APC基因及其在宮頸癌病變中的蛋白表達(dá)情況研究,醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)論文

APC基因及其在宮頸癌病變中的蛋白表達(dá)情況研究,醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)論文宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性生命的第二大惡性腫瘤，在女性的惡性腫瘤中，其死亡率居?jì)D女惡性腫瘤之首。據(jù)估計(jì)，全球每年大約有529800例宮頸癌新增病例［1］，我們國(guó)家每年約有l(wèi)O萬(wàn)宮頸癌新發(fā)病例，并已成為導(dǎo)致我們國(guó)家女性死亡的第三大因素［2］。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的長(zhǎng)期經(jīng)過(guò)，華而不實(shí)牽涉多個(gè)基因的改變而引發(fā)細(xì)胞的異常增殖，導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生。20世紀(jì)90年代中期，大量的流行病學(xué)研究和分子生物學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)，人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)感染是宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(cervicalintraepithelialneoplasia，CIN)發(fā)生的重要因素，持續(xù)的HPV感染，是女性發(fā)生宮頸鱗癌的必要條件［3］。腺瘤性結(jié)腸息肉病(adenomatouspolyposiscoli，APC)基因是由Herrera等［4］于1986年初次發(fā)現(xiàn)并由Kinzler和Groden等［5］首先分離出來(lái)，APC基因直接介入Wnt的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，Wnt信號(hào)傳遞途徑的異常調(diào)節(jié)可引起腫瘤發(fā)生［6－7］。1材料和方式方法1.1臨床資料收集2020年3月～2020年8月接受廣泛或次廣泛子宮切除聯(lián)合盆腔淋逢迎清掃術(shù)治療的宮頸癌患者(宮頸癌組)宮頸標(biāo)本共33例，年齡33～66歲，平均46.1歲，術(shù)后病理診斷為宮頸鱗狀細(xì)胞癌，患者術(shù)前均未行化療、放療或免疫治療等抗腫瘤治療;宮頸上皮內(nèi)瘤變(CINⅢ)標(biāo)本(CINⅢ組)共28例，年齡16～50歲，平均39.2歲，術(shù)后病理回示為CINⅢ，無(wú)異形性細(xì)胞浸潤(rùn);31例同期因子宮肌瘤或子宮腺肌癥患者(對(duì)照組)，行全子宮切除術(shù)，均經(jīng)宮頸細(xì)胞DNA定量分析及宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查(TCT)檢測(cè)，年齡39～68歲，平均47.4歲，術(shù)后病理宮頸組織未見(jiàn)癌變。1.2試劑ＲNA提取試劑Tripurereagent(ＲOCHE公司)，凱普HybriMax醫(yī)用核酸分子快速雜交儀(凱普生物化學(xué)有限公司提供)，PCＲ反響試劑盒、DL2000DNAMarker(大連寶生物工程有限公司)，M-MulvＲeverseTranscriptase(Promega公司)，兔抗人多克隆、兔抗人APC單克隆抗體(北京中衫生物技術(shù)有限公司)，免疫組化SP試劑盒(DAKOenvi-sionDenMar)、DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司)。1.3實(shí)驗(yàn)方式方法1.3.1標(biāo)本采集及處理取3組手術(shù)患者宮頸移行帶組織，組織離體30min內(nèi)用無(wú)菌Ep管盛裝，放入－80℃冰箱保存。1.3.2宮頸組織中APCmＲNA的表示出取宮頸組織100mg放入研磨缽液氮下研充分磨，將勻漿液倒入1.5mL離心管室溫放置5min，按ＲNA提取試劑盒提取總ＲNA，取適量ＲNA樣品，用核酸蛋白定量?jī)x測(cè)定A260/A280值和濃度。反響體系25L。APC引物序列:上游引物為5-TGAG-GAATTTGTCTTGGCGAG-3，下游引物為5-GCACTTCCCATAGCAATCATT-3，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為526bp。-actin引物序列:上游引物為5-CT-GTCTGGCGGCACCACCA-3，下游引物為5-GCAACTAAGTCATAGTCCGC-3，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為254bp。PCＲ反響條件:預(yù)變性94℃3min，變性94℃30s;退火(復(fù)性)55℃30s，延伸72℃40s，APC基因循環(huán)35次，-actin循環(huán)28次，最后1次延伸72℃10min。PCＲMarkersD2000(內(nèi)含指示劑)4L點(diǎn)樣于第1孔，PCＲ產(chǎn)物8L，適量0.5TBE電泳緩沖液，混勻后依次點(diǎn)樣于其后各孔，在1.0%瓊脂糖上進(jìn)行凝膠電泳。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)攝取各樣本電泳圖，將有條帶顯示的標(biāo)本視為陽(yáng)性表示出。1.3.3宮頸組織中APC蛋白的表示出組織塊10%中性甲醛固定后，石蠟包埋、切片，切片厚度約4m，每例選取5張，1張用PBS緩沖液代替一抗，作為陰性對(duì)照，其余行APC免疫組化染色。石蠟切片65℃烤片、脫蠟、水化，放入3%H2O2中，37℃孵育20min，PBS振洗，熱修復(fù)抗原，滴加適量正常牛血清封閉液，室溫孵育10min;PBS振洗兩遍后加封閉液，37℃孵育30min，加1∶100的一抗(兔抗人APC多克隆抗體)，陰性對(duì)照用PBS代替一抗。37℃孵育30min，4℃冰箱過(guò)夜;滴加二抗SP(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素)37℃孵育15min，DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染;梯度酒精脫水，透明，封片;閱片、拍照，高倍鏡下觀察結(jié)果。以細(xì)胞漿著色為黃色或棕黃色斷定為APC蛋白陽(yáng)性目的，PBS代替一抗為陰性對(duì)照。每例均隨機(jī)在高倍鏡下觀察5個(gè)視野(放大400倍)，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)，每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)3次，以其算術(shù)平均值作為陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)。計(jì)數(shù)方式方法:陽(yáng)性著色細(xì)胞數(shù)10%為陽(yáng)性表示出，陽(yáng)性著色細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性［9］。1.3.4宮頸組織中HPV16DNA的表示出取1LDNA進(jìn)行HPVPCＲ擴(kuò)增，反響體系25L(DNA1L將PCＲ-Mix23.25L、Taq酶0.75L)。PCＲ條件95℃預(yù)變性9min，95℃變性20s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)40次。取20LPCＲ產(chǎn)物進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn);在反響槽內(nèi)參加1mL預(yù)熱至45℃的雜交液，溫育2～5min;將之前制備好的已變性DNA樣品溶液參加0.5mL預(yù)熱至45℃的雜交液中，混勻，然后加上薄膜，溫育10min后，進(jìn)行導(dǎo)流雜交;45℃條件下，用預(yù)熱至45℃的雜交液沖洗膜3次，每次0.8mL;顯色HPV分型，判讀結(jié)果。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方式方法采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比擬采用2檢驗(yàn)。Pearson列聯(lián)絡(luò)數(shù)檢測(cè)各變量間的相關(guān)性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1宮頸組織中APC基因表示出宮頸癌組與CINIII組的HPV16DNA陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);宮頸癌組APCmＲNA及蛋白的陽(yáng)性表示出率低于照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);CINⅢ組APCmＲNA表示出率與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。2.2APC蛋白表示出對(duì)照組中可見(jiàn)大量細(xì)胞胞漿呈黃色或棕黃色，即APC蛋白高表示出(圖1－A);CINⅢ組可見(jiàn)部分細(xì)胞包漿呈黃色或棕黃色，即APC蛋白弱表示出(圖1－B);宮頸癌組可見(jiàn)極少量細(xì)胞包漿呈黃色或棕黃色(圖1－C)。2.3APC基因表示出和HPV16感染的相關(guān)性分析在宮頸癌及CINⅢ組中，HPV16DNA陽(yáng)性標(biāo)本APC蛋白及mＲNA表示出率均較低，HPV16DNA陰性標(biāo)本APC蛋白及mＲNA表示出率較高，相關(guān)性分析表示清楚HPV16感染與APC蛋白及APCmＲNA表示出均呈負(fù)相關(guān)性。在對(duì)照組中，HPVDNA陽(yáng)性標(biāo)本APC蛋白及APCmＲNA均無(wú)表示出，HPVDNA陰性標(biāo)本APC蛋白及mＲNA表達(dá)率均較高(100%)，相關(guān)性分析表示清楚HPV感染與APC蛋白及APCmＲNA表示出無(wú)相關(guān)性。見(jiàn)表2。3討論宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的長(zhǎng)期經(jīng)過(guò)，以為牽涉多個(gè)基因的改變而引發(fā)細(xì)胞的異常增殖，導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生。CIN是與宮頸浸潤(rùn)癌密切相關(guān)的一組癌前病變，可反映宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的連續(xù)經(jīng)過(guò)，從輕度CINⅠ、中度CINⅡ到重度CINⅢ，假如繼續(xù)發(fā)展則可發(fā)展為宮頸浸潤(rùn)癌(invasivecervicalcancer，ICC)。HPV屬于乳多空病毒科A亞群內(nèi)的一組小分子雙鏈DNA病毒，對(duì)皮膚及黏膜上皮細(xì)胞具有強(qiáng)烈而特殊的嗜上皮性、高度組織和宿主特異性。HPV的致癌作用與HPVDNA的整合有關(guān)，其DNA作為獨(dú)立的外源染色體游離于細(xì)胞核內(nèi)，隨后病毒核酸整合到宿主細(xì)胞內(nèi)，使宿主細(xì)胞發(fā)生突變。當(dāng)前已分出100余種HPVDNA，華而不實(shí)30多種與宮頸感染和病變有關(guān)。根據(jù)其致病力的大小分為高危型和低危型兩種，國(guó)際癌癥研究協(xié)會(huì)對(duì)9個(gè)國(guó)家11次病例對(duì)照研究資料分析，HPV6、11、40、42、43、44、54，61、70、72、81，cp6108等12種歸為低危型，主要引起生殖道肛周皮膚和陰道下部的外生性濕疣類病變、扁平濕疣類病變和低度子宮頸上皮內(nèi)瘤樣變(CINI)，多呈一過(guò)性，可自然逆轉(zhuǎn);高危型主要為HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82等15種，主要導(dǎo)致CINII－III級(jí)病變和宮頸癌的發(fā)生，持續(xù)高危型HPV感染的CINⅠ級(jí)易進(jìn)展為CINⅡ～Ⅲ［10－11］。大量的流行病學(xué)研究和分子生物學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)，高危型HPV感染是宮頸癌及CIN發(fā)生的重要因素，持續(xù)的HPV感染，是女性發(fā)生宮頸鱗癌的必要條件［12］。HPVl6/18是最重要的兩種高危型HPV，華而不實(shí)HPVl6分別占43.9%、72.4%;HPV18分別占3.7%、27.9%［13］。本研究選擇的HPV陽(yáng)性標(biāo)本均為HPV16。大多數(shù)研究已經(jīng)證實(shí)HPV感染僅僅為一過(guò)性的，并不意味著一定存在癌前病變或癌變，僅講明存在HPV感染［14］。從各項(xiàng)關(guān)于宮頸癌及CIN的HPV感染率的研究結(jié)果中能夠看出，HPV不是唯一的致病因素，宮頸癌和CIN各期還存在其他分子學(xué)方面的改變［15－17］。當(dāng)前，高危型HPV檢測(cè)作為宮頸病變篩查重要手段，但由于其缺乏特異，故臨床上多結(jié)合液基薄層檢查(TCT檢查)以提高診斷正確性，降低漏診率。盡管如此，TCT檢查并不能減少對(duì)非典型鱗狀上皮細(xì)胞(atypicalsquamouscellsofundeter-minedsignificance，ASCUS)的診斷，盡管ASCUS對(duì)個(gè)體來(lái)講危險(xiǎn)性較低，若忽略這部分患者將導(dǎo)致SIL的漏診，且對(duì)有些癌前病變，因受觀察者主觀因素的影響，難以做出準(zhǔn)確診斷。APC基因是Wnt(waitukubulinationaltrail，Wnt)信號(hào)傳導(dǎo)通路中重要的抑癌基因，定位于染色體5q21，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和本身穩(wěn)定，在很多組織中均有表示出。作為具有抑制腫瘤發(fā)生的APC基因，早期的研究證實(shí)其為看門基因，近年來(lái)大量的研究結(jié)果顯示，APC基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。假如能夠?qū)⒏呶Ｐ虷PV感染與分子改變聯(lián)絡(luò)起來(lái)作為臨床篩查宮頸病變的特異性標(biāo)記物，將有望提高宮頸疾病篩檢的有效率。因而對(duì)宮頸病變組織中高危型HPV感染與APC基因改變的相關(guān)性的研究顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)發(fā)如今CINⅢ及宮頸癌組織中APC蛋白及APCmＲNA表示出均明顯低于對(duì)照組宮頸組織，并且隨著宮頸病變程度的加重，APC基因的表示出率越來(lái)越低，即從對(duì)照組到CINⅢ(癌前病變)組及宮頸癌組，APCmＲNA表示出呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)，固然宮頸癌組APC蛋白的表示出率低于CINⅢ(癌前病變)組，這可能是由于在計(jì)算該基因蛋白表示出率時(shí)，采用的是細(xì)胞計(jì)數(shù)法，具有一定的主觀性，但其大體趨勢(shì)與mＲNA的表示出是一致的。有研究發(fā)現(xiàn)，APC基因在宮頸CIN及宮頸癌組織中表示出均明顯低于正常宮頸黏膜，表示清楚在癌前病變宮頸黏膜組織中APC基因表示出己出現(xiàn)異常，可見(jiàn)APC基因在宮頸癌的早期階段即介入了宮頸癌的發(fā)生［18］。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)HPV16陽(yáng)性的宮頸組織中，APC蛋白及APCmＲNA表示出均較低，HPV16感染與APC蛋白及mＲNA表示出均呈負(fù)相關(guān)性，提示APC基因的低表示出與高危型HPV可能協(xié)同作用于宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)APCmＲNA和蛋白表示出情況進(jìn)行了定性研究，存在一定的局限性，今后研究將擴(kuò)大樣本量，參加對(duì)APC定量分析等方式方法，以便對(duì)APC基因