生物技術藥物的相關知識專家講座

第三節(jié)慣用定量分析方法及其利用藥學0201王歡歡3021901012生物技術藥物的相關知識專家講座第1頁生化藥品、基因工程藥品慣用定量分析方法理化分析法化學分析法電化學分析法光譜分析法色譜法生化測定法酶法電泳法生物檢定法生物技術藥物的相關知識專家講座第2頁化學分析法重量法依據(jù)樣品中分離出單質(zhì)或化合物重量測定所含成份含量依據(jù)被測組分分離方法分類：

提取法胰酶中脂肪含量測定

揮發(fā)法熾灼殘渣干燥失重

沉淀法沉淀反應滴定分析法依據(jù)樣品中一些成份與標準溶液能定量地發(fā)生酸堿中和、氧化還原或絡合反應等進行測定

生物技術藥物的相關知識專家講座第3頁電化學分析法離子選擇性電極

藥品電極酶電極藥品膜電極酶催化反應生物組織膜電極生成產(chǎn)物不微生物電極同，電極種免疫電極類不一樣免疫場效應管其它：極譜氧電極法微電流電位法生物傳感器技術生物技術藥物的相關知識專家講座第4頁光譜分析法比色法蛋白質(zhì)雙縮脲反應

硫酸軟骨素Elson-Morgan比色法

按干燥品計算，測定氨基己糖含量

原理：酸性條件下水解氨基己糖堿性條件下與乙酰丙酮反應再與二甲氨基苯甲醛反應氨基葡萄糖（紅色）以鹽酸葡萄糖溶液為對照，525nm測定A生物技術藥物的相關知識專家講座第5頁計算:

氨基己糖含量=A×Ws×0.8309×500As×W×100％式中A—供試品溶液吸收度平均值

As—對照品溶液吸收度平均值

Ws—對照品溶液每1ml中含鹽酸氨基葡萄糖量（mg）

0.8309—校正因數(shù)（氨基葡萄糖與鹽酸氨基葡萄糖分子量比值）生物技術藥物的相關知識專家講座第6頁紫外分光光度法

蛋白質(zhì)280nm

糜蛋白酶與底物N-乙酰-L-酪氨酸乙酯作用后產(chǎn)物237nm熒光分光光度法

反應物或反應激發(fā)產(chǎn)生熒光直接測定

應用熒光試劑熒光測定

應用另一酶催化反應熒光測定生物技術藥物的相關知識專家講座第7頁酶法

酶活力測定法酶分析法以酶為分析對象以酶為分析工具或試劑活力單位比活性酶以外其它物質(zhì)含量

共同點：以酶能專一而高效地催化一些反應為基礎，經(jīng)過對酶反應或生成物等濃度測定而檢測對應物質(zhì)含量

生物技術藥物的相關知識專家講座第8頁酶活力測定法基本概念

酶活力酶催化一定化學反應能力

活性單位（國際單位，IU）任何一個酶，在25℃

以最適當?shù)孜餄舛取⒆钸m當緩沖離子強度以及最適當pH等條件下，每分鐘能轉化一微摩爾底物酶量

比活性每一毫克蛋白質(zhì)所含酶單位數(shù)

分子活力每微摩爾酶對最適底物活性單位每個酶分子每分鐘轉化底物分子量生物技術藥物的相關知識專家講座第9頁測定方法物理法化學法酶分析法終點法

動力學法（取樣測定法）

反應速率法（連續(xù)測定法）生物技術藥物的相關知識專家講座第10頁取樣測定法中止酶反應酶變性劑

5%三氯醋酸

3%高氯酸

酸

堿

醇連續(xù)測定法在反應過程中對反應系統(tǒng)進行連續(xù)檢測準確性和測定效率都較取樣法更加好生物技術藥物的相關知識專家講座第11頁檢測方法

紫外－可見分光光度法氧化還原酶脫氫輔酶NAD(P)H340nm

細胞色素氧化酶底物細胞色素C550nm摩爾吸收系數(shù)2.18×104

氧化型0.80×104

熒光分光光度法

底物本身在酶反應過程中有熒光改變

利用含有熒光底物

旋光度法

酶偶聯(lián)測定法

其它電化學測定法離子選擇性電極測定法放射化學法生物技術藥物的相關知識專家講座第12頁舉例

胰蛋白酶效價測定胰蛋白酶能專一地作用于賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸羧基組成肽鍵，酰氨鍵及酯鍵供試品溶液配制精密稱取本品適量

0.001mol/L鹽酸溶液溶解制成50-60IU/ml胰蛋白酶溶液生物技術藥物的相關知識專家講座第13頁

底物溶液配制

BAEE鹽酸鹽85.7mg

加水溶解使成100ml

精密量取10ml

磷酸緩沖液稀釋成100ml25.0±0.5℃,253nm以水做空白，測定吸光度

A應在0.575－0.585之間為宜生物技術藥物的相關知識專家講座第14頁測定

空白：

底物溶液3.0ml＋0.001mol/L鹽酸液0.2ml

供試品溶液

0.2ml與底物溶液3.0ml

馬上計時并搖勻

253nm測定吸收度每隔30s測一次，共5min

以A為縱坐標，時間為橫坐標作圖每30s吸收度改變恒定在0.015－0.018之間，呈線性關系不少于3min生物技術藥物的相關知識專家講座第15頁計算

P=A1-A20.003TW式中P－每1mg胰蛋白酶供試液中含胰蛋白酶單位數(shù)

A1－直線上終止吸收度

A2－直線上開始吸收度

T－A1至A2讀數(shù)時間（min）

W－測定液中含供試品mg數(shù)

0.003－上述條件下，吸收度每改變0.003，相當于1個胰蛋白酶單位生物技術藥物的相關知識專家講座第16頁影響效價測定原因

酶濃度最正確濃度50IU/ml－60IU/ml

溫度溫度每升高1℃活力單位增高5%底物底物溶液應在配制后3h內(nèi)使用關鍵在于判斷底物濃度[S]與Km關系

pH值

H+能改變酶活性中心解離情況，升高或降低酶活性

空白和對照試驗生物技術藥物的相關知識專家講座第17頁酶反應進程曲線和酶濃度曲線生物技術藥物的相關知識專家講座第18頁酶分析法動力學分析法酶底物當?shù)孜餄舛萚S]<Km時，一級反應性態(tài)輔酶雙底物反應一類底物濃度足夠高單底物反應活化劑注意：濃度超出一定水平后造成抑制測定不專一，易受干擾抑制劑不可逆抑制劑濃度抑制程度線性可逆抑制劑低濃度范圍濃度抑制程度

生物技術藥物的相關知識專家講座第19頁舉例抑肽酶效價測定底物溶液制備

N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽171.3mg

加水溶解并稀釋至25ml胰蛋白酶溶液制備

胰蛋白酶對照品適量，精密稱定加鹽酸滴定液（0.001mol/L）制成每1ml

中約含0.8單位溶液（約每1ml中含1mg）溶液生物技術藥物的相關知識專家講座第20頁胰蛋白酶稀釋溶液制備精密量取上述胰蛋白酶溶液1ml

用硼砂-氯化鈣緩沖液（pH8.0）稀釋成20ml

室溫放置10分鐘，置冰浴中供試品溶液制備精密稱取本品適量加硼砂-氯化鈣緩沖液制成每1ml中約含1.67單位（約每1ml中含0.6mg）溶液精密量取0.5ml與胰蛋白酶溶液2ml

再用硼砂-氯化鈣緩沖液（pH8.0）稀釋成20ml

反應10分鐘，置冰浴中（2小時內(nèi)使用）

生物技術藥物的相關知識專家講座第21頁測定

供試品

硼砂-氯化鈣緩沖液9.0ml＋底物溶液1.0ml

25℃±0.5℃水浴3～5分鐘滴加氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）調(diào)整pH8.0

精密加入供試品溶液1ml

用1ml微量滴定管以氫氧化鈉滴定液滴定使溶液pH值一直維持在7.9～8.1

每隔60秒讀取pH值恰為8.0時所消耗氫氧化鈉滴定液容積（ml），共6分鐘

對照品精密量取胰蛋白酶稀釋液1ml，按上法操作生物技術藥物的相關知識專家講座第22頁計算每1mg抑肽酶效價＝

(2n1－n2)×4000×f

Ｗ式中4000為系數(shù)

Ｗ為抑肽酶制成每1ml中約含1.67單位時酶量

n1為對照測定時每秒消耗NaOH滴定液容積

n2為供試品溶液每秒消耗NaOH滴定液容積

2為供試品溶液中所加入胰蛋白酶量為對照測