基因工程實驗須知

基因工程實驗須知一、每次實驗前必須預習實驗內(nèi)容，了解實驗的基本原理、操作步驟，禁止不預習就做實驗。二、每次實驗必須做好實驗記錄,每次實驗完成后，根據(jù)記錄寫出實驗報告。三、實驗所得結(jié)果，如不再供下一次實驗用，應交給指導教師，并注明名稱、數(shù)量、組別、姓名等。四、實驗室應經(jīng)常保持整潔、桌面上不要亂放與本次實驗無關的書籍、儀器、藥品?；鸩耦^、廢紙、廢液等應放入廢液桶中。倒入水槽中的廢液（無污染的）立即放水沖掉。五、愛護儀器、節(jié)約藥品。儀器損壞后應立即報損，并按規(guī)定賠償。六、試驗、藥品、公用器具使用后應立即放回原處，注意不要調(diào)錯試劑瓶塞或滴管,以免污染藥品。七、實驗室必須安靜，不得閱讀與本次實驗無關的書籍：禁止吸煙及吃食物。八、根據(jù)實驗記錄，及時完成實驗報告，不按時交報告者，不予記錄實驗成績。九、實驗完畢，值日生應將實驗室打掃干凈，關好水、電、門、窗，離開實驗室時，檢查一遍，以免發(fā)生事故，確保安全。實驗一植物基因組DNA提取目的：了解植物細胞的特點，掌握植物基因組DNA分離、純化的原理。原理：用植物基因組DNA提取液處理研磨、收集后的樣品，提取液中的乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）能螯合金屬離子，以防止破碎細胞的脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用，而細胞破碎液中的蛋白酶K在37℃溫浴過程中還能降解蛋白質(zhì)，從而減少了蛋白質(zhì)對DNA的污染。然后用CTAB處理，在特定的鹽濃度下，CTAB使基因組DNA處于溶解狀態(tài)，而蛋白質(zhì)仍為沉淀。經(jīng)細胞破碎液獲得的DNA粗提取液再用酚、氯仿、異戊醇處理，其中酚是高效的蛋白變性劑，可進一步將蛋白、脂類和細胞碎片去掉，然后用氯仿、異戊醇處理，一方面可達到去蛋白的目的，另一方面還可去除殘留的酚。材料植物的根、莖、葉。設備惕移液管，高客速冷凍離心食機，臺式離紡心機，水浴服鍋。試劑歐CTAB或莊Nacl溶勇液：綢4.1克勒NaCl溶舊解于80m深l水，緩慢蛛加入10克域CTAB辣，加水至讀100ml劑。貸其它試劑：洋氯仿、異戊檔醇（提24：1鎮(zhèn)），酚：氯耕仿：異戊醇盯（功25：24盛：1騎），異丙醇示，TE，1昂0%SDS互，蛋白酶K傅（20mg呼/ml），霜5mol/專LNaCl號。操作步驟竹選新鮮無病奪蟲害棚的葉片用自辣來水沖洗吸鉛干，用蒸餾錘水洗兩次，映然后用超純菌水洗一遍，當吸干，剪碎光稱0.5-紙0.25克懇。菊將所取材料慮放入預冷的梯研缽（研缽贏提前要滅菌螞），研成粉吸末后置于7應ml離心管捏內(nèi)（可以換出為將樣品放悄置到7ml蹲離心管中8額00ulＣ理ＴＡＢ憐后用玻棒搗怎碎）信。貴加入墾2.4ml罷65℃更預熱的虧CTAB涼，充分混合鋤后乎65℃牲水浴守90min跟以上，冷卻顫到室溫，加舌入等體積氯請仿異戊醇（仰24：1狐），輕輕顛鍛倒混勻承4℃鍬離心攪6000g糟×10mi稠n蠻，取上清加挽入奸2/3賄體積鼻的捉-20犯℃麥預冷的異丙虹醇輕輕混勻獨，-20英℃漫度放置觀20min感，毀4役℃先離心重5000g雕×富5min母，去上清。塘再沉淀中加順入煮0.6ml遼的索65遠℃驕CTAB輩溫葬育遼30min蝴，沾待床沉淀充分溶薪解，加入等德體積氯仿異峰戊醇充分混汽勻搭，4大℃籠離心沉6000g餓×槍5min椒，去上清加恢入堂2/3竿體積的-臥20猜℃載預冷的異丙級醇瑞，極輕輕混勻感-20王℃貸放置爸20min孩。撿4妄℃敗離心皺5000g吊×窄5min屯，去上清。煩用奔70%饒乙醇清洗沉垃淀兩次，真男空抽干，加漫入強200記μl廉TE猶溶解丙DNA蚊后置于吳4估℃拘備用提示：葬酚、氯仿近、毯異戊醇的作慶用：拼伴酚與氯仿是逼非極性分子唯，水是極性背分子，當?shù)敖K白水溶液與楚酚或氯仿混本合時，蛋白范質(zhì)分子之間抄的水分子就偽被酚或氯仿續(xù)擠去，使蛋相白質(zhì)失去水膝合狀態(tài)而變?nèi)切?。寒變性蛋白質(zhì)丸的密度比水限的密度大，圣經(jīng)過離心與沙水相分離，朝沉淀在水相漆下面，從而輝與溶解在水斥相中的DN觸A分開，而饞酚與氯仿有根機溶劑比重氏大，保留在濁最下層。嚴額暗作為表面變女性劑的酚與莫氯仿構(gòu)，在去除蛋我白質(zhì)的作用零中，各有利矩弊。酚的變煉形作用大，妖但酚與水能閉有一定程度易的互溶，因丟而損失了這江部分水相中研的DNA。挑氯仿的變形風作用不如酚瓶效果好，但宜氯仿不與水許相容，不會往帶走DNA竟，所以在抽炭提過程中，豆混合使用酚獄與氯仿效果獵最好。經(jīng)酚禽第一次抽提召后的水相中林有殘留的酚療，由于酚與脈氯仿是互溶非的，可用氯駛仿第二次變章性蛋白質(zhì)，銹此時一起將艘酚帶去。也攀可以在第二疏次抽提時將葛氯仿與酚混牙合(1:1摧)使用。您異戊醇能降扔低分子表面迷的張力，可張以減少抽提冒過程中的泡踏沫產(chǎn)生，同堂時異戊醇有升助于分相，踩使離心后的籍上層水相，旗中層變性蛋浮白相及下層波有機溶劑相木維持穩(wěn)定。俯實驗追二既基因的P喇CR擴曾反在應（聚合酶秘鏈式反應）目的：買學習PCR殺反應的基本龍原理及相關框?qū)嶒灱夹g(shù)原理：騎聚合酶鏈式抄反應（PC俊R，pol衫ymera醫(yī)sech懼ainr吸eacti池on）實質(zhì)僚是體內(nèi)DN樂A復制的體詳外模擬。當情雙鏈DNA如變性為單鏈樹以后，DN陵A聚合酶以再單鏈DNA哄為模版，并嚷利用反應混半合物中的四捷種dNTP師，以與模板缺互補的寡聚姥核苷酸鏈為遭引物，合成嬸新的DNA菊互補鏈。新利合成的DN扎A鏈的起點駁，由加入在削反應混合物銅中的一對寡舌聚核苷酸引燈物在模板D繭NA鏈兩端縣的結(jié)合點決槽定，經(jīng)過P料CR的循環(huán)輪即模板DN使A變性為單皆鏈、引物與椒模板退火（紀雜交）、D唐NA合成三嗎步驟的反復居重復，最后士，兩條引物寸結(jié)合位點之距間的DNA鄭區(qū)段的拷貝繭數(shù)在理論上吊可擴增達2很n拼，使特定的邊DNA區(qū)段燥得到迅速、與大量的擴增后。經(jīng)過30歲~35個循越環(huán)，可將2氧kb的DN搶A從1pg敲擴增到0.備5-1μg匪，能夠通過園瓊脂糖凝膠謝電泳檢測出懼來。畝轉(zhuǎn)基因植物將由于含有目照的基因，當側(cè)用針對目的販基因來說為市特異的一對玉寡聚核苷酸牙鏈作為引物轎，很對其總DN時A作PCR紛時，可以得繭到特異性產(chǎn)依物（目的基此因），而非能轉(zhuǎn)基因植物輝的總DNA牢不會擴增出膜特異性產(chǎn)物恰。材料吼待擴增的基椅因樣品設備跳基因擴增儀執(zhí)(PCR儀客)，臺式離筍心機，電泳癢儀，紫外監(jiān)珍測儀器皿寄微量恩移液絮器，微量離述心管（0.怪5ml），刺微量吸頭（藥Tip頭）敘，電泳槽試劑突Taq酶，想dNPT，膚10分×擴Taq酶b煎uffer皇，特異寡聚模核苷酸引物逃（prim躲er），模乞板DNA，識無菌去離子糟水，無菌礦遇物質(zhì)油，瓊紀脂糖，溴酚稍蘭指示劑。方法企在0.5姨ml輪無菌Epp樹endor羊f管中，分禿別以仙被滔檢測植物的搬總DNA、趣陰性對照、俘陽性對照D飛NA為模板厭，進行PC壯R擴增反應壘，并設置兩適個空白對照沃：膨沒有DNA熔和沒有引物螺的。鮮向各管中依羅次加入下列斯試劑（總的燃反應體積為類50μl）帥：跌無菌去離子套水寺善蠢兼孕33~32集μl讀1xTaq尤緩沖液崗作現(xiàn)霧鄭限5μl朗dNTP（鏟各2.5m曠mol猴/圓μl瓦）雙噴薯5μl駱引物R（2賺0pmol買/影μl）威砍營尊票2.5μl擺引物F（2請0pmol閃/住μl）然展叉峽予粗2.5μl枝模板DNA辣輸蹦垃取鏟1~2μl州（含質(zhì)粒D姻NA0.0性1~0.1邁μg或含植張物總DNA禾0.05~當0.5μg環(huán)）矩將喜以上各試劑辟（Taq酶丹除外）混勻娃后于煉94氧℃疤變性10m盲in，取出魚離心管，快份速離心幾秒盾鐘，使冷凝插于管蓋上的兩液體回到管掃底部，再加橡入1μlT次aqDNA遵聚合酶（約獄2~3U）票，狗混勻后吸取襪少量滅菌的墊礦物質(zhì)油覆膛蓋于頁面上茅。使用待加漠熱帽的PC懷R儀時不必協(xié)家礦物油。晝2、設置P講CR的循環(huán)滲程序，以下辰循環(huán)參數(shù)可顧作為參考：株98坐℃脂預變性2惹min；綢94咸℃喊變性30~爭60娘s；孔53~57悶℃態(tài)退火緒1min親；72答℃染延伸1~2螞min糞，循環(huán)25循~35次后絨，72趴℃允延伸10哭min極（以保證擴雜增出來的片雄段都是全長魚的），擴增慣反應完全后烘，取樣品反泡應液5~5副0μl，用趨合適的瓊脂嶺糖凝膠電泳洋檢測擴增的舉結(jié)果并照相授。提示：盜1河、襲防止污染：泰凈稱由于PCR巧反應的高靈屢敏性，所以介在操作中要維嚴防環(huán)境D傷NA污染，膛全部器皿均逮要求滅菌，殃最好戴一次僻性手套進行天操作，礦物改油要分裝，兇一次用一支棉。保為防止交叉制污染，最好叼所有PCR網(wǎng)試劑都事先散分裝成小份胃備用。裝有杯PCR試劑唉的微量離心享管打開之前不，應先在離膊心機上作瞬瞞時離心哄，這樣可減痕少污染機會疼。一般最后咳加模板DN飛A，且加樣期時忌形成噴叉霧，所霧有弓非即用管都嶄應蓋嚴。只遭要有可能，定就應設置陽岡性對照（即義由少量適當累的靶序列參陸與的PCR牌）和一個空金白對照（不望含模板DN拋A的PCR超），以檢測惕PCR反應燃系統(tǒng)是否正砌常?；?別、服反應系統(tǒng)組鍬成為（1）引物寄在PCR中敏的濃度常是禽1μmol蘇/拒L，這一濃眉度足以完成茂30錦個辰循環(huán)的擴增村反應，更高遵濃度可能導拒致出現(xiàn)意外瞧的非靶序列嶄的的擴增。憂如果引物的策濃度不足，狀則PCR的郵效率極低。室（2）Ta渣q琴攝DNA聚合摧酶催化以典熄型的PCR糠反應所需酶擇量約為2充U愁。酶量少，許擴增效率低紋；酶過量，超則可能導致鋸非靶序列的也擴增。針（3）dD邀NA系在飽紛和濃度（每夕種dDNA村20μmo盆l／L）下嗚使用。懸（4）靶序辱列：含有靶盤序列的DN稼A以單鏈或勺雙鏈形式加修入到PCR絲混合液中。貧閉環(huán)靶序列拖DNA的擴牙增效率略低殼于線狀DN悟A，因此用爛質(zhì)粒作反應淺模板時最好臭先將其線狀膝化。模板D思NA中靶序蜜列的濃度因求情況而異，茅可按已知靶朵序列量遞減隙（1ng，撿0.1ng乳，0.01搏ng等）的證方式設置一甜組對照反應罪，以檢測擴蜘增反應的靈麻敏度是否符廈合要求。眠3緊、參一般來說，堵模板的作用示量越多，P呢CR的效率賄相對也高一星些，但有一鼠定的限制，創(chuàng)特別是在模紋板DNA質(zhì)肥量不太好，岡雜質(zhì)含量比甩較多時，模綠板增多反而占會影響PC赴R的結(jié)果。牙4坦、辜若PCR產(chǎn)賄物呈降解片犧段首先減少宮模板DNA煮用量?？?拾、疏PCR產(chǎn)物削非特異性條每帶較多應首獵先提高退火師溫度，其次鞠減少引物的家用量。有時騰可以用首次判PCR的產(chǎn)貢物為模板進騎行再次PC恢R以得到專澤一的特異性屠條帶。筍實驗問三部堿法小楊量制備重組縱質(zhì)粒目的：職掌握最常用睜的提取重組秀質(zhì)粒的方法諒。原理：怪從大腸桿菌達細胞中分離成質(zhì)粒DNA供的方法很多尿。其分離可艘依據(jù)分子大坡小不同、堿宿基組成的差亞異以及質(zhì)粒危DNA的超橫螺旋共價閉嗽合環(huán)狀結(jié)構(gòu)依的特點來進趣行。目前常桐用的有堿變哭性提取法，暴羧基磷灰石屋柱層析法、緩質(zhì)粒DNA射釋放法、兩述相法等。其減中堿變性法隨提取效果良宵好，既經(jīng)濟鳥且收得率較凝高，提取到?jīng)Q的質(zhì)粒DN字A可用于酶泳切、連接與源轉(zhuǎn)化。園堿變性抽取服質(zhì)粒DNA弱是基于染色鑼體DNA于罪質(zhì)粒DNA委的變形與復殃性的差異而錘達到分離的夠目的。在p疾H高達12貴.6的堿性弓條件下，染輕色體的氫鍵吧斷裂，雙螺攏旋結(jié)夠解開俯而變性。質(zhì)聞粒DNA的臉大部分液斷理裂，但超螺攻旋共價閉合想環(huán)狀結(jié)構(gòu)的燙兩條互補鏈煮不會完全分獎離，當以p密H4.8的茅NaAC高災鹽緩沖液調(diào)誼節(jié)其pH值曬至中性時，仁變性的質(zhì)粒療DNA又恢績復到原來的脫構(gòu)型，保存艇在溶液中，勝而染色體D望NA不能復俗性而形成的世纏連得網(wǎng)狀幣結(jié)構(gòu)。通過上離心，染色思體DNA與輛不穩(wěn)定的大盟分子RNA表、蛋白質(zhì)-右SDS復合渴物等一起沉遷淀下來而被四除去。材料恨LB培養(yǎng)基醫(yī)上生長的菌敘落設備盈振蕩培養(yǎng)箱葉、微量離心循管、臺式高晴速離心機、漸恒溫高速離津心機、冰箱外、微型電泳斥槽試劑準備僅溶液獄Ⅰ叢：需50mM竭葡萄糖，拳25mM棟Tris捆-HCl（由pH8.0承），漿10mM劃EDTA凝（pH8.暢0）。1M澤受Tris-謝HCl（p睬H8.0）胡12.5蜻ml，買0.5M第EDTA紙（pH8.唐0）10m間l，葡萄糖銅4.730旺g私，加ddH詳2嗓O至500神ml。青高溫拌高壓滅菌1住5min，愉貯存于4折℃冠。逼溶液茶Ⅱ禿：0.2N養(yǎng)NaOH則1ml，穗10%SD遵S1ml掌，加ddH枝2艷O至10m反l。使用前紅臨時配置。略溶液蛛Ⅲ絮：醋酸鉀（噴KAc）緩考沖液（pH堵4.8）。江5MKa間c300嘩ml，冰醋鑄酸57.5傷ml，加d鏟dH形2制O至500睛ml、4宣℃循保存?zhèn)溆?。?、TE：勤10mM需Tris給-HCl（晚pH8.0遮），麥1mM腳EDTA療（pH8桃.0）?；?M你Tris病-HCl（問pH8.0鋸）1ml，藥0.5M紀EDTA屈（pH8.學0）0.2風ml，加d濃dH遙2遣O至100露ml。高壓陶濕熱滅菌2遺0min，神4羅℃葛保存?zhèn)溆谩Ｃ?、苯酚/寺氯仿/異戊嚷醇（25：批24：1）群6、乙醇（醬無水乙醇、淡70%乙醇括）咬7、5順×陸TBE：T童ris堿言54g所，硼酸液27.5g宰，EDTA剝-Na2·胃2H2O攀4.65g室，加ddH吊2O至10蹈00ml。遷高壓濕熱滅勻菌20mi始n，抄4筋℃洗保存?zhèn)溆谩Ｇ?、溴化乙遼錠（EB）斥：10mg秧/ml江9、Rna冠seA（戶RNA酶幅A）：不含夏DNA酶（怎Dnase發(fā)-free浙）Rnas凍eA的1糠0mg/m略l，TE配繩置，沸水加兩熱15mi評n，分裝后勾貯存于勢-20萬℃鄉(xiāng)。廉10、6究×族loadi檢ngbu之ffer（顛上樣緩沖液附）：0.2砌5%溴酚藍獵，0.25脹%二甲苯青姻FF，40他%（W/V燦）蔗糖水溶拌液。盯11、1%顛瓊脂糖凝喜膠：稱取妄0.2鹿g瓊脂糖于腐三角燒瓶中患，加蘋2值0ml歷1且×屠TAE擦，別微波爐加熱廣至完全溶化婆，冷卻至身60糠℃逗左右，加E顧B母液（1倒0mg/m耍l）至終濃瞧度0.5μ蠻g/ml（越注意：EB降為強誘變劑乘，操作時帶蹲手套），輕航輕搖勻。緩徐緩倒入架有抱梳子的電泳話膠板中，勿港使有氣泡，墳靜置冷卻3紐0min以動上，輕輕拔餃出梳子，放早入電泳槽中草（電泳緩沖犧液壟1削×餐TAE）研，貝即可上樣。慈四、操作步行驟予1、挑取L讓B固體培養(yǎng)越基上生長的罩單菌落，接威種于2.0夫mlLB寇（含相應抗摸生素）液體勝培養(yǎng)基中，星37進℃亞、感250共rpm輔振蕩培養(yǎng)過肥夜（約12轉(zhuǎn)~辯14hr）介。茶2、取1.塊5義ml認培養(yǎng)物放入桃微量離心管蘿中，室溫離絹心8000灶g啟×巾1min，社棄上清，將或離心管倒置東，將液體盡豆可能流盡。式3、將細菌揚沉淀重懸于紙100μl固預冷的溶液蔑Ⅰ個中，劇烈振客蕩，使菌體桶分散均勻。某4宜、叢加200μ事l新鮮配制授的溶液瞇Ⅱ艇，顛倒數(shù)次疑混勻（不要衣劇烈振蕩）感，并將離心才管放置于冰局上2~3m卵in，使細嘉胞膜裂解（蹤溶液蟻Ⅱ訊為裂解液，院故離心管中督菌液逐漸變脂清）?；?、加入1清50μl預點冷的溶液擠Ⅲ矛，將管溫和精顛倒數(shù)次混量勻，見白色泊絮狀沉淀，德可在冰上放繭置3~5m蝦in。溶液訂Ⅲ鬧為中和溶液判，此時K威+剛使SDS-憲蛋白復合物多沉淀。拉6、加入4愉50μl的照苯酚/氯仿親/異戊醇，爪振蕩均勻，吸4方℃間離心120宜00g塔×招10min箏。呆7、小心移節(jié)出上清于一較新微量離心松管中，加入釋2.5倍體織積預冷的無濱水乙醇，混舊勻，室溫放魯置2~5m仔in，償4嘆℃騾離心120預00g新×近15min哲。置8、1ml步預冷的70驢%乙醇洗滌外沉淀1~2體次，蛋4排℃代離心800況0g挺×蜜7min，束棄上清，將憑沉淀在室溫策下晾干。殊9、沉淀溶莖于20μl弦TE（含旋RNase石A20μ遞g/ml）悼，咐37旬℃何水浴30m滔in以降解尖RNA分子周，耳-20?！娲伪４?zhèn)溆?。提示：資1鞠、眾實驗安排：荒堿變性法抽播提質(zhì)粒DN梯A，除了菌敞體培養(yǎng)、質(zhì)得粒擴增金額陰和收集菌體橋外，其提取敬過程大致可倍分為三個步痛驟：從染色汗體DNA中蹲分離質(zhì)粒D鑄NA，這是蹈提取過程中壓最關鍵的操乳作步驟;去喚除質(zhì)粒DN俘A中的RN距A;進一步遺純化質(zhì)粒D帥NA，去除柳蛋白質(zhì)等雜趟質(zhì)。舉2稈、宋一些試劑的罰生化作用原弓理斬（1）溶液扇Ⅰ喬兵溶霉菌：水清解菌體細胞內(nèi)壁的主要化理學成分肽聚雜糖中的β-城1求,效4糖苷鍵，紡因而具有溶自菌作用。鉤鑒葡萄糖：增機加溶液的粘灑度，防止D蹈NA受機械佛剪切力作用印而降解。昌咳EDTA海：您金屬離子螯布合劑，螯合訴Mg勒2+霉，彈Ca仍2+廳等金屬離子當，抑制脫氧語核糖核酸酶燃（DNas將e）對DN開A的降解作拳用（DNa劃se作用挖時需要一定繩的金屬離子他強度作輔基絲）罰，撲同時EDT筒A的存在，纏有利于溶霉上菌的作用。蠢因為溶霉菌慈的反應要求覺有較低的離雀子強度環(huán)境惱。僵（2）溶液于Ⅱ錫-NaOH詢-SDS液叢滑NaOH累：紗核酸在pH凳值為5~9椅的溶液中是悅最穩(wěn)定的，怨但pH大于奇12或小于招3時，就會吊引起雙鍵之已間氫鍵的解膛離而變性。倘在溶液踢Ⅱ蛇中的NaO段H濃度為0煙.2N，加歌入提取液時那，該系統(tǒng)的寧pH就會高途達12.6拌，因而促使餓染色體DN奉A與質(zhì)粒D余NA的變性鋒。阿鐘SDS：為洋陰離子表面瓜活性劑，主違要功能有：皆溶解細胞膜掘上的脂肪與市蛋白，從而母破壞細胞膜速；尋解聚細胞中阿的核蛋白S割DS蛋白質(zhì)登結(jié)合為復合裳物，使蛋白亮變性沉淀下?lián)寔?，但SD轉(zhuǎn)S能抑制核羽糖核酸沒的謊作用，所以慌在以后的提壯取過程中，擠必須把它去錫除干凈，以弱防用RNa騎se去除R虧NA時受到怖干擾。澆（3）溶液牲Ⅲ賺-3M大KAc（抵pH4.8扎）溶液：香糧KAc的水蛇溶液呈堿性擦，為了調(diào)節(jié)泳pH至4.浴8，必須加貴入大量的冰抽醋酸，所以槍該溶液實際攔上是KAc恭-HAc的幸緩沖液。用推pH4.8浪的KAc溶嚴液是為了把鞠pH脖屈12.6的階抽取液pH細調(diào)回到中性筑，使變性的睬質(zhì)粒DNA墨能夠復性，奇并能穩(wěn)定存恭在。而高鹽除的3mol洗∕LKA悉c有利于變蹦性的大分子敏染色體DN扣A、RNA孕以及SDS效-蛋白質(zhì)復凳合物凝聚而稍沉淀之。前破者是因為中蠻和核酸上的必電荷。減少跑相斥力而互策相聚合，后撫者是因為鈉葵鹽與SDS落-蛋白質(zhì)復你合物作用后透，能形成溶邀解度較小的喬鈉鹽形式復諷合物，使沉萄淀完全。幅（4）為什微么用無水乙堆醇沉淀DN甲A:帖遍此為實驗中舍最常用的沉僑淀方法。乙笑醇的優(yōu)點是敬低度極性，遵可以以任意嫁比例和水相陸混容，乙醇肝與核酸不會廢起任何化學喚反應，對D悅NA很安全毅，因此是理恨想的沉淀劑攪。主府DNA溶液姑時以水合狀謀態(tài)穩(wěn)定存在努的DNA，巨當加入乙醇束時，乙醇會逆奪去DNA來周圍的水分戀子，使DN賭A失水而易咸于聚合。一蔥般實驗中，偶是加2倍體碎積的無水乙京醇與DNA山相混合。其腎乙醇的最終和含量占67御%左右。因杰而也可改用洞95%乙醇碎來代替無水喚乙醇（因無中水乙醇價格氣更貴），但票加95%乙虎醇使總體積艱增大，而D天NA在溶液紗中總有一定魄程度的溶解葉，因而DN躁A損失也增低大，尤其用墊多次乙醇沉醉淀時，會影倍響收得率。紗折衷的做法滲是初次沉淀減DNA是可爬用95%乙刊醇代替無水高乙醇，最后轎的沉淀步驟塵要使用無水置乙醇。也可男以用異丙醇弱選擇性沉淀彼DNA，一量般在室溫下洋放置15~奉30作min竹即可。堤臂使用乙醇在禮低溫條件下竄沉淀DNA既，分子運動拖大大減少，蕉DNA易于裁聚合而沉淀花，且溫度越膚低，DNA衣沉淀得越快伍。掃倘（5）RN折ase處理憲核糖核酸后耽，再次沉淀綁DNA時為秩什么一定要影加NaAc征至最濃度達截0.1~片0.25M潔。蓄冬在pH君答8左右的D裝NA溶液中訊，DNA分鑼子是帶負電級荷的，加一公定濃度的N糟aAc，使孩Na伶+繪中和DNA賽分子上的負壘電荷，減少集D零NA分子之至間的同性電肯荷相斥力，酒易于互相聚拘合而形成D鐘NA納鹽沉蛇淀。當加入酬大量鹽溶液等濃度太低時尚，只有部分滴DNA形成爺DNA鈉鹽神聚合，這樣拾就造成DN求A沉淀不完耳全。當加入戴的鹽溶液濃離度太高時，衣其效果也不細太好，在沉省淀的DNA色中，這由于過多的湊鹽雜質(zhì)存在課，影響DN臺A的酶切等滾反應，必須椅要進行洗滌娛或重沉淀。往（6）為什普么將DNA變保存于TE免緩沖液中？紐在基因操作旋實驗中，選某擇緩沖液的只主要原則是萌考慮DNA袋的穩(wěn)定性及而緩沖液成分利不產(chǎn)生干擾誼作用。磷酸農(nóng)鹽緩沖系統(tǒng)倍（pKa2卻=7.2）瓶、硼酸系統(tǒng)膽（pKal控=9.24脫）等雖然也感都符合細胞潑內(nèi)環(huán)境的生皺理范圍（p蔑H），可以清作為DNA鞋的保存液，社但在轉(zhuǎn)化實容驗時，磷酸污根將與Ca棚2+密產(chǎn)生沉淀；騎在DNA酶親反應時，不兵同的煤對輔鳳助因子的種拿類及數(shù)量要特求不同，有頑的要求高鹽籍離子濃度，迷有哦則要求普低鹽離子濃沒度，采用T棗ris-H府CL（pK園a=8.0損）的緩沖系船統(tǒng)，由于緩且沖對時Tr殲is鄙+消/忍Tris，邁不存在金屬舍離子的干擾己作用，故在輝提取或保存憐DNA時，龍大都采用T毯ris-H紙CL系統(tǒng)，近而TE緩沖床液中的ED使TA更能穩(wěn)互定DNA的發(fā)活性。操作要領：承1、該實驗數(shù)成功的標志注是把染色體反DNA，蛋恢白質(zhì)與RN葛A去除干凈題。獲得一定純收得率的質(zhì)碌粒DNA。訓去掉染色體懇DNA最為強重要，也較繭困難。因為俗在全部提取準過程中，只怠有一次機會扯去除染色體閃DNA，其用關鍵步驟是內(nèi)加入溶液愛Ⅱ近與溶液索Ⅲ墓時，控制變?nèi)f性與復性操貪作時機，既裳要使試劑與矩染色體DN寒A充分作用立使之變性隸；膀又要使染色綿體DNA不抬斷裂成小片道段而能與質(zhì)握粒DNA相椅分離。這就熱要求試劑與控溶菌液充分碰搖勻。搖動險時用力適當欣。一般加入蓬SDS后要蛋注意不能過粗分用力振蕩廈，但又必須砍讓它反應充時分。棋2、當加入目溶液拖Ⅱ釋5煌min妻后，若沒有宴看到溶液變績稠時，實驗暴不能再繼續(xù)鋪做下去了。城3、配置試茅劑時，要用申重蒸水配置番外，其器皿富必須嚴格清菌洗，最后要薦用重蒸水沖稿洗三次，凡屢可以進行滅光菌的試劑與洋用具都要經(jīng)洪過高壓蒸汽李滅菌，防止武其他雜質(zhì)或體酶對DNA榨的降解，對跟Ep茂管成、卻Tip頭與帖非玻璃離心桃管等只能濕裁熱滅菌，然亭后放置在惕50轎℃?zhèn)銣叵渲泻娓慑a使用。刪4、用乙醇漆沉淀DNA雄時，要觀察刊水相與乙醇侍之間沒有分交層現(xiàn)象之后策，才可放在悅冰箱中去沉碰淀DNA。震實驗與四毒DNA怠的重組連接目的：迫了解T4戰(zhàn)搏DNA連接敘酶的幾種生則物學功能及勢用途；學習素在T4DN竿A連接酶的早作用下，載封體與目的基幫因的幾種不貌同的連接方謀式以及在標思準的連接反練應體系中，循質(zhì)粒載體和楊插入的外源莊DNA的比汽率關系和各制自的用量；奴掌握用Pm妻d18-T泉vecto手r與PCR鼻產(chǎn)物進行T乎-A隆克隆的機理羊及其應用掩。原理：竿困外源DNA編片段和線狀騰質(zhì)粒載體的布連接，也就跳是在雙鏈D汪NA視廣5′-蓄磷酸妨可生成4個烘新的磷酸二勢酯鍵。但如敵果質(zhì)粒DN卸A已去磷酸惜化，則吸能饅形成2個新巾的磷酸二酯蔑鍵。在這種撇情況下產(chǎn)生捆的兩個雜交池分子帶有2查個單鏈切口憑，當雜交體邪導入感受態(tài)算細胞后可被鋤修復。相鄰活的5′-磷絡酸和3′-歡羥基間磷酸倉二酯鍵的形餅成可在體外某由兩種不同伸的DNA連輕接酶催化，們這兩種酶就氏是大腸桿菌患DNA連接丹酶和T4噬蠟菌體DNA捉連接酶。實火際上在有克悲隆用途中，癥T4噬菌體礦DNA連接挑酶都是首選隱的用酶。這稻是因為在下鐵述反應條件較下，它就能獨有效地將平摧端DNA片那段連接起來雪。DNA一最端與另一端篇的連接可認枕為是雙分子漠反應，在標蚊準條件下，擴其反應速度遺完全由互相藍匹配的DN盼A末端的濃鑄度決定。不保論末端位于燭同一DNA瓜分子（分子田內(nèi)連接）還捏是位于不同冊分子（分子奔間連接），赴都是如此。釀現(xiàn)考慮一種永簡單的情況乘，即連接混物合物中只含歲有一種DN喇A，也就是卵用可產(chǎn)生粘斷端的單個限丹制酶切割制賄備的磷酸化飽載體DNA日，再千加作用的底神物。如果反自應中DNA宮濃度低，則雨配對的兩個升末端同一D忙NA分子的飼機會較大（肉因為DNA懂分子的一個瓦末端找到同關一分子的另錄一末端的概譜率要高于找經(jīng)到不同DN借A分子的末污端的概率）智。這樣，在蠶DNA濃度虧低時，質(zhì)粒脂DNA重新庭環(huán)化將卓有柏成就。如果固連接反應中時DNA濃度死有所增高，士則在分子內(nèi)前連接反應發(fā)究生以前，某謀一個DNA乎分子的末端港碰到另一D仍NA分子末新端的可能性淡也有所增大膏。因此在D余NA濃度高療時，連接后騰的初產(chǎn)物將夾是質(zhì)粒二聚處體和更大一醒些的寡聚體黎。材料球載體吼洽DNA儀器止離心機、離雞心管、恒溫榆水浴箱等試劑巾10×Bu窄ffer、品無水乙醇、罷3mol/衣LNaA潛c、75%妖的乙醇、1港×TE溶液朱、T4連接龍酶方法敬1、僅酶切反應困尖安對質(zhì)粒DN湯A的鑒定，遠只不過是質(zhì)蜓粒DNA換精為載體DN搬A。若大量蚊酶切，則成尿比例增加。籠在0.5m息lEpp光endor麗f管中加重悔蒸水6μl毛10×Bu菌ffer違1μl酶1姜μl混勻，男37°C水摸浴1h以上疑。牲取反應物點柏樣，觀察酶學切效果。泊酶切完全后堵，70°C槍5min賣終止反應。草2、曬加2倍體積離的預冷無水粉乙醇和1/屋10體積的奴3mol/車LNaA霧c混勻，-徒20°C2漫h以上。殼3、然離心150腰00rpm母×15mi能n,棄上清覽。趙4、摘加入75%劈乙醇洗滌2括次，離心棄引上清，真空辨抽干。池5、株加入適量1喬×TE溶解濾。如此可得喜線性化載體寸DNA。柏6、拾測定DNA劑的含量。鴉7、越加入線性載形體DNA和持含量3～4烏倍于載體的統(tǒng)待插入DN器A片段，連頁接緩沖液及番T4連接酶予適量至總體徐積為20μ級1，在12植～14°C食反應12～鑒16h。獄8、束連接反應液栗可置-20猴°C保存，劍供轉(zhuǎn)化用。提示：廉設立兩個對灶照反應：重只有質(zhì)粒載患體候只有外源D段NA片段扶如果外源D傾NA不足，思每個反應可而用50～1灣00ng質(zhì)荷粒DNA，償并盡可能多文加外源DN際A，同時保柱持連接反應漁體積不超過殘10ū1.奸可用至少3陽種不同方法籃來測定T4公噬菌體DN供A連接酶的倍活性。大多奧數(shù)制造廠商護（除New甲Engl蒸andB麥iolab勁s公司外）票現(xiàn)在都用單甩位（Wei猾ss等，1秒968）對皺該酶進行標忌化。1個W陜eiss單詠位相當于0尚.2個用外布切核酸酶耐股受試驗來定邁義的單位（創(chuàng)Modri君ch和Le合hman,走1970）判或者60個短粘端單位（頭如New億Engla慶ndBi菌olabs箭公司所定義下）。因此，蛇0.015泛Weis遇s單位的T邀4噬菌體D負NA連接酶膏均為濃溶液份（1～5單監(jiān)位/μl，隆可用20m煙mol/L織Tris寸·ClPh量7.6)、才60mmo獻l/L、5淚mmol/背L二硫蘇糖蠅醇、500休μg/ml價牛血清白蛋媽白、50%掠甘稀釋成1枝00單位、企ml的濃度緊置存。處于鐮這種濃度并竹在這種緩沖吳液中的T4柱噬體DNA熟連接酶于-踩20°C保再存3個月可冬保持穩(wěn)定?？葡鄬Χ裕钙蕉诉B接是筐低效反應，耽它要求以下失4個條件：脫低濃度（0助.5mmo喂l/L）的督ATP(F翻erret碎ti和Sg齊arane貢kka,1浴981)。誤不存在亞精夜胺一類的多雙胺。歇極高濃度的安連接酶（5仿0Weis執(zhí)s單位.算Ml）。筆高濃度的平催端。豬在反應混合月物中加入一界些可促進大肥分子群聚作衫用并可導致康DNA分子原凝聚成聚集拒體的物質(zhì)（幣凝聚體）、駕如聚乙二醇錢或氯化六氨辣合高鈷，可趙以使如何取布得適當濃度重的平端DN橋A的問題迎陣刃而解。在蘿連接反應中找，這些物質(zhì)馬具有兩個作藥用：（1）國它們可使平形端DNA的溝連接速率加燈大1～3個燙數(shù)量級，因垃此可使連接辦反應在酶和涌DNA濃度暗不高的條件眨下進行。（英2）它們可刃以改變連接緒產(chǎn)物的分布飼，分子內(nèi)連遣接受到抑制古，所形成的巾連接產(chǎn)物一旁律使分子間鐮連接的產(chǎn)物濤。這樣，即栗使在有利于童自身環(huán)化（耗j:i=1作0）的DN呆A濃度下，摟所有的DN荷A產(chǎn)物也將霸是線狀多聚顏體。突聚乙二醇（雜PEG80卷00）:嬌A迎：用去離子柄水配制成的言PEG8剝000儲存絮液（40%六）分裝成小拿份，冰凍保伐存，但加入剩連續(xù)反應混喇合物之前應殲將其融化并翅達到室溫。皆在含15%指PEG8湖000的連斤接反應混合欲物中，對連只接反應的刺擔激效應最為押顯著。除P采EG80罰00和T4鵝噬菌體DN飄A連接酶以落外，其他所腦有連接混合存物的組分應是于0°C混國合，然后加顛適當體積的孔PEG8臺000（處利于室溫），漏混勻，加酶納后于20°粗C進行溫育怪。孫B份：連接混合住物中含有0路.5mmo袖l/LA是TP和5m概mol/L疊Mgcl佳2堡時對連接反失應的刺激效由應最為顯著瀉，甚至AT扇P濃度略有覆增加或Mg恥cl牽2暴度略有降低黎，都會嚴重歸降低刺激的趕強度（Ph石eiffe槳r和Zim暗merma拌n,198焦3）。你C劈：濃度為1們5%的PE戒G800鐮0可刺激帶泉粘端的DN痛A分子的連撫接效率提高尚至原來的1能0～100訊倍，反應的椅主產(chǎn)物時串甲聯(lián)的多聯(lián)體屢。福搏Ⅳ嬸：PEG慰8000可赤刺激短至8科個核苷酸的傍合成寡聚物搶的平端連接摟，在這方面槳，它于氯化食六氨合高鈷釣有所不同。肉氯化六氨合史高鈷泥墾軟Ⅰ渠：氯化六氨蛙合高鈷可用鋪水配成10插mmol/利L貯存于-專20°C，尼它對連接反翁應的刺激具雀有高度的濃碼度信賴性。爪當連接反應匯混合物中鹽屯濃度為1.艘0～1.5修μmol/瓶L時，其刺鬧激作用最大領。氯化六氨嗓合高鈷可使仙平端連接的縫效率大約提慌高到原來的棒50倍，但聲只能使粘端裂連接的效率強提高到原來慶的5倍（R籍usche悉和Howa跪rd-Fl盼ander租s,198某5）。誓Ⅱ灘：在單價陽律離子（30芒mmol/錯LKCL置）存在下，純它對平端連浸接仍由一定見的刺激作用警，但此時連避接產(chǎn)物的分確布有所改變其。連接產(chǎn)物物不再使清一濃色的分子間乎連接產(chǎn)物，倒相反，環(huán)狀致DNA將占客盡優(yōu)勢。丟Ⅲ鼠：與PEG句8000名不同，氯化樸六氨合高鈷撈不能顯著提奮高合成寡核寺苷酸的連接絲速率。燃實驗誕五習、重組DN翅A的轉(zhuǎn)化目的：機學習用C尖a桿Cl抽2從法轉(zhuǎn)化感受努態(tài)丹E.col扛i吳的方法高，過并能進行外必源的DNA忍轉(zhuǎn)化訓，閑同時學會用神適合的條件綁對轉(zhuǎn)化細胞瓜進行篩選。原理：散體外連接的樸DNA分子番必須盡快引度入寄主細胞報，否則會很跟快降解，而響且只有導入植到細胞中后最，才能擴增收及研究其功習能的表達，慮細胞轉(zhuǎn)化是茄常用也是最慚有效的方法統(tǒng)之一，細菌訂轉(zhuǎn)化是指裸都露的（或純德化的）DN陰A被細菌吸爭收而導致基咽因轉(zhuǎn)移的現(xiàn)城象。凡是能酸吸收游離的拜DNA片段犬的細菌，稱防為感受態(tài)細芳菌，或者說航處于感受態(tài)催。大腸桿菌滾的感受態(tài)需役誘導。認將對數(shù)生長技期的細菌放族入偽0腔℃朗的CaCl暫2課低滲溶液中狹，細胞膨脹醒，形成原生齒質(zhì)球，誘導劣感受態(tài)；D寧NA加入后讓，形成抗D去Nase的永基磷酸鈣復扁合物，粘附慈于原生質(zhì)球起表面，咱42吧℃畏熱沖擊，D遷NA被吸收反，將細胞混要合物涂布于燒合適的（篩祥選）培養(yǎng)基股幾傾h我，細胞得以頃恢復和復壯苦，轉(zhuǎn)化基因鴉得以表達，叢然后根據(jù)合亮適的選擇條宿件可以區(qū)分咸轉(zhuǎn)化細胞和及非轉(zhuǎn)化細胞浸。材料賣標準質(zhì)粒D霜NA；重組話質(zhì)粒DNA樂；大腸桿菌稿JM109儀器渣超凈工作臺夫；高速冷凍百離心機；紫亞外分光光度鵝計；手提示鬧高壓滅菌鍋器皿授微量齒移液牽器；微量吸隱頭；培養(yǎng)皿馳；三角瓶；料離心管；微起量離心管；化微孔濾膜及古濾器試劑則LB培養(yǎng)基肢；0.1m憂ol/LC誕aCl2凳；努20mmo識l/LMg魯SO寸4桌；橫SOC培養(yǎng)漸基偵；磨SOB培養(yǎng)抱基贏；泥抗生素方法威從買37女℃練保存的新鮮陜平板中挑取剖一個大腸桿伴菌JM10隔9的單菌落為，作轉(zhuǎn)到一個含這有100m健olLB培場養(yǎng)基的類1L欲燒瓶中紗，圾37拒℃巷劇烈振搖培緊養(yǎng)約3敵h垮(160r煮pm)薄，粉為得到有效迷轉(zhuǎn)化,活細腫胞數(shù)不應超票過打10柏8當個細胞/匆ml戰(zhàn)，譽可每隔20度～30吉min薯測量OD凝600估值來監(jiān)測培蛇養(yǎng)物的生長觀情況摧。體在無菌條件唉下將細菌轉(zhuǎn)尿移到一個無崇菌、一次性秘使用的、用攏冰預冷的5擱0ml聚丙宜烯離心管中愿，監(jiān)沐浴10隱min扁,使培養(yǎng)物蕩冷卻至搏0飲℃覽。辭于傲4疏℃董離心400翼0rpm×店10窄min搬，以回收細從胞。瞞倒出培養(yǎng)液抄，將管倒置主1漸min貫以使最后殘搶留的痕量培炎養(yǎng)液流盡。賄以10ml芝用冰預冷的晝0.1mo耽l/LCa嬸Cl柴2拆重懸每份細貞胞沉淀,放雕置于冰浴上撈。駕于菜4覽℃鋒離心，40昆00rpm逝×10所min受，以回收細悔胞。倒出培誤養(yǎng)液，將管雨倒置1瓶min僵以使最后殘緞留的痕量培蛇養(yǎng)液流盡。羅每50ml怠初始培養(yǎng)物現(xiàn)用2ml冰色預冷的0.仿1mol/覺LCaCl此2振重懸每份細牛胞沉淀。離用冷卻的無您菌吸頭從每詠種感受態(tài)細欺胞懸液中各懇取200μ勸l轉(zhuǎn)移到無否菌的微量離填心管中，每嚷管加DNA世（體積小于貧等于10μ坐l，DNA遼小于等于5凍0ng）輕汪輕旋轉(zhuǎn)以混窄勻內(nèi)溶物，棄在冰中放置伍30麻min今。胖試驗中一定績要包括下面黨的對照：毒加入已知量字的標準朝螺絨旋質(zhì)粒DN解A制品的感革受態(tài)細胞。飾完全不加質(zhì)線粒DNA的德感受態(tài)細胞個。舉將管放到預里加溫到譯42令℃停的循環(huán)水浴的中放好的試脅管架上，恰缺恰90曬s曉，不要搖動宋試管。雹10、目快速將管轉(zhuǎn)茂移到水浴中關，使細胞冷組卻1～2射min兄。啦11、預每管加80題0μlSO際C培養(yǎng)基，閃用水浴將培割養(yǎng)基加溫至樂37半℃脅，然后將管略轉(zhuǎn)移到塊37汪℃斑搖床上，溫歌育45斃m(xù)in筒使細胞復蘇脹。穗12、堵將適當體積膚（每個奉90mm渡平板可達2版00μl）喇已轉(zhuǎn)化的感筍受態(tài)細胞轉(zhuǎn)壺移到含20邁mmol/明LMgSO藍4憑和相應抗生威素的SOB蠻瓊脂培養(yǎng)基屈上。如培養(yǎng)投物體積太小果（10μl棗），可再加般肉湯培養(yǎng)基效。用一個無盲菌的彎頭玻冶璃棒輕輕的茶將轉(zhuǎn)化的細疼胞涂到瓊脂帳平板表面。貞13、柳將平板置于魔室溫直至液傾體被吸收。名14、穗倒置平板，索于頌37萄℃裹培養(yǎng)，12鴿～16撒h臣后可出現(xiàn)菌醫(yī)落。提示：開1沸、暈所有的菌液撲涂皿操作，攔只需一根玻誠璃涂布棒，茄用95%酒罪精在火焰下述滅菌冷卻后欲即可用。在箭涂布過程中咱注意避免反醫(yī)復來回涂布脫。因為感受僚態(tài)的細胞壁錫有了變化，蛙過多的機械打擠壓涂布會注使細胞破裂換，影響轉(zhuǎn)化劈率。括2章、錫目前雖然對證轉(zhuǎn)化理論尚懶未有統(tǒng)一結(jié)批論，但是許鋸多實驗室的拿工作表明：陜（1）10喊0mmol饞/LCaC政l翅2除處理可獲得豬最高轉(zhuǎn)化率舟。允（2）菌體跑在溶液的p格H為6.0男時最適宜。輩（3）受體獄菌細胞與D齊NA混合培鏡養(yǎng)為1騎h遙最佳。釣（4）線性饒DNA存在忽抑制轉(zhuǎn)化在巧作用?？郑?）鋪平霜板條件會影繪響轉(zhuǎn)化率。露（6）受體劍菌對表面活田性劑非常敏異感，所用的菊玻璃離心管碼等用具必須年嚴格沖洗?？埽?）對不節(jié)同轉(zhuǎn)化菌株灶熱處理的效講應不一致。西3非、喉欲轉(zhuǎn)化的D嘩NA與細胞舊單混合后，翼一定要在冰濟浴條件下操方作，如果溫塑度時高時低奪，轉(zhuǎn)化效率泳將極差。線4鹽、鉛如果被轉(zhuǎn)化鞏的細菌為氨謝芐青霉素抗桐性，則在鋪肝平板時密度味應較低（每強個米90mm寸平板不超過敵10價4棕菌落）于蟻37℃開培養(yǎng)平板時花不應超過2并0旦h沈。氨芐青霉施素抗性的轉(zhuǎn)搖化體可將β么-內(nèi)酰胺酶廉分泌到培養(yǎng)貨基中，迅速堤滅活菌落周塊圍區(qū)域中的菌抗生素。這峰樣，鋪平板輸時密度太高遺或培養(yǎng)時間旦太長都會導向致出現(xiàn)對氨克芐青霉素敏寧感的衛(wèi)星菌響落。在選擇沒培養(yǎng)基中不么用氨芐青霉素素而改用羧兆芐青霉素，蛛以及將抗生膊素濃度從6奮0μg/m筋l增至10侵0μg/m削l,可使情日況有所改善嫌，