海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座

海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第1頁(yè)傳統(tǒng)海洋病毒學(xué)海洋病原體學(xué)海洋食物鏈動(dòng)力學(xué)這兩個(gè)領(lǐng)域支配著全球地球化學(xué)循環(huán)和宿主進(jìn)化，而且含有主要經(jīng)濟(jì)和環(huán)境保護(hù)潛在價(jià)值。海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第2頁(yè)海洋病毒熒光染色(SYBRGreenIstain25)(1998.5.加利福利亞SantaCatalina島附近5m海水)星云?自Fuhrman,J.Nature.1999,399:541～548海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第3頁(yè)一、海洋病毒介紹海洋病毒:是海洋環(huán)境中土著性、超顯微、僅含有一個(gè)類(lèi)型核酸DNA或RNA、專(zhuān)性活細(xì)胞內(nèi)寄生非細(xì)胞形態(tài)一類(lèi)微生物。能夠經(jīng)過(guò)細(xì)菌濾器，在活細(xì)胞外含有普通化學(xué)大分子特征，進(jìn)入宿主細(xì)胞又含有生命特征。海洋病毒各種多樣，含有形態(tài)多樣性和遺傳多樣性。海水中病毒分布，展現(xiàn)近岸高，遠(yuǎn)岸低特點(diǎn)。海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第4頁(yè)1、海洋生物多樣性哺乳類(lèi)魚(yú)類(lèi)無(wú)脊椎動(dòng)物原生動(dòng)物高等植物大型藻類(lèi)浮游藻類(lèi)藍(lán)細(xì)菌真菌細(xì)菌病毒因?yàn)榧夹g(shù)原因，大家往往低估了病毒在水體中豐度，因而忽略了它們?cè)谒h(huán)境中作用海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第5頁(yè)2、海洋病毒生態(tài)海洋中最普通生物群體豐度在107—109個(gè)/ml(細(xì)菌豐度5—25倍)幾乎對(duì)全部海洋生物都有影響，是海洋生物化學(xué)循環(huán)中最大一環(huán)5%—40%海洋生物被病毒銷(xiāo)毀近30％海洋藍(lán)藻和60％游離異養(yǎng)菌死亡與病毒相關(guān)地球26%碳循環(huán)經(jīng)海洋病毒完成。海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第6頁(yè)各種海洋生物豐度海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第7頁(yè)3、海洋中病毒種類(lèi)噬菌體藻類(lèi)病毒(噬藻體)浮游動(dòng)物病毒無(wú)脊椎動(dòng)物病毒脊椎動(dòng)物病毒陸源生物病毒非感染性粒子大小在20nm一350nm之間海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第8頁(yè)４、海洋病毒存在方式游離浮游吸附于無(wú)機(jī)或有機(jī)顆粒海洋生物非感染性攜帶海洋生物急性或慢性感染海洋生物溶源性感染海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第9頁(yè)海水中噬菌體

A,B:Myoviridae

C,D,E:Siphoviridae

F:Podoviridae.Bar

=

100

nm.

(自ProctorLM.1997.MicroscResTech.37(2):136～161)

細(xì)菌豐度與病毒豐度相關(guān)性到達(dá)

67%

海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第10頁(yè)藻類(lèi)病毒已在40多個(gè)類(lèi)群真核藻類(lèi)中發(fā)覺(jué)了病毒或VLPs，它們分布于已知14個(gè)綱中11個(gè)綱。(vanEtten,1991)VLPs致死作用是調(diào)整藻類(lèi)種群結(jié)構(gòu)、生物量和生產(chǎn)力主要因子。(Bratbak,1993)病毒豐度與海水中葉綠素a含量及細(xì)菌數(shù)量有很好相關(guān)性海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第11頁(yè)５、海洋病毒生態(tài)海洋各種生物有機(jī)會(huì)充分接觸，有利于病毒傳輸及變異，使海洋系統(tǒng)成為極富多樣性原始病毒庫(kù)。海洋病毒豐度隨海洋生態(tài)改變而動(dòng)態(tài)改變，藻類(lèi)及細(xì)菌大量繁殖時(shí)，病毒豐度升高。研究赤潮發(fā)生前后,水體中藻細(xì)胞死亡率與病毒樣顆粒(VLPs)數(shù)量變動(dòng)關(guān)系,認(rèn)識(shí)到VLPs致死作用是調(diào)整藻類(lèi)種群結(jié)構(gòu)、生物量和生產(chǎn)力主要因子。上層海水病毒數(shù)量較大，隨深度增加豐度降低，靠近海底又回升。海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第12頁(yè)６、海洋病毒生態(tài)效應(yīng)感染藻類(lèi)，影響海洋物質(zhì)和能量流開(kāi)啟泵；感染海洋細(xì)菌，影響海洋有機(jī)質(zhì)循環(huán)鏈；感染浮游生物，影響海洋經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和高等動(dòng)物食物鏈；感染海洋動(dòng)物，影響海洋動(dòng)物生態(tài)多樣性。海洋生態(tài)系統(tǒng)種群結(jié)構(gòu)、生物量和生產(chǎn)力主要調(diào)整原因，使系統(tǒng)內(nèi)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)愈加多樣化。影響許多生物地球化學(xué)過(guò)程和生態(tài)學(xué)過(guò)程：營(yíng)養(yǎng)物循環(huán)、離子分布和沉積率、物種多樣性和分布、基因傳遞、赤潮調(diào)控、全球變暖等。其生態(tài)效應(yīng)之廣，其它任何物種均望塵莫及海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第13頁(yè)異養(yǎng)微生物細(xì)胞碎片病毒溶解有機(jī)物無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物食植動(dòng)物初級(jí)生產(chǎn)力浮游生物病毒生態(tài)環(huán)輸出自Fuhrman,J.Nature.1999,399:541～548浮游生物病毒生態(tài)環(huán)海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第14頁(yè)（１）病毒影響光合作用人工試驗(yàn)表明,在海水中只要將2—200nm大小病毒組份增加20%,就能使光合作用效率降低達(dá)50%。(Suttleetal,1990,Nature,387,467–469).海洋生物能量流、CO2循環(huán)(藻類(lèi)和微生物)、全球氣候改變(甲硫醚,DMS和DMSP)。海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第15頁(yè)（２）病毒在海洋生物間基因轉(zhuǎn)移噬菌體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)率在1.58

×

10-8—3.7

×

10-8/PFU佛羅里達(dá)TampaBay河口每年發(fā)生

1.3

×

1014次轉(zhuǎn)導(dǎo)事件!病毒介導(dǎo)海洋生物間基因轉(zhuǎn)導(dǎo)是海洋生態(tài)中最主要基因水平轉(zhuǎn)移機(jī)制。(自Jiang&Paul,App.Envir.Microbiol.,1998,64,8:2780-2787.)海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第16頁(yè)海洋病毒這種能力動(dòng)搖了咱們對(duì)微觀世界認(rèn)識(shí)。海洋病毒編碼宿主基因：病毒感染能夠增加宿主新陳代謝、免疫力、分布范圍和進(jìn)化能力參加光合作用，如藍(lán)藻病毒攜帶有光合作用基因海洋病毒介導(dǎo)共生菌或益生菌變?yōu)椴≡?，如霍亂弧菌海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第17頁(yè)海洋病毒多樣性研究存在巨大困難難于培養(yǎng)缺乏普遍病毒基因標(biāo)簽宏基因組學(xué)應(yīng)用于海洋病毒多樣性研究，已經(jīng)表明100L海水（5000），1千克沉積物中（100萬(wàn)）病毒各個(gè)種類(lèi)是在全球分布，但每一類(lèi)病毒相對(duì)豐都受當(dāng)?shù)丨h(huán)境限制。海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第18頁(yè)二、海洋生物疾病病毒生態(tài)１、經(jīng)濟(jì)海洋生物病毒傳輸特征已經(jīng)發(fā)覺(jué)100各種,其中魚(yú)類(lèi)16(10),甲殼類(lèi)8種食物鏈伴隨傳輸:病毒多宿主感染、人工飼料循環(huán)、種類(lèi)蠶食水介導(dǎo)傳輸:群集狀態(tài)(人工養(yǎng)殖、野生群集)、病毒攜帶(物理富集、生物富集)垂直傳輸:溶源感染海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第19頁(yè)２、病毒與海水養(yǎng)殖容納量病毒各種宿主豐度變動(dòng)游離病毒豐度變動(dòng)病毒存活時(shí)間病毒傳輸空間原因變動(dòng)宿主敏感性改變海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第20頁(yè)三、變異與新病毒發(fā)生海量病毒庫(kù)容紫外線和其它理化原因誘變遺傳物質(zhì)交換復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)中宿主交替篩選大時(shí)空系統(tǒng)海洋生物容量預(yù)測(cè)海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第21頁(yè)四、海洋病毒綜合利用赤潮治理有害細(xì)菌控制有害病原競(jìng)爭(zhēng)性防治功效基因資源開(kāi)發(fā)新基因操作載體新生態(tài)學(xué)技術(shù)海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第22頁(yè)五、海洋病毒生態(tài)學(xué)關(guān)鍵技術(shù)1、病毒分離濃縮和形態(tài)學(xué)判定技術(shù)（1）吸附洗脫方法：膜吸附過(guò)濾、鹽沉淀、吸附劑吸附等是常見(jiàn)方法。膜吸附過(guò)濾-洗脫法被認(rèn)為是比很好病毒濃縮技術(shù)。（2）基于病毒物理學(xué)特征：超速離心或透析2、病毒分子生物學(xué)判定主要有兩種檢測(cè)方法:(1)核酸雜交檢測(cè)病毒核酸,利用核酸探針、基因芯片檢測(cè)病毒核酸。(2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)病毒核酸。主要有兩種基因分析方法：(1)對(duì)病毒核酸克隆或PCR產(chǎn)物做限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)。(2)克隆或PCR產(chǎn)物核酸序列分析,產(chǎn)物直接做核酸序列測(cè)定,與已公布序列作比對(duì),分析核酸基因型和基因多態(tài)性。海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第23頁(yè)3、病毒定量測(cè)定在海洋病毒定量研究方面,主要有噬菌斑計(jì)數(shù)法(PFU)、透射電鏡技術(shù)(TEM)、表面熒光顯微技術(shù)(EIPFM)和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)(FCM)等方法。海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第24頁(yè)六、研究需求與展望重點(diǎn)海區(qū)病毒分布、豐度、種類(lèi)病毒分離物資源庫(kù)和病毒基因庫(kù)海洋病毒選擇性生態(tài)分析技術(shù)海洋病毒基因芯片分析技術(shù)動(dòng)態(tài)病毒資源數(shù)據(jù)庫(kù)病毒與各種海洋生物相互作用關(guān)系海洋生態(tài)和養(yǎng)殖生物疾病動(dòng)態(tài)預(yù)報(bào)治理赤潮與海洋污染海洋生物多樣性與生態(tài)平衡調(diào)整近期遠(yuǎn)期海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第25頁(yè)7研究實(shí)例1淋巴囊腫病淋巴囊腫病(Lymphocystisdisease,LCD)

是由虹彩病毒科淋巴囊腫病毒屬病毒感染而致一個(gè)病毒病。該病侵染宿主范圍廣，已知最少42科125種以上魚(yú)可被該病毒感染。淋巴囊腫病是發(fā)覺(jué)最早魚(yú)類(lèi)病毒性疾病之一，鱸形目、鰈形目和鈍形目中一些種類(lèi)都可感染。鱸魚(yú)、真鯛、紅斑笛鯛、石斑魚(yú)、牙鲆、大菱鲆和東方純等都曾發(fā)覺(jué)過(guò)。

1998年,該病在我國(guó)北方養(yǎng)殖牙鲆中大規(guī)模暴發(fā)，給養(yǎng)殖者造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第26頁(yè)被淋巴囊腫病毒感染、并表現(xiàn)經(jīng)典病癥牙鲆。海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第27頁(yè)圖１

示體表、鰭小皰狀腫脹物

圖２示鰭膜上腫狀物

海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第28頁(yè)被淋巴囊腫病毒感染、并表現(xiàn)經(jīng)典病癥鱸魚(yú)。

海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第29頁(yè)7.1淋巴囊腫病介紹淋巴囊腫病是1874年發(fā)覺(jué)，當(dāng)初認(rèn)為是原蟲(chóng)引發(fā)。1962年發(fā)覺(jué)病毒粒子，1966年從魚(yú)類(lèi)成纖維細(xì)胞中分離出病原性病毒而得到證實(shí)。該病毒是網(wǎng)箱或工廠化養(yǎng)魚(yú)常見(jiàn)病，主要見(jiàn)于1齡魚(yú)類(lèi)，體長(zhǎng)20-30cm，體重100-160g。病原:淋巴囊腫病毒粒子為正二十面體，大者200-250nm，小130-150nm?？梢l(fā)細(xì)胞病變，產(chǎn)生細(xì)胞質(zhì)包涵體。海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第30頁(yè)7.2淋巴囊腫病組織學(xué)特征牙鲆淋巴囊腫病毒中國(guó)分離株(lymphocystisdiseasevirusisolatedfromChina,LCDV-C)體外感染顯微圖片。顯示LCDV-C可在草魚(yú)細(xì)胞(GCO)中增殖，并形成病變斑。(A)正常GCO對(duì)照細(xì)胞。(B)LCDV-C接種1天后，GCO細(xì)胞改變。

?LCDV-C接種了3天后，在單層GCO細(xì)胞中形成病變斑。

海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第31頁(yè)7.3淋巴囊腫病細(xì)胞學(xué)特征LCDV-C感染GCO細(xì)胞電鏡照片。(A)顯示細(xì)胞中染色體固縮、形成空泡。(B)主要顯示核碎裂。

海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第32頁(yè)LCDV-C在GCO細(xì)胞中引發(fā)病變顯微照片。A、C、E為正常對(duì)照細(xì)胞；A、B由Giemsa染色(100)，C、D、E和F由Hoechest33258染色(200)；A、B、C、D為普通光鏡觀察，E、F為熒光顯微鏡觀察。

海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第33頁(yè)7.4淋巴囊腫病病狀和診療病理學(xué)特征:在魚(yú)體表和鰭上出現(xiàn)大小不一、呈白色、灰色、粉紅色乳頭狀腫瘤狀物，這些腫脹物有各個(gè)分散，也有聚集成團(tuán)或聯(lián)成片，嚴(yán)重患者密布于全身皮膚。囊腫細(xì)胞大小普通為0.1-0.5毫米，大者可達(dá)1毫米以上。除發(fā)生在魚(yú)體表外，鰓、咽喉、腸壁、腸系膜、肝、脾、卵巢等器官上也可能出現(xiàn)。除引發(fā)魚(yú)外行難看外，還可造成魚(yú)免疫能力下降。腫瘤破裂時(shí)形成潰瘍面，引發(fā)寄生蟲(chóng)、細(xì)菌等繼發(fā)性感染。病癥較輕時(shí)，可自愈，2齡以上魚(yú)感染此病概率小。臨診:依據(jù)外觀病狀進(jìn)行診療和抗原-抗體反應(yīng)。海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第34頁(yè)7.5流行情況

此病在10月至翌年5月，水溫10—25攝氏度時(shí)為流行高峰期，在我國(guó)整年均可發(fā)生。網(wǎng)箱養(yǎng)殖感染率可達(dá)60％以上，池塘為20％—27％。此病在2齡以上魚(yú)，普通不引發(fā)死亡，但魚(yú)體較瘦，外表難看，失去商品價(jià)值；有病魚(yú)囊腫可脫落自愈。對(duì)1齡幼魚(yú)可引發(fā)死亡，發(fā)病后兩個(gè)月內(nèi)死亡率可達(dá)30％,甚至到80%

7.6防治方法:（1）人工繁殖用親魚(yú)應(yīng)嚴(yán)格檢疫，確保為無(wú)病毒感染健康魚(yú)；不購(gòu)置帶有淋巴囊腫病毒病癥苗種魚(yú)進(jìn)行養(yǎng)殖。

（2）對(duì)發(fā)病養(yǎng)殖網(wǎng)箱或魚(yú)池實(shí)施隔離，撈除病魚(yú)并銷(xiāo)毀；潑灑消毒劑和投喂抗菌藥餌，預(yù)防繼發(fā)性感染。

海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第35頁(yè)海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第36頁(yè)7.7當(dāng)前研究?jī)?nèi)容快速監(jiān)測(cè)：以利于選擇無(wú)病毒親魚(yú)可利用各種細(xì)胞系來(lái)培養(yǎng)病毒，方便進(jìn)行研究，或制作弱毒或無(wú)毒疫苗研究抗體結(jié)構(gòu)，怎樣提升其免疫能力。研究防治：對(duì)感染病魚(yú)怎樣進(jìn)行治療。海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第37頁(yè)8研究實(shí)例2對(duì)蝦白斑病毒8.1發(fā)病前養(yǎng)殖概況1987年，中國(guó)科學(xué)院海洋研究所進(jìn)行對(duì)蝦高密度養(yǎng)殖試驗(yàn)，能夠到達(dá)1.98千克/平方米，然后深入研究，2.72千克/平方米，最好2.93千克/平方米。大田也在800-900斤，現(xiàn)在是10-20斤。1993、1994年對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量為3萬(wàn)噸和3.5萬(wàn)噸，1991、1992是世界首位，為14.5和14萬(wàn)噸。海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第38頁(yè)8.2對(duì)蝦病毒種類(lèi)20世紀(jì)60年代首次報(bào)道甲殼綱病毒，當(dāng)前海洋甲殼類(lèi)病毒有30各種，其中對(duì)蝦病毒有17種左右。分屬于7個(gè)病毒科。最近幾年，日本、中國(guó)、泰國(guó)對(duì)蝦病暴發(fā)。對(duì)蝦桿狀核病毒（RV-PJ）、系統(tǒng)外胚層和中胚層桿狀病毒（SEMBV）、皮下及造血組織壞死桿狀病毒（HHNBV）、中國(guó)對(duì)蝦桿狀病毒（PCBV）、白斑綜合癥相關(guān)桿狀病毒（WSBV）。海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第39頁(yè)5種病毒引發(fā)對(duì)蝦個(gè)體病狀、組織病理學(xué)相同。主要感染對(duì)蝦皮下組織、造血組織和結(jié)締組織等?；疾?duì)蝦頭胸甲內(nèi)表面都有肉眼可辨透明十分顯著白斑，外胚層全部組織都受到感染；病蝦肝胰腺腫大發(fā)白；感染細(xì)胞有經(jīng)典核腫大，不形成核形多角體或顆粒類(lèi)包涵體。腸上皮、真皮和鰓等病變細(xì)胞占到60-90%，造血組織細(xì)胞病變率在40-70%，有組織細(xì)胞核無(wú)病變現(xiàn)象。同屬于桿狀病毒科無(wú)包涵體型桿狀病毒亞群。統(tǒng)稱(chēng)白斑綜合癥病毒（WSSV）海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第40頁(yè)1992年，在臺(tái)灣北部日本對(duì)蝦中暴發(fā)，2-7天累計(jì)死亡率為100%。1993年在斑節(jié)對(duì)蝦中也發(fā)覺(jué)了白斑綜合癥，電鏡下觀察為無(wú)包涵體桿狀病毒粒子。為dsDNA,用HindⅢ酶切，最少可取得22個(gè)片段。當(dāng)前已經(jīng)構(gòu)建了WSBV基因組文庫(kù)，建立了WSBVPCR診療方法，制備成WSBV特異核酸探針，用于WSBV斑點(diǎn)雜交和Sourthern雜交檢測(cè)。海洋病毒專(zhuān)題知識(shí)講座第41頁(yè)7.3病