物理圖譜課件

第三章物理圖繪制§3.1概述§3.2限制性作圖

§3.3熒光原位雜交§3.4序列標(biāo)記位點(diǎn)作圖§3.5克隆作圖§3.6遺傳圖與物理圖的整合§3Physicalmapping§3.1概述為什么要進(jìn)行物理作圖？遺傳學(xué)圖譜分辨率有限遺傳學(xué)圖的分辨率依賴于得到的交換的數(shù)目。對(duì)于人類與大多數(shù)真核生物來說，巨大數(shù)量的后代不易獲得。遺傳學(xué)圖譜精確度有限釀酒酵母chr3遺傳圖與物理圖的比較§3Physicalmapping§3.1概述結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的發(fā)展：

遺傳作圖

物理作圖

基因組測序物理作圖的主要方法限制性作圖（restrictionmapping)熒光原位雜交（fluorescenthybridization,FISH)序列標(biāo)簽位點(diǎn)（STS)作圖（sequencetaggedsitesmapping)§3Physicalmapping§3.1概述限制性作圖

定義：將限制性酶切位點(diǎn)標(biāo)定在DNA分子的相對(duì)位置。局限性：只能應(yīng)用于相對(duì)較小的DNA分子?！?Physicalmapping§3.2限制酶作圖限制性作圖的基本原理比較一種DNA分子被不同限制性內(nèi)切酶切割所產(chǎn)生的片段大小。首先用一種酶處理樣品后，電泳確定DNA片段的大小。然后用第二種酶處理，獲得第二組片段。最后用兩種酶混合處理，獲得第三組片段。收集上述資料進(jìn)行對(duì)比組裝。兩種酶切位點(diǎn)交替出現(xiàn)的區(qū)段用加減法確定其的相對(duì)位置。連續(xù)出現(xiàn)2個(gè)或多個(gè)相同酶切位點(diǎn)的區(qū)段，采用部分酶解法。切點(diǎn)過多時(shí)可以采用末端同位素標(biāo)記結(jié)合部分酶解進(jìn)行繪圖?！?Physicalmapping§3.2限制酶作圖限制性作圖的規(guī)模受限于限制性片段的大小限制性片段越大，切點(diǎn)越多，需要比較的片段也會(huì)增加，而且當(dāng)片段多到一定程度，一些大小相似的片段會(huì)重疊在一起，不可能組成一個(gè)清晰的圖譜。因此，限制性作圖更適合于小分子。實(shí)際應(yīng)用中如果DNA分子小于50kb，通?？梢赃x用識(shí)別6個(gè)核苷酸序列的限制酶來建立清晰的限制性圖譜?！?Physicalmapping§3.2限制酶作圖§3Physicalmapping§3.2限制酶作圖大于50kb的基因組能否用限制性作圖？答案是肯定的。通過選擇靶DNA分子中的稀有酶切位點(diǎn)酶可以克服限制性酶切作圖的局限性。稀有切點(diǎn)內(nèi)切酶:在基因組DNA順序中只有很少可識(shí)別序列的限制酶,一般識(shí)別位點(diǎn)在6-8堿基對(duì)之間,并含有高G/C比。稀有切點(diǎn)限制酶分為兩大類：識(shí)別具有7或8個(gè)核苷酸序列的酶；識(shí)別序列包含靶DNA稀少基序的酶。稀有切點(diǎn)限制酶在物理作圖中的應(yīng)用低等生物基因組物理作圖大分子DNA克隆片段的物理作圖§3Physicalmapping§3.2限制酶作圖§3Physicalmapping§3.2限制酶作圖選用稀有切點(diǎn)限制酶酶切大片段DNA預(yù)測稀有切點(diǎn)限制性內(nèi)切酶酶切片段大小1)根據(jù)稀有酶切位點(diǎn)限制酶識(shí)別堿基數(shù)推測產(chǎn)生的DNA片段長段:

NotI酶:GC/GGCCGC48=74536bp=75kb

I-SceI酶:TAGGGATAA/CAGGGTAAT418=90000000bp=90000kb2)由于多細(xì)胞真核生物基因組DNA存在大量的甲基化位點(diǎn),識(shí)別CG序列的稀有酶切點(diǎn)限制酶實(shí)際產(chǎn)生的DNA片段比預(yù)期大得多.如NotI酶切人類基因組DNA產(chǎn)生的片段常在200kb以上，平均長度達(dá)到1Mb。PFGE的基本原理將一個(gè)方向不斷變換的電場，取代簡單的單一電場（單向電場，使電泳中受阻的DNA分子在電場改變時(shí)扭轉(zhuǎn)遷移方向，較小的分子比較大的分子重新排列的快，以此達(dá)到分離的目的。分辨率達(dá)到10Mb。大片段DNA的分離技術(shù)——脈沖凝膠電泳§3Physicalmapping§3.2限制酶作圖大腸桿菌基因組物理圖§3Physicalmapping§3.2限制酶作圖DNA分子限制性位點(diǎn)的直接檢測—光學(xué)作圖光學(xué)作圖：直接在顯微鏡下觀察檢測限制性酶切位點(diǎn)。凝膠拉伸：將染色體DNA懸浮于融化的瓊脂糖中，然后滴加到用限制酶包被的顯微載波片上，當(dāng)凝膠冷卻時(shí)DNA分子呈伸展?fàn)顟B(tài)。然后用加入氯化鎂激活限制酶，切割DNA分子，同時(shí)加入熒光染料使DNA分子染色，延伸的分子中的限制性酶切位點(diǎn)就逐漸形成缺口，可用高分辨率的熒光顯微鏡檢測到。分子梳理：將硅膠樹脂包被的蓋玻片浸入DNA溶液中，保留5分鐘，使DNA分子的末端黏附于蓋玻片上，然后以0.3mm/s的速度移動(dòng)玻片，使DNA分子整齊排列在蓋玻片表面，然后再加入限制性酶和熒光染料，就可以在熒光顯微鏡下檢測到酶切的缺口。耐輻射球菌(Deinococcusradiodurans)

基因組NheI酶切圖§3Physicalmapping§3.3熒光原位雜交熒光原位雜交（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）指在染色體上進(jìn)行DNA雜交，以便識(shí)別熒光標(biāo)記探針在染色體上位置的方法。

原位雜交的操作

染色體分裂細(xì)胞染色體變性檢測信號(hào)早期的原位雜交用的標(biāo)記是放射性標(biāo)記，但放射性標(biāo)記很難同時(shí)滿足靈敏度和分辨率兩個(gè)原位雜交的必要條件。20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的熒光標(biāo)記解決了這一矛盾。為了得到高靈敏度，探針的標(biāo)記量要盡可能大一些，以往的探針至少40kb?，F(xiàn)在由于強(qiáng)信號(hào)熒光物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和重標(biāo)記技術(shù)的發(fā)明，對(duì)探針長度的要求已經(jīng)不那么嚴(yán)格了?！?Physicalmapping§3.3熒光原位雜交甲酰胺處理加入探針如何提高熒光原位雜交的分辨率？原位雜交的分辨率與染色體的制備有關(guān)：中期染色體分辨率1000kb，主要用于發(fā)現(xiàn)新的分子標(biāo)記屬于哪條染色體；機(jī)械伸展的中期染色體分辨率200—300kb；非中期染色體分辨率可達(dá)到25kb以下。用特殊技術(shù)制備的純化DNA可以進(jìn)行纖維-FISH，分辨率可達(dá)到10kb以下?！?Physicalmapping§3.3熒光原位雜交

§3Physicalmapping§3.4序列標(biāo)記位點(diǎn)作圖序列標(biāo)記位點(diǎn)作圖—大基因組物理圖主流構(gòu)建技術(shù)限制性酶切作圖和FISH的優(yōu)缺點(diǎn)限制性酶切作圖快速、簡便，能提供詳細(xì)定位信息，但不能用于大基因組。FISH可以用于大基因組，但難于操作，數(shù)據(jù)積累慢，一次實(shí)驗(yàn)定位的標(biāo)記不超過3-4個(gè)?！?Physicalmapping§3.4序列標(biāo)記位點(diǎn)作圖STS作圖原理圖示(1)STS作圖原理圖示(2)§3Physicalmapping§3.4序列標(biāo)記位點(diǎn)作圖

STS需要具備的兩個(gè)條件：1）在染色體上的位置獨(dú)一無二；2）序列已知，方便PCR檢測。

尋找STS的方法：1）表達(dá)序列標(biāo)簽（expressedsequencetag,ETS)：來源于cDNA克隆的小段序列。EST來自單拷貝的基因時(shí)可作為STS；2）SSLP具有多態(tài)性且通過連鎖分析進(jìn)行定位的SSLP很有價(jià)值，可以建立遺傳圖與物理圖之間的聯(lián)系；3）隨機(jī)基因組順序?？赏ㄟ^對(duì)克隆的基因組DNA隨機(jī)測序獲得，或者從數(shù)據(jù)庫中尋找。STS作圖的DNA片段群作圖試劑（mappingreagent)：STS作圖過程中用到的可覆蓋待研究的染色體或基因組的DNA片段群。如何獲得作圖試劑？1）放射雜交2）克隆文庫§3Physicalmapping§3.4序列標(biāo)記位點(diǎn)作圖1）放射雜交輻射雜種（radiationhybrid)：含有其他生物染色體片段的嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞。輻射雜種群（radiationhybridpanel)：通過放射雜交產(chǎn)生的融合細(xì)胞群稱為輻射雜種群。輻射雜種群分為兩類：全基因組輻射雜種群單染色體輻射雜種群染色體片段化染色體輻射雜種X射線照射細(xì)胞融合全基因組輻射雜種的篩選使用不能產(chǎn)生胸腺激酶（TK)或者次黃嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPRT)的倉鼠細(xì)胞系作受體。這種細(xì)胞在添加了次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培養(yǎng)基（HAT）中不能存活。只有獲得人體DNA中TK和HPRT基因的倉鼠細(xì)胞才能在HAT選擇性培養(yǎng)基中生長。

輻射雜種作圖單染色體輻射雜種群§3Physicalmapping§3.4序列標(biāo)記位點(diǎn)作圖構(gòu)建：用x射線照射另外一類含一條人染色體的嚙齒類（如小鼠）細(xì)胞系，再將這種細(xì)胞與倉鼠細(xì)胞融合。篩選：用人類基因組廣泛分布的重復(fù)序列如Alu（一類SINE)做探針，篩選只含有人染色體片段的雜種細(xì)胞。輻射雜種群用于作圖試劑的條件

§3Physicalmapping§3.4序列標(biāo)記位點(diǎn)作圖使用PCR方法鑒定STS時(shí)，不會(huì)從倉鼠基因組或者小鼠基因組擴(kuò)增出相應(yīng)的片段。輻射雜種作圖的單位厘鐳（centiRay,cM)：DNA分子暴露在N拉德x射線劑量下，兩個(gè)分子標(biāo)記之間發(fā)生1%段裂的頻率。人類21號(hào)染色體輻射雜種圖一段人類染色體DNA的輻射雜種圖人類基因組輻射雜種圖距染色體物理長度（Mb）cM/cRkb/cR平均滯留率（范圍）————————————————————————————————

12630.2019721.1(14.3-50.6)22550.2122523.8(14.3-37.5)32140.2723326.9(14.3-41.1)42030.2825624.3(11.3-44.0)51940.2927226.9(17.3-49.4)61830.2424330.6(21.4-49.4)71710.2322927.7(19.0-44.6)81550.2627131.0(31.0-45.8)91450.3830522.1(14.3-27.4)101440.2625328.5(16.2-56.3)111440.3027025.7(20.2-38.7)121430.2123432.1(23.2-50.6)13q980.2217922.9(16.7-36.3)14q930.3420832.0(21.1-57.1)15q890.3620331.7(24.4-45.2)16980.4320130.5(21.6-39.9)17920.2314761.6(33.9-93.5)18850.3017234.3(20.7-43.5)19670.2011032.2(21.4-45.8)20720.3019131.0(16.1-41.1)21q390.3115150.1(39.3-71.3)22q430.9518536.6(30.4-50.6)X1640.3123118.4(11.9-30.4)基因組31540.2820829.2(11.3-93.5)2）克隆文庫克隆文庫：將基因組或分離的染色體斷裂成片段，克隆到高容量載體中所產(chǎn)生的DNA片段的集合?？寺∥膸霺TS作圖的優(yōu)勢：單獨(dú)的克隆就可以提供測序的DNA，來自STS分析的數(shù)據(jù)可用來構(gòu)建物理圖譜，也可以確定含有重疊DNA片段的克隆，這就可以幫助我們建立克隆重疊群?！?Physicalmapping§3.4序列標(biāo)記位點(diǎn)作圖繪制物理圖的克隆文庫全基因組DNA文庫單一染色體DNA文庫§3Physicalmapping§3.4序列標(biāo)記位點(diǎn)作圖流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀工作原理

YAC載體:YAC(Yeastartificialchromosome)即酵母人工染色體，具有酵母染色體的特性，以酵母細(xì)胞為宿主，能在酵母細(xì)胞中復(fù)制。以YAC為載體，可以乘載1.4Mb的大片段DNA，是物理作圖中最早利用的大片段DNA載體。優(yōu)點(diǎn):容量大,插入片段可達(dá)1400kb.缺點(diǎn):轉(zhuǎn)化效率低；插入子穩(wěn)定性差；嵌合克隆比例高,達(dá)48%；插入DNA的制備相當(dāng)困難。§3Physicalmapping§3.5克隆作圖構(gòu)建圖譜的載體與方法克隆作圖：根據(jù)克隆的DNA片段之間的重疊順序構(gòu)建重疊群(Contig),繪制物理連鎖圖。酵

母

人

工

染

色

體

(YAC)BAC載體:BAC(Bacterialartificialchromosome)即細(xì)菌人工染色體，具有細(xì)菌染色體的特性，以細(xì)菌細(xì)胞為宿主，能在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制。以BAC為載體，可以乘載約300kb的大片段DNA，是物理作圖中目前用得最多的大片段DNA載體。優(yōu)點(diǎn)：單拷貝復(fù)制，不會(huì)因重組發(fā)生嵌合；插入DNA的提取簡單，便于機(jī)械化操作。細(xì)

菌

人

工

染

色

體（BAC）PAC載體：PAC（P1-derived

artificial

chromosome

)P1人工染色體插入的外源DNA

沒有明顯的嵌合和缺失象；可以插入約300kb

的外源片段；可以穩(wěn)定遺傳及高效擴(kuò)增。PAC

除具有許多BAC

載體的特征外,它的多克隆位點(diǎn)位于蔗糖誘導(dǎo)型致死基因sacB

上,通過加入蔗糖和抗生素的培養(yǎng)基篩選出來的克隆都是含有插入片段的重組子。但是,PAC

載體自身片段較大(約16kb)

,構(gòu)建文庫沒有BAC

載體(約7～8kb)

效率高。PAC載

體染色體步移法（chromosomalwalking)指紋法(clonefingerprinting)§3Physicalmapping§3.5克隆作圖克隆重疊群的組建染色體步移法

先從基因文庫的一個(gè)克隆開始，然后從文庫中尋找與之重疊的第二個(gè)克隆，再繼續(xù)確定第三個(gè)克隆，依次類推。這是最早發(fā)明的拼接克隆重疊群的方法。如果探針含有基因組范圍分布的重復(fù)序列，會(huì)有非特異雜交，這時(shí)需要預(yù)雜交，封閉非特異位點(diǎn)。以插入片段末端為探針，減少重復(fù)序列出現(xiàn)的可能性。如果探針序列已知，可以通過PCR篩選。染色體步移的缺點(diǎn)是速度緩慢，只適合小基因組或小區(qū)段染色體物理圖繪制。染色體步移用探針進(jìn)行染色體步查用PCR進(jìn)行染色體步查克隆指紋法的原理：如果2個(gè)克隆彼此重疊，它們一定含有相同的順序?；蚪M范圍內(nèi)查找重疊克隆的最好方法首推克隆指紋排序。指紋：指確定DNA樣品所具有的特定DNA片段組成，一個(gè)克隆的指紋表示了該克隆所具有的指定序列的特征，可以同其他克隆產(chǎn)生的同類指紋比較。§3Physicalmapping§3.5克隆作圖指紋法限制性帶型指紋定義：用不同限制性酶消化后，經(jīng)凝膠分離產(chǎn)生的條帶。重復(fù)順序DNA指紋定義：將不同克隆的限制性片段電泳轉(zhuǎn)膜后，與基因組范圍分布的重復(fù)序列雜交形成的帶型。重復(fù)順序DNAPCR或分散重復(fù)順序PCR定義：用基因組范圍的重復(fù)序列的互補(bǔ)序列做引物，擴(kuò)增兩個(gè)重復(fù)序列之間的單一順序，得到的產(chǎn)物帶型。STS目錄作圖定義：根據(jù)STS序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增文庫當(dāng)中的克隆，能擴(kuò)出條帶的克隆都含有順序重疊的插入子。 YAC(700kb) BAC(200kb) 基因組大小 單個(gè) 95% 單個(gè)95% （Mb） 基因組復(fù)蓋率 基因組復(fù)蓋率酵母 14 20 59 70 209線蟲 100 143 427 5001496果蠅 170 243 726 8502545鼠 3000 428612838 1500044935人類 3000 4286 12838 1500044935擬南芥 100 143