藥敏試驗(yàn)方法簡(jiǎn)介

藥敏試驗(yàn)方法簡(jiǎn)介第1頁(yè)/共72頁(yè)耐藥菌問(wèn)題日益嚴(yán)重“目前藥物失去作用的速度與科學(xué)家發(fā)現(xiàn)新藥物的速度差不多?！? 摘自WHO報(bào)告第2頁(yè)/共72頁(yè)抗微生物治療面臨的困境抗藥性問(wèn)題始終存在細(xì)菌不斷獲得新的耐藥機(jī)制以往對(duì)付耐藥性的策略收效不顯第3頁(yè)/共72頁(yè)第4頁(yè)/共72頁(yè)一、

抗菌藥物敏感試驗(yàn)（AST）預(yù)測(cè)抗菌治療的效果；指導(dǎo)抗菌藥物的臨床應(yīng)用；發(fā)現(xiàn)或提示細(xì)菌耐藥機(jī)制的存在，指導(dǎo)合理用藥，避免產(chǎn)生或加重細(xì)菌的耐藥；監(jiān)測(cè)細(xì)菌耐藥性，分析耐藥菌的變遷，掌握耐藥菌感染的流行病學(xué)，以控制和預(yù)防耐藥菌感染的發(fā)生和流行。第5頁(yè)/共72頁(yè)（1）抗菌藥物的選擇在我國(guó)主要遵循臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI）制定的抗菌藥物選擇原則A組：對(duì)特定菌群常規(guī)測(cè)試并報(bào)告的藥物B組：可常規(guī)測(cè)試、選擇性報(bào)告的藥物C組：替代性或補(bǔ)充性藥物U組：僅用于泌尿道感染的抗菌藥物第6頁(yè)/共72頁(yè)葡萄球菌屬抗菌藥物藥敏試驗(yàn)推薦分組葡萄球菌屬抗菌藥物A組苯唑西林（頭孢西丁紙片）、克林霉素、青霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、B組四環(huán)素、萬(wàn)古霉素、利奈唑胺C組環(huán)丙沙星、慶大霉素、氯霉素、奎奴普汀/達(dá)福普汀U組氧氟沙星、呋喃妥因、磺胺異惡唑、甲氧芐啶第7頁(yè)/共72頁(yè)腸桿菌科抗菌藥物敏感試驗(yàn)推薦分組腸桿菌屬抗菌藥物A組氨芐西林、頭孢唑林、慶大霉素B組阿米卡星、奧格門丁、哌拉西林+他唑巴坦、頭孢呋新、頭孢吡肟、頭孢西丁、環(huán)丙沙星、亞安培南、哌拉西林、復(fù)方新諾明C組頭孢他啶、氯霉素、氨曲南、四環(huán)素U組羧芐西林、氧氟沙星、呋喃妥因第8頁(yè)/共72頁(yè)假單胞菌屬的抗菌藥物藥物敏感推薦分組假單胞菌抗菌藥物A組頭孢他啶、慶大霉素、哌拉西林B組阿米卡星、氨曲南、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、亞安培南、哌拉西林+他唑巴坦C組U組氧氟沙星第9頁(yè)/共72頁(yè)不動(dòng)桿菌屬的抗菌藥物藥敏試驗(yàn)推薦分組不動(dòng)桿菌屬抗菌藥物A組氨芐西林/舒巴坦、頭孢他啶、亞胺培南、環(huán)丙沙星、慶大霉素B組阿米卡星、哌拉西林+他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢噻肟、復(fù)方新諾明、哌拉西林、四環(huán)素第10頁(yè)/共72頁(yè)

腸球菌屬抗菌藥物藥敏試驗(yàn)推薦分組

腸球菌屬抗菌藥物A組氨芐西林、青霉素B組萬(wàn)古霉素、利奈唑胺C組慶大霉素(120μg)、鏈霉素(300μg)U組環(huán)丙沙星、四環(huán)素、呋喃妥因第11頁(yè)/共72頁(yè)肺炎鏈球菌抗菌藥物藥敏試驗(yàn)推薦分組肺炎鏈球菌抗菌藥物A組青霉素、苯唑西林(1μg)、紅霉素、復(fù)方新諾明B組萬(wàn)古霉素、克林霉素、四環(huán)素、氧氟沙星C組氯霉素、利奈唑胺第12頁(yè)/共72頁(yè)藥敏試驗(yàn)的折點(diǎn)亦遵照每年最新公布的CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，分為敏感（S）、耐藥（R）和中介（I）。第13頁(yè)/共72頁(yè)敏感：分離菌株能被測(cè)試藥物使用推薦劑量時(shí)在感染部位通?？蛇_(dá)到的抗菌藥物濃度所抑制耐藥：分離菌株不能被測(cè)試藥物常規(guī)劑量可達(dá)到的藥物濃度所抑制；分離菌株可能存在某些特定的耐藥機(jī)制；治療研究顯示藥物對(duì)分離菌株的臨床療效不可靠耐藥＝治療無(wú)效；敏感≠治療有效第14頁(yè)/共72頁(yè)二、抗菌藥物的種類及作用機(jī)制第15頁(yè)/共72頁(yè)三、藥敏試驗(yàn)方法學(xué)紙片擴(kuò)散法（K-B法）稀釋法（MIC法）肉湯稀釋法常量稀釋法微量稀釋法瓊脂稀釋法E-test法1.手工試驗(yàn)第16頁(yè)/共72頁(yè)2.自動(dòng)儀器藥敏系統(tǒng)

第17頁(yè)/共72頁(yè)紙片擴(kuò)散法（K-B法）原理：抑菌圈的大小反映受試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度，并與該藥對(duì)測(cè)試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)。第18頁(yè)/共72頁(yè)耐藥中介敏感RISLog2.MICd1d2抑菌圈直徑（mm)MIC與抑菌圈直徑的線性關(guān)系第19頁(yè)/共72頁(yè)準(zhǔn)備抗菌藥物紙片和水解酪蛋白（M-H）培養(yǎng)基；挑取孵育16～24小時(shí)已分純菌落，置于生理鹽水管中，振蕩混勻后校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)；第20頁(yè)/共72頁(yè)用無(wú)菌棉拭子蘸取菌液，在試管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)擠去多余菌液，然后在MH瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60度，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周；平板在室溫下干燥3～5min，用無(wú)菌鑷子或商品化的紙片分配器將含藥紙片緊貼于瓊脂表面；第21頁(yè)/共72頁(yè)35℃孵育16～24小時(shí)，量取抑菌圈直徑；根據(jù)抑菌環(huán)的直徑，按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀，報(bào)告敏感、中介、耐藥。第22頁(yè)/共72頁(yè)2023/4/2623CLSI對(duì)K-B法的標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)定紙片藥物含量、細(xì)菌接種濃度、培養(yǎng)基、平皿厚度、孵育時(shí)間、環(huán)境、判定標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控方法等；常規(guī)測(cè)試、報(bào)告的抗生素。不同的藥判定標(biāo)準(zhǔn)不同；不同的菌判定標(biāo)準(zhǔn)也不同。2023/4/26第23頁(yè)/共72頁(yè)擴(kuò)散法藥敏影響因素培養(yǎng)基pH值7.2-7.4營(yíng)養(yǎng)程度（腸球菌能生長(zhǎng)）厚度抗生素拮抗劑含量（用29212監(jiān)控）鈣鎂離子含量、鋅離子含量（用27853氨基糖苷類和亞胺配能結(jié)果監(jiān)控）菌懸液濃度高抑菌環(huán)縮?。倌退帲舛鹊蛣t擴(kuò)大（假敏感）細(xì)菌純度氣體環(huán)境普通細(xì)菌放CO2時(shí)由于碳酸的影響，藥物活性受到影響，形成假敏感或假耐藥苛養(yǎng)菌放普通環(huán)境生長(zhǎng)不良，導(dǎo)致假敏感培養(yǎng)時(shí)間粘液性銅綠需48小時(shí)測(cè)量方法第24頁(yè)/共72頁(yè)稀釋法以一定濃度的抗菌藥物與含有受試菌的培養(yǎng)基進(jìn)行一系列不同倍數(shù)稀釋（通常為雙倍稀釋），培養(yǎng)16～24h后，通過(guò)觀察細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象來(lái)測(cè)得藥物對(duì)受試菌的最低抑菌濃度（MIC）。2023/4/26第25頁(yè)/共72頁(yè)稀釋法（MIC法）MIC法：分為常量法和微量法常量法：肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法微量法：微量肉湯稀釋法簡(jiǎn)化雙濃度折點(diǎn)法ATB藥敏簡(jiǎn)化常規(guī)濃度分布MIC法BD、德靈藥敏動(dòng)力學(xué)計(jì)算MIC法VITEK32、VITEK2藥敏第26頁(yè)/共72頁(yè)肉湯稀釋法不生長(zhǎng)=抗生素抑制細(xì)菌生長(zhǎng)生長(zhǎng)=抗生素?zé)o法抑制細(xì)菌生長(zhǎng)MIC(最小抑菌濃度)=抗生素可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最小濃度。.250.512481632MIC=8IncreasingAntibioticConc.第27頁(yè)/共72頁(yè)常量稀釋法藥敏試驗(yàn)的參考方法：

將標(biāo)準(zhǔn)接種物加入含対倍稀釋抗生素的MH肉湯管中.過(guò)夜培養(yǎng).MIC即是能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的含最低抗生素的濃度的那一管所標(biāo)示的濃度值(瓊脂稀釋法是將対倍稀釋后的抗生素加入融化后平衡到50℃的MHA中再傾制平皿，接種物為一定大小的斑點(diǎn)，濃度也為104CFU/ml).解釋標(biāo)準(zhǔn)(SorR)是建立在體內(nèi)可達(dá)到的抗生素濃度水平上104cfu/ml4210.50.250.120mg/ml第28頁(yè)/共72頁(yè)微量肉湯稀釋法第29頁(yè)/共72頁(yè)第30頁(yè)/共72頁(yè)第31頁(yè)/共72頁(yè)接種后應(yīng)充分混勻，但不能有氣泡產(chǎn)生靜置培養(yǎng)培養(yǎng)溫度；35℃氣體環(huán)境：所有細(xì)菌（包括苛養(yǎng)菌）均置大氣環(huán)境；厭氧菌置厭氧環(huán)境；微需氧菌置微需氧環(huán)境；淋菌瓊脂稀釋法置CO2培養(yǎng)時(shí)間：18小時(shí)第32頁(yè)/共72頁(yè)藥敏結(jié)果報(bào)告可用MIC（μg/ml）或?qū)φ誄LSI標(biāo)準(zhǔn)用S、R和I報(bào)告。對(duì)于稀釋法的批量試驗(yàn)，有時(shí)需要報(bào)告MIC50、MIC90。2023/4/26第33頁(yè)/共72頁(yè)稀釋法藥敏影響因素培養(yǎng)基pH值7.2-7.4營(yíng)養(yǎng)程度抗生素拮抗劑含量鈣鎂離子含量（鈣10-25；鎂10-12.5μg/ml）菌懸液（5×104CFU/ml）接種效應(yīng)濃度高M(jìn)IC抬高濃度低MIC壓低細(xì)菌純度氣體環(huán)境所有需氧細(xì)菌均放普通大氣環(huán)境。如果放CO2，由于碳酸的影響，藥物活性受到影響，形成假敏感或假耐藥培養(yǎng)時(shí)間真菌需48小時(shí)奴卡菌需5天第34頁(yè)/共72頁(yè)E-test法將稀釋法和擴(kuò)散法的原理結(jié)合起來(lái)，直接測(cè)定藥物對(duì)受試菌的MIC。2023/4/26第35頁(yè)/共72頁(yè)MIC值標(biāo)注于試條的光面Etest試條毛面貼于MHA上第36頁(yè)/共72頁(yè)Etest操作程序按照擴(kuò)散法標(biāo)準(zhǔn)操作涂布接種貼上試條并培養(yǎng)15-18小時(shí)讀取抑菌濃度并按標(biāo)準(zhǔn)解釋第37頁(yè)/共72頁(yè)

細(xì)菌生長(zhǎng)區(qū)E試條細(xì)菌生長(zhǎng)抑制區(qū)

25612880.16判讀MIC2023/4/26第38頁(yè)/共72頁(yè)

肺炎鏈球菌

青霉素MIC=3g/ml結(jié)果讀取第39頁(yè)/共72頁(yè)第40頁(yè)/共72頁(yè)BDPhoenixTM-100鳳凰全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏檢測(cè)系統(tǒng)最大的標(biāo)本容量：對(duì)100個(gè)標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行鑒定與藥敏測(cè)試！第41頁(yè)/共72頁(yè)第42頁(yè)/共72頁(yè)第43頁(yè)/共72頁(yè)鑒定部分：51孔鑒定實(shí)驗(yàn)改良經(jīng)典實(shí)驗(yàn)顯色＋熒光檢測(cè)無(wú)需附加實(shí)驗(yàn)與試劑藥敏部分：85孔藥敏實(shí)驗(yàn)比濁＋氧化還原（專利）實(shí)測(cè)倍比稀釋MIC值藥物種類與濃度梯度最多耐藥機(jī)制檢測(cè)同步進(jìn)行封閉式設(shè)計(jì)，安全無(wú)泄漏先進(jìn)的鑒定/藥敏復(fù)合板設(shè)計(jì)第44頁(yè)/共72頁(yè)P(yáng)hoenixTM100鑒定板

革蘭氏陽(yáng)性板、革蘭氏陰性板生化反應(yīng)組合革蘭氏陽(yáng)性菌鑒定板革蘭氏陰性菌鑒定板鑒定部分：51孔鑒定實(shí)驗(yàn),改良經(jīng)典實(shí)驗(yàn)顯色＋熒光檢測(cè),無(wú)需附加實(shí)驗(yàn)與試劑第45頁(yè)/共72頁(yè)第46頁(yè)/共72頁(yè)第47頁(yè)/共72頁(yè)鑒定實(shí)驗(yàn)方法在研究了上百種反應(yīng)底物基礎(chǔ)上，選擇了45種反應(yīng)底物。檢測(cè)板每20分鐘檢測(cè)一次Green,blue

andred檢測(cè)顯色反應(yīng)UVlight檢測(cè)熒光反應(yīng)panel第48頁(yè)/共72頁(yè)P(yáng)hoenix工作流程

從經(jīng)過(guò)夜純培養(yǎng)的新鮮平板上挑取菌落第49頁(yè)/共72頁(yè)P(yáng)hoenix工作流程

在ID肉湯中制成標(biāo)準(zhǔn)濁度（0.5~0.6麥?zhǔn)蠁挝唬┑木鷳乙旱?0頁(yè)/共72頁(yè)

加一滴AST指示劑到AST肉湯中

Phoenix工作流程第51頁(yè)/共72頁(yè)

從ID肉湯管中準(zhǔn)確吸取25L菌懸液，加入到AST肉湯中Phoenix工作流程第52頁(yè)/共72頁(yè)

將肉湯倒入檢測(cè)板，蓋蓋子。檢測(cè)板已準(zhǔn)備好，可以上機(jī)檢測(cè)。Phoenix工作流程巧妙的重力加樣技術(shù)第53頁(yè)/共72頁(yè)

掃描板條，輸入資料Phoenix工作流程第54頁(yè)/共72頁(yè)

將檢測(cè)板放入儀器（隨意位置）Phoenix工作流程第55頁(yè)/共72頁(yè)僅需區(qū)別革蘭氏染色即可選板板條種類齊全：

鑒定板、藥敏板、鑒定藥敏復(fù)合板同時(shí)提供獨(dú)立密封包裝的鑒定肉湯和藥敏肉湯，無(wú)需用戶配制。試劑常溫保存配套試劑第56頁(yè)/共72頁(yè)強(qiáng)大軟件支持：

BDXpert微生物專家系統(tǒng)幫助解釋和監(jiān)測(cè)檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)結(jié)果分別可分別傳入LIS系統(tǒng)或BDEpicenter數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)或打印機(jī)，并能進(jìn)行各種統(tǒng)計(jì)學(xué)分析強(qiáng)大的軟件系統(tǒng)第57頁(yè)/共72頁(yè)鑒定能力

革蘭氏陽(yáng)性菌鑒定>180種革蘭氏陽(yáng)性球菌革蘭氏陽(yáng)性桿菌

革蘭氏陰性菌鑒定>200種革蘭氏陰性發(fā)酵桿菌革蘭氏陰性非發(fā)酵桿菌無(wú)需附加實(shí)驗(yàn)95-96%準(zhǔn)確性鑒定時(shí)間

minimum 1:26hr maximum12:25hr average 3:24hr

median 2:26hr 95th% 6:26hr優(yōu)異的鑒定性能第58頁(yè)/共72頁(yè)檢測(cè)反應(yīng)孔內(nèi)微生物生長(zhǎng)情況濁度（傳統(tǒng)方法）：微生物生長(zhǎng)形成小顆粒和聚集成團(tuán)塊

氧化還原作用（BD專利技術(shù)）：通過(guò)藥敏實(shí)驗(yàn)指示劑顏色變化檢測(cè)微生物的新陳代謝濁度與氧化還原的變化通過(guò)紅、藍(lán)、綠光每20分鐘檢測(cè)一次

藥敏實(shí)驗(yàn)方法第59頁(yè)/共72頁(yè)藥敏種類與時(shí)間葡萄球菌屬鏈球菌腸球菌屬腸桿菌屬其他革蘭氏陰性桿菌GN-90%in5HrsGP-80%in6Hrs藥敏特點(diǎn)對(duì)倍稀釋藥物濃度真正的MIC檢測(cè)延遲耐藥檢測(cè)急診報(bào)告快速完成功能

耐藥檢測(cè)無(wú)需附加板條自動(dòng)檢測(cè)18種耐藥機(jī)制產(chǎn)超廣譜Beta內(nèi)酰胺酶檢測(cè)(ESBL)耐甲氧西林葡萄球菌檢測(cè)(MRS)鏈霉素高耐株檢測(cè)(HLSR)慶大霉素高耐株檢測(cè)(HLGR)耐萬(wàn)古霉素腸球菌檢測(cè)(VRE)產(chǎn)Beta內(nèi)酰胺酶革蘭氏陽(yáng)性菌檢測(cè)優(yōu)異的藥敏性能第60頁(yè)/共72頁(yè)儀器判讀結(jié)果儀器自動(dòng)記錄每次判讀的每個(gè)反應(yīng)孔的結(jié)果。將反應(yīng)結(jié)果與上一次判讀結(jié)果進(jìn)行比較。當(dāng)兩次結(jié)果沒(méi)有差別，則該反應(yīng)結(jié)束。內(nèi)置的運(yùn)算法則：顏色比率的變化依時(shí)間而變的數(shù)據(jù)庫(kù)：2、3、4、6、12小時(shí)，依據(jù)每個(gè)測(cè)試周期的判讀結(jié)果產(chǎn)生“百分比圖”，如獲得足夠的信息，則給出鑒定結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)菌量,可信度＞90％，給出結(jié)果。第61頁(yè)/共72頁(yè)BDXpert微生物專家系統(tǒng)鑒定實(shí)驗(yàn)BDXpert專家系統(tǒng)

-NCCLS-DIN-SFM-BDRules報(bào)告

-ID-MI-RulesetSIR-BDXpertSIR-特殊信息

藥敏實(shí)驗(yàn)第62頁(yè)/共72頁(yè)BDXpert微生物專家系統(tǒng)目的對(duì)藥敏結(jié)果進(jìn)行解釋與修正，保證藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，從而指導(dǎo)臨床正確進(jìn)行抗感染治療專家規(guī)則來(lái)自于：已確定的標(biāo)準(zhǔn)（NCCLS,DIN,SFM)藥物研發(fā)單位的文獻(xiàn)資料已廣為接受的文獻(xiàn)資料和經(jīng)驗(yàn)持續(xù)更新第63頁(yè)/共72頁(yè)BDXpert微生物專家系統(tǒng)規(guī)則的應(yīng)用SIR結(jié)果的解釋來(lái)自于專家系統(tǒng)規(guī)則的設(shè)置NCCLS,DIN,SFM,Custom藥物分級(jí)規(guī)則天然耐藥和天然敏感規(guī)則耐藥標(biāo)記規(guī)則腸桿菌科：ESBL葡萄球菌：MRS,beta-內(nèi)酰胺酶(GPBL)腸球菌：VRE,HLGR,HLSR第64頁(yè)/共72頁(yè)舉例：SIR解釋

規(guī)則規(guī)定腸桿菌科細(xì)菌Ampicillinbreakpoints: S8(I=16)R32Ref:Table2A(NCCLSM100-S12,2002)Phoenix顯示如果待檢菌是腸桿菌科細(xì)菌，且藥物為ampicillin，MIC=2那么結(jié)果顯示為“S”BDXpert微生物專家系統(tǒng)規(guī)則的應(yīng)用第65頁(yè)/共72頁(yè)舉例：天然耐藥規(guī)則規(guī)定規(guī)則：C.freundii

在體內(nèi)對(duì)ampicillin