fā)展和完善，目前該技術(shù)已經(jīng)成為研究基因功能最直接、最有效的方法之一。2編輯ppt基因敲除技術(shù)分為完全基因敲除、條件型基因敲除、誘導(dǎo)型基因敲除。完全基因敲除是指通過(guò)同源重組法完全消除細(xì)胞或動(dòng)物個(gè)體中的靶基因活性。條件型基因敲除是指通過(guò)定位重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)特定時(shí)間和空間的基因敲除。誘導(dǎo)型基因敲除是通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)劑給予時(shí)間的控制，在動(dòng)物的一定發(fā)育階段和一定組織細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因進(jìn)行敲除的技術(shù)。3編輯ppt基因載體的構(gòu)建：把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA分子都重組到帶有標(biāo)記基因(如neo基因，TK基因等)的載體上，成為重組載體。基因敲除是為了使某一基因失去其生理功能，所以一般設(shè)計(jì)為替換型載體。（一）完全基因敲除4編輯ppt基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制：有些重要的靶基因被敲除后會(huì)引起胚胎早期死亡，使得無(wú)法分析該基因在胚胎發(fā)育晚期和成年期的功能；某些基因在不同的細(xì)胞類型中執(zhí)行不同的功能，完全敲除會(huì)導(dǎo)致突變小鼠出現(xiàn)復(fù)雜的表型，使研究者很難判斷異常的表型是由一種細(xì)胞引起的，還是由幾種細(xì)胞共同引起的。

5編輯ppt（二）條件型基因敲除條件型基因敲除法可定義為將某個(gè)基因的敲除限制于小鼠某些特定類型的細(xì)胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。該系統(tǒng)在80年代被引入后，已成功被應(yīng)用于酵母菌、植物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞及小鼠身上?，F(xiàn)階段條件型基因敲除以噬菌體的Cre/Loxp系統(tǒng)和釀酒酵母的FLP/FRT系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。6編輯pptCre-LoxP重組酶系統(tǒng)

Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)在新型基因打靶中獲得廣泛應(yīng)用，是條件型基因打靶、誘導(dǎo)型基因打靶、時(shí)空特異性基因打靶策略的技術(shù)核心。7編輯pptCre-LoxP重組酶系統(tǒng)

Cre重組酶：于1981年從P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)，屬于λInt酶超基因家族。Cre重組酶基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)1029bp（EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)X03453），編碼38kDa蛋白質(zhì)。Cre重組酶是一種由343個(gè)氨基酸組成的單體蛋白。它不僅具有催化活性，而且與限制酶相似，能識(shí)別特異的DNA序列，即loxP位點(diǎn)，使loxP位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組。Cre重組酶有70%的重組效率，不借助任何輔助因子，可作用于多種結(jié)構(gòu)的DNA底物，如線形、環(huán)狀甚至超螺旋

DNA。8編輯pptCre-LoxP重組酶系統(tǒng)

LoxP（locusofX-overP1）序列：來(lái)源于P1噬菌體，是有兩個(gè)13bp反向重復(fù)序列和中間間隔的8bp序列共同組成，8bp的間隔序列同時(shí)也確定了LoxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過(guò)程中與DNA共價(jià)結(jié)合，13bp的反向重復(fù)序列是Cre酶的結(jié)合域。其序列如下：5'-ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT-3'3'-TATTGAAGCATAT-TACATACG-ATATGCTTCAATA-5'9編輯pptCre-LoxP系統(tǒng)的特性10編輯ppt條件性基因敲除法可定義為將某個(gè)基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細(xì)胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。它實(shí)際上是在常規(guī)的基因敲除的基礎(chǔ)上，利用重組酶Cre介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組技術(shù)，在對(duì)小鼠基因修飾的時(shí)空范圍上設(shè)置一個(gè)可調(diào)控的“按鈕”，從而使對(duì)小鼠基因組的修飾的范圍和時(shí)間處于一種可控狀態(tài)。11編輯ppt12編輯ppt13編輯pptCre/loxP系統(tǒng)作用原理示意圖14編輯pptFLP／FRT

系統(tǒng)該系統(tǒng)與Cre／loxP系統(tǒng)相同，也是由一個(gè)重組酶和一段特殊的DNA序列組成。從進(jìn)化的角度上考慮，F(xiàn)lp／FRT系統(tǒng)是Cre／loxP系統(tǒng)在真核細(xì)胞內(nèi)的同源系統(tǒng)。其中，重組酶Flp是酵母細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)由423個(gè)氨基酸組成的單體蛋白。與Cre相似，F(xiàn)lp發(fā)揮作用也不需要任何輔助因子，同時(shí)在不同的條件下具有良好的穩(wěn)定性。該系統(tǒng)的另一個(gè)成分Flp識(shí)別位點(diǎn)(Flprecognitiontarget，F(xiàn)RT)與loxP位點(diǎn)非常相似，同樣由兩個(gè)長(zhǎng)度為13bp的反向重復(fù)序列和一個(gè)長(zhǎng)度為8bp的核心序列構(gòu)成。在該系統(tǒng)發(fā)揮作用時(shí)，F(xiàn)RT位點(diǎn)的方向決定了目的片段的缺失還是倒轉(zhuǎn)。這兩個(gè)系統(tǒng)比較明顯的區(qū)別是它們發(fā)揮作用的最佳溫度不同，Cre重組酶發(fā)揮作用的最佳溫度為37℃，而Flp重組酶為30℃。因此，Cre／loxP系統(tǒng)最適宜在動(dòng)物體內(nèi)使用。loxP和FRT位點(diǎn)的序列如圖所示

15編輯ppt這一技術(shù)亦存在一些缺點(diǎn)：費(fèi)用太高周期較長(zhǎng)許多基因在剔除后并未產(chǎn)生明顯的表型改變，可能是這些基因的功能為其他基因代償所致條件型基因打靶的優(yōu)勢(shì)：克服了重要基因被敲除所導(dǎo)致的早期致死并能客觀、系統(tǒng)地研究基因在組織器官發(fā)生、發(fā)育以及疾病發(fā)生、治療過(guò)程中的作用和機(jī)制16編輯ppt（三）誘導(dǎo)型基因敲除誘導(dǎo)型基因敲除法也是利用Cre/Loxp系統(tǒng)為基礎(chǔ)，利用控制Cre表達(dá)的啟動(dòng)子的活性或所表達(dá)的Cre酶活性具有可誘導(dǎo)的特點(diǎn)，通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)劑給予時(shí)間的控制從而在動(dòng)物的一定發(fā)育階段和組織細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的敲除。17編輯ppt由Cre/Loxp系統(tǒng)和誘導(dǎo)系統(tǒng)兩個(gè)部分組成。Loxp轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是用常規(guī)基因打靶技術(shù)構(gòu)建成的，基因組中待修飾區(qū)域兩端各攜帶1個(gè)Loxp位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。誘導(dǎo)系統(tǒng)是指所攜帶的Cre基因的表達(dá)或所表達(dá)的Cre的酶活性具有可誘導(dǎo)性的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。人們可以通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)劑給予時(shí)間的預(yù)先設(shè)計(jì)來(lái)對(duì)動(dòng)物基因敲除的時(shí)空特異性進(jìn)行人為控制，以避免出現(xiàn)死胎或動(dòng)物出生后不久即死亡的現(xiàn)象。常見的幾種誘導(dǎo)型基因敲除類型有：四環(huán)素誘導(dǎo)型；干擾素誘導(dǎo)型；激素誘導(dǎo)型；腺病毒介導(dǎo)型。18編輯pptIII、基因編輯技術(shù)ZFN系統(tǒng)TALEN系統(tǒng)CRISPR/Cas系統(tǒng)19編輯ppt（一）ZFN技術(shù)系統(tǒng)20編輯pptZFN技術(shù)原理鋅指核酸酶（Zinc-fingernucleases,ZFN）是人工改造的限制性核酸內(nèi)切酶，利用不同的鋅指結(jié)構(gòu)識(shí)別特異DNA序列，利用核酸酶切斷靶DNA。鋅指結(jié)構(gòu)中每一個(gè)α螺旋可以特異識(shí)別3-4個(gè)堿基；人工設(shè)計(jì)識(shí)別特異DNA序列的α螺旋采用如上的通用序列，通過(guò)改變其中7個(gè)X來(lái)實(shí)現(xiàn)識(shí)別不同的三聯(lián)體堿基，TGEK是多個(gè)螺旋間的連接序列；構(gòu)建成對(duì)人工鋅指結(jié)構(gòu)域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定區(qū)域切斷DNA雙鏈。21編輯ppt單個(gè)ZFN的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域一般包含3-6個(gè)Cys2-His2鋅指結(jié)構(gòu)域，每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域能特異識(shí)別1個(gè)三聯(lián)體堿基，與鋅指蛋白相連接的非特異性核酸內(nèi)切酶來(lái)自FokI的C端96個(gè)氨基酸殘基組成的DNA剪切域，每個(gè)FokI單體與一個(gè)鋅指蛋白組相連構(gòu)成一個(gè)ZFN，識(shí)別特定的位點(diǎn)，但2個(gè)識(shí)別位點(diǎn)相距6-8bp距離時(shí)，2個(gè)單體ZFN相互作用產(chǎn)生酶切功能。在此特異位點(diǎn)產(chǎn)生1個(gè)DNA雙鏈切口，然后利用固有的同源重組或非同源末端連接修復(fù)機(jī)制進(jìn)行切口修復(fù)。從而達(dá)到對(duì)精確位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)修飾的目的。22編輯pptZFN技術(shù)鋅指核酸酶介導(dǎo)的定向染色體刪除研究人員可以利用ZFN技術(shù)進(jìn)行各種基因編輯，比如基因敲除。已建立有ZFN庫(kù)，識(shí)別多種DNA序列，但還不能達(dá)到識(shí)別任意靶DNA的目的，其應(yīng)用受到一定的限制。23編輯pptZFN技術(shù)已成功應(yīng)用于黑長(zhǎng)尾猴、大鼠、小鼠、中國(guó)倉(cāng)鼠、斑馬魚、果蠅、海膽、家蠶、擬南芥、煙草、玉米、豬、牛、人類iPS細(xì)胞等，此外，該技術(shù)已經(jīng)有用于治療HIV的ZFN藥物進(jìn)入二期臨床實(shí)驗(yàn)。但是，該技術(shù)制備復(fù)雜，成本昂貴，而且其技術(shù)專利被少數(shù)幾家商業(yè)公司控制。24編輯ppt（二）25編輯ppt嶄新的技術(shù)-TALEN經(jīng)典的挑戰(zhàn)–染色體DNA序列的人工編輯修改（點(diǎn)）突變：Silent；Missense；Nonsense；Frameshift（基因敲除，Knockout）片段刪除片段插入目的與用途：生物模型；表達(dá)工具；基因治療嶄新的技術(shù)解決經(jīng)典的挑戰(zhàn)26編輯ppt靶向基因技術(shù)經(jīng)典方法：自殺質(zhì)粒，同源重組–幾率低(~1HReventper106cells），難！飽含希望與失望的技術(shù)：ZFN，被Sigma公司壟斷新的里程碑：TALEN27編輯pptTALEN技術(shù)基于TALEN(transcriptionactivator-like(TAL)effectornucleases，類轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng)物核酸酶)的靶向基因敲除技術(shù)是一種嶄新的分子生物學(xué)工具，現(xiàn)已應(yīng)用于細(xì)胞、酵母、斑馬魚與大鼠等各類研究對(duì)象。技術(shù)原理：表達(dá)一個(gè)重組核酸酶，在靶點(diǎn)識(shí)別結(jié)構(gòu)域的作用下，核酸酶識(shí)別靶點(diǎn)核酸序列，并發(fā)揮內(nèi)切酶活性，從而打斷目標(biāo)基因，完成基因敲除的過(guò)程。28編輯ppt1989年植物病原體黃單胞菌屬（Xanthomonasspp.）

avrBs3基因被克隆。2007年發(fā)現(xiàn)其序列特異性核酸結(jié)合特性，avrBs3–TA2009年XanthomonasTA氨基酸序列與核酸靶序列的對(duì)應(yīng)關(guān)系被破譯由34個(gè)aa組成一個(gè)單元模塊，重復(fù)17-18次

34個(gè)aa中的第12和13個(gè)氨基酸（RepeatVariantDi-residue,RVD)對(duì)應(yīng)識(shí)別一個(gè)目標(biāo)堿基

TALEN發(fā)展過(guò)程29編輯ppt人工構(gòu)建TALE模塊識(shí)別指定核酸序列102堿基模塊單元……14–18個(gè)重復(fù)真核表達(dá)……14–18個(gè)重復(fù)特異識(shí)別指定的14-18個(gè)核酸序列并與之結(jié)合34氨基酸單元30編輯pptTALEN發(fā)展過(guò)程31編輯pptTALEN(TALE+FOKI)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)TALEN基因敲除X2TALEN表達(dá)質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)染、表達(dá)切割靶位點(diǎn)切割誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機(jī)制（nonhomologousend-joining，NHEJ）。由于在此修過(guò)程中總是有一定的錯(cuò)誤率存在。在修復(fù)中發(fā)生移碼突變錯(cuò)誤的個(gè)體即形成目標(biāo)基因敲除突變體32編輯pptTALEN介導(dǎo)的同源重組同源重組發(fā)生率升高幾個(gè)數(shù)量級(jí)DonorplasmidHRDonorplasmidLeftarmRightarmDonorplasmidLeftarmRightarm點(diǎn)突變片段刪除基因敲入33編輯ppt2011年8月，NatureBiotechnology上同時(shí)發(fā)表了用TALEN技術(shù)進(jìn)行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇綜述。一篇人類干細(xì)胞《GeneticengineeringofhumanpluripotentcellsusingTALEnucleases》

一篇大鼠《KnockoutratsgeneratedbyembryomicroinjectionofTALENs》

兩篇斑馬魚《TargetedgenedisruptioninsomaticzebrafishcellsusingengineeredTALENs》《HeritablegenetargetinginzebrafishusingcustomizedTALENs》

一篇綜述《MoveoverZFN》TALEN的最前沿34編輯pptTALEN靶向（基因敲除）技術(shù)

基本流程選擇、確定靶點(diǎn)2.TALE識(shí)別模塊串聯(lián)構(gòu)建3.TALEN真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建4.TALEN真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入（卵）細(xì)胞，表達(dá)TALEN重組蛋白5.檢測(cè)突變效率，篩選（移碼）突變體X2X2X235編輯ppt靶點(diǎn)的DNA序列特征：相隔17-18bp的兩段14-18bp序列作為靶點(diǎn)參考文獻(xiàn)：Cermaketal.,EfficientdesignandassemblyofcustomTALENandotherTALeffector-basedconstructsforDNAtargeting,NucleicAcidsResearch,2011,Vol.39,No.12,e82.在線靶點(diǎn)選擇設(shè)計(jì)軟件：/node/add/talef-off/選擇確定TALE靶點(diǎn)36編輯ppt

TAL的核酸識(shí)別單元為34aa模塊中的雙連氨基酸（RVD）

RVD與A、G、C、T有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，即NI識(shí)別A，NG識(shí)別T，HD識(shí)別C，NN識(shí)別G，非常簡(jiǎn)單明確欲使TALEN特異識(shí)別某一核酸序列（靶點(diǎn)），只須按照靶點(diǎn)序列將相應(yīng)TAL單元（14-18個(gè)）串聯(lián)克隆即可。TALE識(shí)別模塊串聯(lián)構(gòu)建37編輯ppt具專利保護(hù)的克隆構(gòu)建系統(tǒng)38編輯ppt具專利保護(hù)的克隆構(gòu)建系統(tǒng)步驟一：靶點(diǎn)識(shí)別單元串聯(lián)39編輯ppt步驟二：TALEN表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建具專利保護(hù)的克隆構(gòu)建系統(tǒng)40編輯ppt將靶點(diǎn)識(shí)別模塊克隆入真核表達(dá)載體，得到Talen質(zhì)粒對(duì)靶點(diǎn)識(shí)別模塊串接成功后需克隆入真核表達(dá)載體中。此真核表達(dá)載體含有TAL的其它必需結(jié)構(gòu)域并在C端融合有FokI序列。目前，TALEN系統(tǒng)利用FokI的內(nèi)切酶活性打斷目標(biāo)基因。因FokI需形成2聚體方能發(fā)揮活性，在實(shí)際操作中需在目標(biāo)基因中選擇兩處相鄰（間隔17堿基）的靶序列（14-18個(gè)堿基）分別進(jìn)行TAL識(shí)別模塊構(gòu)建。X2真核表達(dá)TALEN質(zhì)粒對(duì)41編輯ppt步驟三.將TALEN質(zhì)粒對(duì)共轉(zhuǎn)入細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)靶基因敲除TALEN質(zhì)粒對(duì)共轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，其表達(dá)的融合蛋白即可分別找到其DNA靶位點(diǎn)并與靶位點(diǎn)特異結(jié)合。此時(shí)，兩個(gè)TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，于兩個(gè)靶位點(diǎn)之間打斷目標(biāo)基因。FOKI內(nèi)切酶打斷靶點(diǎn)區(qū)42編輯ppt內(nèi)切酶的切割誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機(jī)制（nonhomologousend-joining，NHEJ）。由于在此修過(guò)程中總是有一定的錯(cuò)誤率存在。在修復(fù)中發(fā)生移碼突變錯(cuò)誤的個(gè)體即形成目標(biāo)基因敲除突變體。突變體形成43編輯pptPCR–酶切法利用靶點(diǎn)設(shè)計(jì)時(shí)挑選的，位于相鄰靶位點(diǎn)之間的特異性內(nèi)切酶位點(diǎn)，進(jìn)行PCR產(chǎn)物酶切鑒定。當(dāng)左右靶點(diǎn)之間沒有合適的酶切位點(diǎn)時(shí)可使用CEL-I核酸酶檢測(cè)。經(jīng)驗(yàn)規(guī)律：>=2%可用，>=10%很好TALEN切割效率檢測(cè)44編輯pptTALEN切割效率檢測(cè)啟動(dòng)子–ABCDEF–stop-Target

site-DEFHIJK啟動(dòng)子–ABCDEFHIJK共轉(zhuǎn)染熒光素酶檢測(cè)質(zhì)粒+TALEN質(zhì)粒1+TALEN質(zhì)粒2熒光素酶檢測(cè)法發(fā)光倍數(shù)與切割效率之間的定量關(guān)系尚缺乏充分研究。有文獻(xiàn)表明，發(fā)光倍數(shù)達(dá)1.5至2倍即可有效獲得突變體。45編輯ppt突變體篩選

有限稀釋法獲得單細(xì)胞克隆

PCR-酶切法鑒定

PCR測(cè)序確認(rèn)46編輯ppt基本工具質(zhì)粒14–18bp靶點(diǎn)序列怎樣做TALEN1單元模塊質(zhì)粒：A，G，C,T共4種2單元模塊質(zhì)粒：4X4=16種TALEN表達(dá)載體：基于PCS2質(zhì)粒2種47編輯ppt怎樣做TALEN康為TALEN定制質(zhì)粒產(chǎn)品1單元模塊質(zhì)粒A,G,C,T4種選擇2單元模塊質(zhì)粒共16種選擇pCS2TALEN真核表達(dá)載體TALEN空載體2種/套1+2單元模塊質(zhì)粒套裝4+16+2共22種質(zhì)粒/套多單元模塊質(zhì)粒20以下任意單元數(shù)目pCS2TALEN真核表達(dá)質(zhì)粒將指定TALEN模塊插入pCS2TALEN真核表達(dá)載體48編輯ppt怎樣做TALEN康為TALEN技術(shù)服務(wù)TALEN質(zhì)粒構(gòu)建提供兩個(gè)測(cè)序證明的14-18堿基TALEN識(shí)別域真核表達(dá)克隆(pCS2)。且以293T細(xì)胞系轉(zhuǎn)染，PCR酶切鑒定，灰度掃描定量證實(shí)突變效率高于10%TALEN靶向敲除細(xì)胞系構(gòu)建提供經(jīng)克隆測(cè)序證明的目標(biāo)基因移碼突變細(xì)胞系(雜合子）TALEN靶向敲除斑馬魚構(gòu)建提供目標(biāo)基因基因移碼突變F1斑馬魚（雜合子）49編輯pptTALEN技術(shù)成功率影響因素重組TALEN模塊與靶位點(diǎn)的‘親合力’靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)原則來(lái)自20個(gè)天然TLAE的統(tǒng)計(jì)規(guī)律細(xì)胞系固有特性K562容易，293中等，MC-10困難細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率不同，293高，HeLa低所期待的目標(biāo)Heterozygous？Homozygous？Exactpointmutation？Selectionmarkerinsertion？50編輯pptTALE技術(shù)應(yīng)用范圍細(xì)菌：尚無(wú)報(bào)道，已另有多種高效靶向技術(shù)。真菌：有報(bào)道，TALE原理可行。植物：TALE原理發(fā)現(xiàn)于植物，需特定轉(zhuǎn)基因技術(shù)。動(dòng)物細(xì)胞：TALE原理可行，各細(xì)胞系效率不一。斑馬魚：有TALEN基因敲除報(bào)道，尚無(wú)點(diǎn)突變與敲入報(bào)道。小鼠、大鼠……原理肯定可行，但尚無(wú)報(bào)道（技術(shù)太新，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物構(gòu)建實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)）。TALEN應(yīng)用擴(kuò)展的技術(shù)關(guān)鍵：切實(shí)可靠的表達(dá)系統(tǒng)。高效的轉(zhuǎn)基因及克隆篩選技術(shù)。51編輯pptTALEN的植物應(yīng)用TingLiet.al.High-efficiencyTALEN-basedgeneeditingproducesdiseaseresistantrice，

volume30number5may2012NatureBiotechnology

背景水稻病原菌Xanthomonasoryzaepv.oryzae(Xoo)導(dǎo)致細(xì)菌性白葉枯病。細(xì)菌天然TALEAvrXa7orPthXo3與水稻Os11N3基因啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控（hijack）此基因上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)糖份向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)，便于病原菌利用。策略以TALEN對(duì)細(xì)菌TALE靶點(diǎn)區(qū)做突變，使細(xì)菌TALE無(wú)法與水稻Os11N3基因啟動(dòng)子結(jié)合。

結(jié)果突變水稻獲得抵御細(xì)菌感染的能力52編輯pptTALEN與主要類同技術(shù)比較siRNA優(yōu)于TALEN可瞬時(shí)轉(zhuǎn)染快速觀察效果Knockdown效果確實(shí)，可用于必須基因遜于TALEN瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效果短暫不是徹底knockout慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)發(fā)生染色體隨機(jī)整合ZFN優(yōu)于TALEN經(jīng)驗(yàn)積累多，技術(shù)較成熟遜于TALEN技術(shù)復(fù)雜，難度高，被Sigma公司壟斷靶點(diǎn)序列要求高，難找Off-targeting現(xiàn)象嚴(yán)重經(jīng)常有顯著細(xì)胞毒性53編輯ppt基因組精密工程

今年來(lái)自梅奧醫(yī)學(xué)中心的研究人員第一次利用人工酶切割一段基因序列中的部分DNA，并用合成DNA取代它們，對(duì)斑馬魚基因組部分序列進(jìn)行了定制修改。這種技術(shù)稱為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALENs）方法，相比ZFNs和morpholinos，TALENs具有幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：它們更便宜、更有效，尤其是以一種開發(fā)活性形式應(yīng)用時(shí)。ZFNs只能靶向特異序列，而TALENs有潛力對(duì)任何的DNA序列起作用。Morpholinos的效應(yīng)是短暫的，而TALENs可造成永久性的改變。隨后科學(xué)家們?cè)隗蛤艿绕渌鼊?dòng)物中展開了這方面的研究，證明這種技術(shù)與已證實(shí)的基因靶向技術(shù)一樣有效。國(guó)內(nèi)清華大學(xué)的施一公和顏寧等人也于今年在Science雜志上報(bào)道了TALE特異識(shí)別DNA的分子機(jī)理，這提供了TALE蛋白的改造基礎(chǔ)，極大地拓寬了TALE蛋白在生物技術(shù)應(yīng)用上的前景。54編輯ppt2012年，TALEN被《科學(xué)》雜質(zhì)評(píng)為十大科學(xué)突破之一。55編輯ppt新技術(shù)介紹（三）CRISPR-Cas系統(tǒng)基因修飾技術(shù)Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)956編輯pptBiotechnology:RewritingagenomeNature

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(07March2013)

doi:10.1038/495050a57編輯ppt1CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)：1987年，日本大阪大學(xué)（OsakaUniversity）在對(duì)E.coliK12編碼的堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）基因進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)在這個(gè)基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，這些片段是由簡(jiǎn)單的重復(fù)序列組成的，而且在片段的兩端還存在一段不太長(zhǎng)的特有的序列。2002年，科學(xué)家將其正式命名為Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)。隨著基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)90%的古細(xì)菌、40%的細(xì)菌基因組中含有CRISPR位點(diǎn)。有的甚至含有2-3個(gè)位點(diǎn)。2013以后，研究者們?cè)诎ā秙cience》和《naturebiotechnology》等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹CRISPR-Cas系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實(shí)現(xiàn)精確的基因修飾。58編輯pptCRISPR-Cas主要由兩部分組成：識(shí)別切割2CRISPR-Cas系統(tǒng)的組成：CRISPR-Cas是很多細(xì)菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)入侵的病毒和核酸進(jìn)行特異性的識(shí)別，利用Cas蛋白進(jìn)行切割，從而達(dá)到對(duì)自身的免疫。59編輯ppt2.1CRISPR位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)CRISPR：（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）

CRISPR是一個(gè)特殊的DNA重復(fù)序列家族,廣泛分布于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。CRISPR位點(diǎn)由一個(gè)前導(dǎo)區(qū)（leader）、多個(gè)高度保守的重復(fù)序列（repeat）和多個(gè)間隔區(qū)（spacer）組成，重復(fù)序列的長(zhǎng)度通常21~48bp,間隔序列26~72bp(spacer)。重復(fù)序列具有二重對(duì)稱性，部分間區(qū)序列與某些已知的質(zhì)粒、噬菌體序列相匹配。CRISPR就是通過(guò)這些間隔序列（space）與靶基因進(jìn)行識(shí)別。60編輯ppt61編輯ppt2.2Cas家族Cas（CRISPRassociated）：

存在于CRISPR位點(diǎn)附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在guideRNA引導(dǎo)下對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。它與folk酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。62編輯ppt根據(jù)Cas基因核心元件序列的不同,CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)被分為3種類型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)需要多個(gè)Cas蛋白形成復(fù)合體切割DNA雙鏈,而Ⅱ型CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)只需要一個(gè)Cas9蛋白來(lái)切割DNA雙鏈,目前Ⅱ型系統(tǒng)是被改造的最為成功的人工核酸酶。63編輯pptCRISPR/Cas的基因座結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單。以產(chǎn)膿鏈球菌(StreptococcuspyogenesSF370)的典型TypeⅡCRISPR/Cas為例，其基因座結(jié)構(gòu)可分別三部分，5’端為tracrRNA基因，中間為一系列Cas蛋白編碼基因，包括Cas9、Cas1、Cas2和Csn2，3’端為CRISPR基因座，由啟動(dòng)子區(qū)域和眾多的間隔序列(spacers)和重復(fù)序列(directrepeats)順序排列組成。3.TypeⅡCRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理64編輯pptcrRNAs：CRISPR位點(diǎn)的第一個(gè)重復(fù)序列上游有CRISPR前導(dǎo)序列(Leadersequence),該前導(dǎo)序列可以作為啟動(dòng)子,啟動(dòng)CRISPR序列的轉(zhuǎn)錄。多個(gè)研究表明CRISPR基因座首先被轉(zhuǎn)錄成前體CRISPRRNA(pre-crRNA)，然后在Cas蛋白或是核酸內(nèi)切酶的作用下被剪切成一些小的RNA單元，這些小RNA即為成熟crRNA，由一個(gè)間隔序列和部分重復(fù)序列組成，被命名為CRISPRRNAs(crRNAs),

這些crRNA和Cas蛋白共同參與CRISPR免疫防御過(guò)程。65編輯ppttracrRNA：他們發(fā)現(xiàn)tracrRNA

(trans-activatingcrRNA)對(duì)靶點(diǎn)的識(shí)別和切割是必需的，tracrRNA的5’端與成熟的crRNA3’端有部分序列(約13bp)能夠配對(duì)進(jìn)而形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，對(duì)維持crRNA與靶點(diǎn)的配對(duì)可能十分重要。其指導(dǎo)RNaseⅢ和Cas9完成前體crRNA的成熟，隨后tracrRNA還能與成熟的crRNA的重復(fù)序列配對(duì)形成RNA二聚體，進(jìn)而和Cas9蛋白結(jié)合成核糖核蛋白復(fù)合體，發(fā)揮識(shí)別和降解入侵的外源DNA功能。根據(jù)tracrRNA與crRNA的結(jié)構(gòu)特性，他們將tracrRNA和crRNA表達(dá)為一條嵌合的向?qū)NA(guideRNA，gRNA)，并在體外證明gRNA可以發(fā)揮tracrRNA和crRNA的功能，在目的基因處切割,形成DSBs,該過(guò)程是CRISPR/Cas對(duì)基因組進(jìn)行編輯的基礎(chǔ)。66編輯ppt67編輯pptCas9：體外實(shí)驗(yàn)證明Cas9基因是參與CRISPR免疫系統(tǒng)的唯一必需基因,Cas9是由1409個(gè)氨基酸組成的多結(jié)構(gòu)域蛋白,含有2個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域：氨基端的RuvC-like結(jié)構(gòu)域及位于蛋白中間位置的HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域,HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域可以切割與crRNA互補(bǔ)配對(duì)的模板鏈,切割位點(diǎn)位于原型間隔序列毗鄰基序(Protospaceradjacentmotif,PAM)上游3nt處,RuvC-like結(jié)構(gòu)域可以對(duì)另一條鏈進(jìn)行切割,切割位點(diǎn)位于PAM上游3~8nt處。在crRNA與tracrRNA形成的雙鏈RNA的指導(dǎo)下,Cas9蛋白對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。此外，他們還證明，將RuvC或是HNH活性突變后Cas9只有單鏈切割活性，類似于切口酶。68編輯ppt到目前為止,雖然CRISPR/Cas系統(tǒng)的詳細(xì)作用機(jī)制尚未完全闡明,但已基本明確了該作用機(jī)制的整個(gè)過(guò)程,該過(guò)程大體分為3個(gè)階段：1.在噬菌體入侵的起始階段,Cas蛋白復(fù)合物靶向并裂解噬菌體基因組中的原型間隔序列(protospacer),protospacer接下來(lái)整合到宿主基因組的CRISPR位點(diǎn)的5′端;2.然后這些短的摻入的protospacer被轉(zhuǎn)錄成crRNA;3.最后階段是在Cas蛋白復(fù)合物的參與下,靶向和干擾侵入的噬菌體DNA序列。當(dāng)同種噬菌體再次入侵時(shí),CRISPR的repeats序列截取和保留的入侵噬菌體的某些DNA片段形成spacers,spacers會(huì)轉(zhuǎn)錄形成一些小的crRNA,這些crRNA會(huì)與trans-activatingcrRNA(tracrRNA)形成一種雙鏈二級(jí)結(jié)構(gòu),以此招募Cas蛋白,crRNA、tracrRNA以及Cas蛋白形成復(fù)合體,識(shí)別緊隨protospacer序列后的PAM序列,Cas蛋白的核酸酶結(jié)構(gòu)域?qū)εccrRNA互補(bǔ)的雙鏈DNA進(jìn)行切割,從而使細(xì)菌具有對(duì)抗同類噬菌體再次入侵的能力。CRISPR基因座在沒有受到外界壓力的情況下表達(dá)水平很低，當(dāng)外源的質(zhì)?；蚴鞘删w入侵宿主菌時(shí)CRISPR的表達(dá)很快被誘導(dǎo)上調(diào)。69編輯ppt70編輯ppt71編輯ppt72編輯ppt73編輯ppt噬菌體或是質(zhì)粒上與間隔序列對(duì)應(yīng)的序列被稱為protospacer，通常protospacer的5’或是3’端延伸幾個(gè)堿基序列很保守，被稱為PAM(protospaceradjacentmotifs)，它的長(zhǎng)度一般為2～5堿基，一般與protospacer相隔1～4堿基。新間隔序列的獲得可能分為三步：首先識(shí)別入侵的核酸和掃描外源DNA潛在的PAM，將臨近PAM的序列作為候選protospacer；然后在CRISPR基因座的5’端合成重復(fù)序列；最后新的間隔序列整合到兩個(gè)重復(fù)序列之間。74編輯ppt75編輯ppt4.CRISPR/Cas系統(tǒng)的應(yīng)用CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用特性與限制性核酸內(nèi)切酶相似，它對(duì)序列的特異性切割主要依賴于crRNA與Cas蛋白形成的核糖核蛋白復(fù)合物識(shí)別靶序列上的PAM以及protospacer。根據(jù)CRISPR/Cas系統(tǒng)這一特性，將其用于設(shè)計(jì)人工的核酸內(nèi)切酶(engineeredendonuclease，EEN)，用來(lái)對(duì)我們感興趣的基因位點(diǎn)進(jìn)行修飾．三類CRISPR/Cas系統(tǒng)中TypeⅡ型系統(tǒng)的核糖核蛋白復(fù)合物相對(duì)簡(jiǎn)單，除crRNA和tracrRNA外，只有Cas9一個(gè)蛋白．目前，產(chǎn)膿鏈球菌(StreptococcuspyogenesSF370)的TypeⅡ型系統(tǒng)是被改造的最為成功的人工核酸內(nèi)切酶，已經(jīng)在人類細(xì)胞、小鼠、斑馬魚中成功實(shí)現(xiàn)了基因組定點(diǎn)修飾。76編輯ppt77編輯ppt4.1CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求最主要的要求：PAM（protospacer-adjacentmotif）為NGG。78編輯ppt

在人類基因組中，平均每8bp就出現(xiàn)一個(gè)NGGPAM。79編輯ppt80編輯ppt4.2Cas介導(dǎo)編輯模板替換2013年1月29日在《naturebiotechnology》上發(fā)表的《RNA-guidededitingofbacterialgenomesusingCRISPR-Cassystems》一文中，作者利用CRISPR-Cas系統(tǒng)用設(shè)計(jì)好的DNA模板替換的相應(yīng)基因來(lái)達(dá)到基因的定向修飾。81編輯ppt82編輯ppt4.3Cas介導(dǎo)基因修飾2013年1月29日在《naturebiotechnology》上發(fā)表的《efficientgenomeeditinginzebrafishusingaCRISPR-Cassystem》一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指導(dǎo)Cas9內(nèi)源性核酸酶對(duì)斑馬魚胚胎基因進(jìn)行修飾。83編輯ppt84編輯ppt85編輯pptCas9sg-RNA86編輯ppt2013年2月15日在《science》上發(fā)表的《MultiplexGenomeEngineeringUsingCRISPR/CasSystems》一文中，作者利用一個(gè)包含兩個(gè)靶向不同基因的spacers的crRNA實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行編輯。4.4Cas介導(dǎo)雙基因修飾

87編輯ppt88編輯ppt5CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析

這是一項(xiàng)靶向基因修飾的革新技術(shù)，一項(xiàng)極具有可能獲得諾貝爾獎(jiǎng)技術(shù)。89編輯ppt2013年4月12日在《cellstemcell》上發(fā)表的《EnhancedEfficiencyofHumanPluripotentStemCellGenomeEditingthroughReplacingTALENswithCRISPRs》一文中，作者利用TALENs和CRISPRs對(duì)同一基因進(jìn)行修飾，效率分別為0%-34%和51%-79%。90編輯ppt

而且從實(shí)際應(yīng)用的角度來(lái)說(shuō)，CRISPRs比TALENs更容易操作，因?yàn)槊恳粚?duì)TALENs都需要重新合成