肉毒梭狀芽孢桿菌檢測

肉毒梭狀芽孢桿菌檢測第1頁/共19頁梭狀芽孢桿菌梭狀芽孢桿菌屬的成員在自然界中是一種非常獨特的種類，當其進入到反芻動物體內時，常會引起肌肉和軟組織感染、腸道疾病和神經中毒性疾病。梭狀芽孢桿菌引起反芻動物發(fā)病的機理通常是間接地通過其產生的一種或多種毒素（毒蛋白質）來致病。第2頁/共19頁梭狀芽孢桿菌在不同細菌中，芽孢所處的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有的在頂端。芽孢一般呈圓形、橢圓形、圓柱形。第3頁/共19頁梭狀芽孢桿菌在有些細菌中，芽孢的直徑小于菌體直徑，這些細菌稱為芽孢桿菌，為好氧細菌；在另一些細菌中，芽孢的直徑大于菌體直徑，使整個菌體呈梭形或鼓塑形，這些細菌稱為梭狀芽孢桿菌，為厭氧菌。第4頁/共19頁肉毒毒素肉毒毒素（botulinumtoxin，AX）是肉毒桿菌產生的含有高分子蛋白的神經毒素，是目前已知在天然毒素和合成毒劑中毒性最強烈的生物毒素，它主要抑制神經末梢釋放乙酰膽堿，引起肌肉松弛麻痹，特別是呼吸肌麻痹是致死的主要原因。第5頁/共19頁化學結構與理化性質

從1964年由肉毒桿菌中分離出毒素結晶至今已獲得七種（A，B，C，D，E，F和G）類型的毒素，能引起人員中毒的主要是A、B和E型毒素，其中以A型軍用意義最大，A型結晶毒素是由19種氨基酸組成的單一蛋白質，分子量為90～120萬，化學結構目前尚不清楚。肉毒毒素通常是由神經毒素和血凝素組成的復合形式存在。A型肉毒毒素的純品是一種白色晶體粉末，易溶于水，但穩(wěn)定性較差。受熱、機械力和氧的作用而降解。粉末狀的毒素可長期貯存而不失活性，肉毒毒素染毒的食物和水源，一般其毒性可保持數天乃至一周，肉毒毒素不被胃腸液所破壞，易經消化道中毒。第6頁/共19頁中毒途徑與毒性

A型肉毒毒素的氣溶膠對人吸入的致死量為0.3μg，LCt50為0.1～0.5mg·min/m3，靜脈注射致死量為0.15～0.3μg，口服致死劑量為8～10μg，該毒素對小鼠的毒性LD50值約為3×10–5~3×10–4μg。野外試驗表明，由于大規(guī)模施放方法尚未解決，肉毒毒素通過呼吸道中毒的致死效應，并不比等量神經性毒劑大。當前以污染食物和水源通過消化道染毒為其主要的中毒途徑。另據報道，美軍利用肉毒毒素污染小型武器的彈頭，以增強殺傷效應，現已生產這種武器。平時主要是攝入被肉毒毒素污染的肉類和罐頭等食品而中毒，死亡率大約為25～50％。第7頁/共19頁中毒機理

業(yè)已闡明，在體內肉毒毒素特異性的與膽堿能神經末梢突觸前膜的表面受體相結合，然后由于吸附性胞飲而內轉進入細胞內稱為毒素的內轉（internalization），使囊泡不能再與突觸前膜融合，從而有效地阻抑了膽堿能神經介質——乙酰膽堿的釋放。與此同時，毒素與突觸前膜結合，還阻塞了神經細胞膜的鈣離子通道，從而干擾了細胞外鈣離于進入神經細胞內以觸發(fā)胞吐和釋放乙酰膽堿的能力。乙酰膽堿釋放的抑制，有效地阻斷了膽堿能神經傳導的生理功能，尤其是神經一肌肉接頭部位特別敏感，引起全身隨意肌松弛麻痹，呼吸肌麻痹是致死的主要原因。第8頁/共19頁臨床表現

肉毒毒素經消化道吸收中毒，一般經過12～72小時的潛伏期，開始出現全身中毒癥狀。早期癥狀有惡心、嘔吐及腹瀉等，繼之出現頭痛、頭昏、眩暈、軟弱無力，中毒的重要特征為視力紊亂：復視、斜視、瞳孔散大、視力模糊，同時伴有眼球震顫，這是眼內外肌麻痹的結果。嚴重病人有吞噬、咀嚼、語言、呼吸等困難，排痰及抬頭困難，共濟失調等，神志清楚。癥狀繼續(xù)發(fā)展則出現進行性呼吸困難，全身肌肉松弛性麻痹。繼則脈搏加快，血壓下降，短時間抽搐，意識喪失，最終因呼吸衰竭、心力衰竭或繼發(fā)肺炎等而死亡。通過呼吸道吸入中毒，一般癥狀發(fā)展迅速且嚴重。其他途徑中毒的臨床癥狀，因毒劑的劑量不同而異。病人恢復較緩慢，視覺障礙恢復特慢，有時需數月之久。第9頁/共19頁肉毒梭狀芽孢桿菌肉毒梭狀芽孢桿菌（Clostridiumbotulinum）是可形成芽孢、無莢膜、有鞭毛的革蘭氏陽性桿菌，可產生對人和動物具有強大毒性的外毒素肉毒毒素?？煞譃锳，B，C（α，β），D，E，F和G7個血清型，對人具有不同程度的致病力。肉毒毒素受高溫、堿性條件、日光直射時均可被破壞而不穩(wěn)定，但在酸性條件下較穩(wěn)定。引起的中毒是毒素型中毒，毒素作用于中樞神經系統(tǒng)的顱神經核，抑制乙酸膽堿的釋放，引起肌肉麻痹。在厭氧的土壤、江河湖海的淤泥沉積物、塵土和動物糞便中有廣泛存在，易污染蔬菜、魚類、肉類、豆類等蛋白質豐富的食品。第10頁/共19頁肉毒梭狀芽孢桿菌肉毒梭狀芽孢桿菌為厭氧性革蘭氏陽性桿菌，罐裝食品中引起腐敗的主要菌種，解糖嗜熱梭狀芽孢桿菌（Cl.thermosaccharolyticum）可分解糖類引起罐裝水果、蔬菜等食品的產氣性變質。腐敗梭狀芽孢桿菌（Cl.putrefaciens）可以引起蛋白質食物的變質。肉類罐裝食品中最重要的是肉毒梭狀芽孢桿菌（Cl.botulinum）,其芽孢產生在菌體的中央或極端，芽孢耐熱性極大，能產生很強的毒素。第11頁/共19頁檢驗所需器材庖肉培養(yǎng)基、卵黃瓊脂培養(yǎng)基、明膠磷酸鹽緩沖液、肉毒分型抗毒診斷血清、胰酶、革蘭氏染色液等。第12頁/共19頁檢驗所需器材離心機及離心管、研缽及細砂、培養(yǎng)箱、顯微鏡、厭氧培養(yǎng)裝置、1ml和10ml吸管、1ml注射器、平皿、接種環(huán)、載玻片、小白鼠等。第13頁/共19頁肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗程序第14頁/共19頁肉毒毒素檢測操作方法

檢樣制備檢出試驗確證試驗毒力測定定型試驗第15頁/共19頁肉毒梭菌檢驗操作方法樣品處理增菌培養(yǎng)分離培養(yǎng)第16頁/共19頁注意事項典型的肉毒中毒，小白鼠會在4~6小時內死亡，而且98%~99%的小白鼠會在12小時內死亡，因此，試驗前24小時內的觀察是非常重要的。24小時后的死亡是可疑的，除非有典型的癥狀出現。如果小白鼠注射1：2或1：5倍數的稀釋樣品后死亡，但注射更高稀釋度的樣品后未死亡，這也是費城可以的現象，一般為非特異性死亡。小白鼠