表觀遺傳學(xué)研究

表觀遺傳學(xué)研究第1頁/共46頁表觀遺傳學(xué)研究第2頁/共46頁表觀遺傳

表觀遺傳（epigenetics）是指DNA序列不發(fā)生變化，但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變。這種改變是細(xì)胞內(nèi)除了遺傳信息以外的其他可遺傳物質(zhì)發(fā)生的改變，且這種改變在發(fā)育和細(xì)胞增殖過程中能穩(wěn)定傳遞。第3頁/共46頁人類基因組含有兩類信息基因組DNA的堿基排列順序，它提供生命所必需的所有蛋白質(zhì)合成的藍(lán)圖；表觀遺傳（epigenetic）信息，知道基因在何時(shí)、何地表達(dá)和關(guān)閉。Onegenome--------multipleepigenome第4頁/共46頁表觀遺傳的特點(diǎn)

1.沒有DNA序列的改變2.可遺傳的,即這類改變通過有絲分裂或減數(shù)分裂，能在細(xì)胞或個(gè)體世代間遺傳；3.可逆性的基因表達(dá)調(diào)節(jié)第5頁/共46頁表觀遺傳學(xué)研究DNA甲基化組蛋白修飾染色質(zhì)重塑基因組印跡X染色體失活第6頁/共46頁DNA甲基化

DNA甲基化(DNAmethylation)是研究得最清楚、也是最重要的表觀遺傳修飾形式，主要是基因組DNA上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基間的共價(jià)結(jié)合，胞嘧啶由此被修飾為5甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)。DNMT1SAM胞嘧啶5-甲基胞嘧啶胞嘧甲基化反應(yīng)

S-腺苷甲硫氨酸第7頁/共46頁DNA甲基化哺乳動物基因組中5mC占胞嘧啶總量的2%-7%，約70%的5mC存在于CpG二連核苷。在結(jié)構(gòu)基因的5’端調(diào)控區(qū)域,

CpG二連核苷常常以成簇串聯(lián)形式排列，這種富含CpG二連核苷的區(qū)域稱為CpG島(CpG

islands)，其大小為500-1000bp，約56%的編碼基因含該結(jié)構(gòu)。基因調(diào)控元件(如啟動子)所含CpG島中的5mC會阻礙轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體與DNA的結(jié)合。DNA甲基化一般與基因沉默相關(guān)聯(lián)；非甲基化一般與基因的活化相關(guān)聯(lián)；而去甲基化往往與一個(gè)沉默基因的重新激活相關(guān)聯(lián)。第8頁/共46頁重亞硫酸鹽測序圖5重亞硫酸鹽測序原理DNA甲基化的檢測第9頁/共46頁2.組蛋白修飾

組蛋白修飾是表觀遺傳研究的重要內(nèi)容。組蛋白的N端會受到不同的化學(xué)修飾，這種修飾往往與基因的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。被組蛋白覆蓋的基因如果要表達(dá)，首先要改變組蛋白的修飾狀態(tài)，使其與DNA的結(jié)合由緊變松，這樣靶基因才能與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相互作用。因此，組蛋白是重要的染色體結(jié)構(gòu)維持單元和基因表達(dá)的負(fù)控制因子。第10頁/共46頁2.1組蛋白修飾種類

乙?；?-一般與活化的染色質(zhì)構(gòu)型相關(guān)聯(lián)，乙?；揎棿蠖喟l(fā)生在H3、H4的Lys殘基上。甲基化--發(fā)生在H3、H4的Lys和Asp殘基上，可以與基因抑制有關(guān)，也可以與基因的激活相關(guān)，這往往取決于被修飾的位置和程度。磷酸化--發(fā)生與Ser殘基，一般與基因活化相關(guān)。泛素化--一般是C端Lys修飾，啟動基因表達(dá)。SUMO（一種類泛素蛋白）化--可穩(wěn)定異染色質(zhì)。第11頁/共46頁2.2組蛋白修飾第12頁/共46頁位點(diǎn)：

通常發(fā)生在蛋白質(zhì)的賴氨酸(K)上；可逆的生化反應(yīng)：乙酰化和去乙?；肿有?yīng)：

中和賴氨酸上的正電荷，增加組蛋白與DNA的排斥力，使DNA結(jié)構(gòu)變得疏松，從而導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄活化。生物學(xué)功能：

A.基因轉(zhuǎn)錄活化；B.DNA損傷修復(fù)2.2組蛋白的乙?；?3頁/共46頁2.3組蛋白的甲基化位點(diǎn)：主要發(fā)生在賴氨酸(K)或精氨酸(R)上；分子效應(yīng)：增加賴氨酸上的疏水力生物學(xué)功能：

A.基因轉(zhuǎn)錄活化（H3-K4)；B.基因轉(zhuǎn)錄沉默（H3-K9）；C.X染色體失活第14頁/共46頁2.4組蛋白的磷酸化位點(diǎn)：主要發(fā)生在絲氨酸(S)/蘇氨酸(T)功能：A.轉(zhuǎn)錄調(diào)控：H3K10被Rsk-2磷酸化B.異染色質(zhì)的形成：H4S1的磷酸化C.DNArepair：H2AX磷酸化第15頁/共46頁如何研究組蛋白與DNA的相互作用

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatinimmunoprecipitationassay,CHIP）第16頁/共46頁染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatinimmunoprecipitationassay,CHIP）研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法，在過去十年已經(jīng)成為表觀遺傳信息研究的主要方法。這項(xiàng)技術(shù)幫助研究者判斷在細(xì)胞核中基因組的某一特定位置會出現(xiàn)何種組蛋白修飾。基本原理：在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。

CHIP與基因芯片相結(jié)合建立的CHIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選。第17頁/共46頁甲醛處理細(xì)胞染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatinimmunoprecipitationassay,CHIP）第18頁/共46頁3、染色質(zhì)重塑

染色質(zhì)重塑（chromatinremodeling）是一個(gè)重要的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。染色質(zhì)重塑是由染色質(zhì)重塑復(fù)合物介導(dǎo)的一系列以染色質(zhì)上核小體變化為基本特征的生物學(xué)過程。組蛋白尾巴的化學(xué)修飾（乙?；?、甲基化及磷酸化等）可以改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，從而影響鄰近基因的活性。第19頁/共46頁4.基因組印跡(genomicimprinting)

依賴于父、母源性的等位基因的差異性表達(dá)，即父親和母親的基因組在個(gè)體發(fā)育中有著不同的影響，這種現(xiàn)象稱基因組印跡。

兩個(gè)親本的等位基因差異性甲基化是基因組印跡現(xiàn)象的基礎(chǔ)。第20頁/共46頁5.X染色體失活1961年M.F.Lyon就提出了關(guān)于雌性哺乳動物體細(xì)胞的兩條X染色體中會有一條發(fā)生隨機(jī)失活的假說，并認(rèn)為這是一種基因劑量補(bǔ)償?shù)臋C(jī)制，哺乳動物雌性個(gè)體的X染色體失活遵循n-1法則，不論有多少條X染色體，最終只能隨機(jī)保留一條的活性。X染色體失活過程為：Xist基因編碼XistRNA，XistRNA包裹在合成它的X染色體上，引發(fā)X染色體失活；隨著XistRNA在X染色體上的擴(kuò)展，DNA甲基化和組蛋白的修飾馬上發(fā)生，這對X染色體失活的建立和維持有重要的作用。第21頁/共46頁P(yáng)rader-Willisyndrome,PWS（父源）：肥胖、矮小,中度智力低下Angelmansyndrome,AS（母源）：共濟(jì)失調(diào),嚴(yán)重智力低下疾病的基礎(chǔ)：15q11-13微缺失兩個(gè)親本等位基因的差異性甲基化的結(jié)果第22頁/共46頁第23頁/共46頁H2AZH2AZ是組蛋白H2A家族中的一員

組蛋白H2A家族包括H2A1、H2A2、H2AZ和H2AX。

Polycombgroup(PcG)proteins：是一類轉(zhuǎn)錄抑制因子，通過對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的表觀遺傳學(xué)修飾調(diào)控與發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)受一系列復(fù)雜的過程調(diào)控，但對調(diào)控的過程和機(jī)理不清楚的地方。染色質(zhì)的調(diào)控包括：核小體的重調(diào)、組蛋白的修飾、特異的組蛋白亞型替換常見的組蛋白。各種亞型的組蛋白是染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)成分，影響一系列DNA相關(guān)的生物學(xué)過程：如基因組的完整性、X染色體失活、DNA的修復(fù)、基因表達(dá)調(diào)控。第24頁/共46頁

H2AZ蛋白的功能H2AZ在多細(xì)胞生物中非常重要，參與從線蟲到人的各個(gè)物種的與DNA有關(guān)的生物學(xué)過程，包括基因表達(dá)調(diào)控。H2AZ與基因的激活和抑制都相關(guān)，H2AZ在很多物種中，與基因組DNA中的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)兩側(cè)的一小段DNA結(jié)合。

研究表明H2AZ可以影響鄰近組蛋白的修飾模式、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重調(diào)酶的活性、染色質(zhì)的構(gòu)象。第25頁/共46頁H2AZ在ES細(xì)胞中結(jié)合位點(diǎn)的分析通過ChIP和基因芯片的分析發(fā)現(xiàn)，在ES細(xì)胞中H2AZ與大量發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)兩側(cè)的DNA結(jié)合，這種結(jié)合模式與Suz12相似（Suz12是Polycombgroup（PcG）proteins家族中的成員）。全基因組的分析發(fā)現(xiàn)，H2AZ蛋白與1655個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的啟動子區(qū)域結(jié)合。第26頁/共46頁H2AZ在ES細(xì)胞中結(jié)合位點(diǎn)的分析第27頁/共46頁H2AZ結(jié)合基因的分類H2AZ與發(fā)育相關(guān)的基因結(jié)合第28頁/共46頁H2AZ、SUZ12與DNA結(jié)合情況的比較第29頁/共46頁H2AZ、SUZ12與DNA結(jié)合情況的比較H2AZ、SUZ12與HOX基因家族DNA序列的結(jié)合比較H2AZ、和SUZ12與1655個(gè)基因結(jié)合模式的比較第30頁/共46頁H2AZ在神經(jīng)前體細(xì)胞和ES細(xì)胞中與DNA的結(jié)合比較第31頁/共46頁H2AZ蛋白在基因組中的空間分布RNAi干擾敲除ES細(xì)胞中的H2AZ基因

人工合成的19bp的雙鏈RNA，降解H2AZmRNA，從而降低ES細(xì)胞中H2AZ蛋白的含量,最終達(dá)到敲除H2AZ基因的目的。H2AZ#1(5-TGGAGATGAAGAATTGGAT-3)H2AZ#2(5-GGTAAGGCTGGAAAGGACT-3)第33頁/共46頁RNA干擾（RNAinterference,RNAi）由雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。第34頁/共46頁RNA干擾的發(fā)現(xiàn)獲得2006年的諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎第35頁/共46頁RNAi干擾的發(fā)現(xiàn)

1995年，康乃爾大學(xué)的中國留學(xué)生SuGuo博士在試圖阻斷線蟲（C.elegans）中的par-1基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)意想不到的現(xiàn)象。她們本是利用反義RNA技術(shù)特異性地阻斷上述基因的表達(dá)，而同時(shí)在對照實(shí)驗(yàn)中給線蟲注射正義RNA（senseRNA）以期觀察到基因表達(dá)的增強(qiáng)。但得到的結(jié)果是二者都同樣地切斷了par-1基因的表達(dá)。這是與傳統(tǒng)上反義RNA技術(shù)不能解釋這一現(xiàn)象，該研究小組一直沒能給這個(gè)意外以合理解釋。

直到1998年2月，AndrewFire和CraigMello才首次揭開這個(gè)懸疑之謎。他們證實(shí)，SuGuo博士遇到的正義RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象，以及過去的反義RNA技術(shù)對基因表達(dá)的阻斷，都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。當(dāng)他們將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲時(shí)發(fā)現(xiàn)，基因抑制效應(yīng)變得十分微弱，而經(jīng)過純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。該小組將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾（RNAinterference,簡稱RNAi）。

第36頁/共46頁反義RNA技術(shù)反義RNA:與mRNA互補(bǔ)的RNA分子正義RNA:內(nèi)源mRNA序列相對應(yīng)的RNA第37頁/共46頁H2AZ對ES細(xì)胞的自我更新和多潛能性的維持是非必需的siRNAOct4是維持ES細(xì)胞多能性的基因第38頁/共46頁H2AZ控制靶基因的表達(dá)H2AZ敲除的ES細(xì)胞中，H2AZ靶基因的表達(dá)水平。對照組：正常的ES細(xì)胞Enriched:富集H2AZ的靶基因與suz12類似（ES細(xì)胞敲除Suz12基因）RT－PCR第39頁/共46頁H2AZ、Suz12與靶基因啟動子的結(jié)合是相互依賴的H2AZ#1siRNA敲除H2AZ基因的ES細(xì)胞Suz12-/-:敲除Suz12基因的ES細(xì)胞第40頁/共46頁H2AZ對ES細(xì)胞的分化的關(guān)系誘導(dǎo)ES細(xì)胞早期分化的標(biāo)志基因：Pax3Wnt3A,Brachyury

Oct4,Nanog是維持ES細(xì)胞全能性的關(guān)鍵基因retinoicacid第41頁/共46頁