講義微生物基本操作規(guī)范采樣和取制樣

講義微生物基本操作規(guī)范采樣和取制樣第1頁(yè)/共42頁(yè)主要內(nèi)容：§1清洗、消毒和滅菌操作§2培養(yǎng)基的制備§3采樣和取、制樣§4接種、分離純化§5制片、染色及顯微觀察§6實(shí)驗(yàn)室安全基礎(chǔ)知識(shí)第2頁(yè)/共42頁(yè)§

3.采樣和取、制樣樣品的采樣和取、制樣是食品微生物檢驗(yàn)的重要組成部分。要得到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，必需正確掌握采樣技術(shù)、樣品傳遞、樣品保存方法和樣品的制備技術(shù)，保證樣品在從采樣到制樣整個(gè)過(guò)程中的一致性。如果樣品的采取、運(yùn)送、保存或制備過(guò)程中操作不當(dāng)，或者樣品不具有代表性，就會(huì)使實(shí)驗(yàn)室的微生物檢驗(yàn)結(jié)果毫無(wú)意義。對(duì)采樣人員和制樣人員提出了很高的專業(yè)要求，既要保證樣品的代表性和一致性，又要保證整個(gè)微生物檢驗(yàn)過(guò)程在無(wú)菌操作的條件下完成。第3頁(yè)/共42頁(yè)3.1采樣

采樣是指在一定質(zhì)量或數(shù)量的產(chǎn)品中，取一個(gè)或多個(gè)代表性樣品，用于微生物檢驗(yàn)的過(guò)程。樣品必須對(duì)采樣的整個(gè)產(chǎn)品或批量具有代表性。樣品的大小應(yīng)能滿足在需要時(shí)進(jìn)行重復(fù)分析的需要。第4頁(yè)/共42頁(yè)3.1.1采樣準(zhǔn)備工作1.采樣工具采樣工具要達(dá)到無(wú)菌的要求。對(duì)采樣工具和一些試劑材料應(yīng)提前準(zhǔn)備、滅菌。1）開(kāi)啟容器的工具：剪刀、刀子、開(kāi)罐器、鉗子等。雙層紙包裹滅菌（121℃，15min），干燥潔凈的環(huán)境中保存2個(gè)月。2）樣品采集工具：滅菌的鏟子、勺子、取樣器、鑷子、鋸子、刀子、剪子、壓舌板、木（電）鉆、打孔器、金屬試管和試子等。3）取樣容器：滅菌的廣口瓶或細(xì)口瓶，聚乙烯袋（瓶）、金屬試管或類似的密封金屬容器。最好不使用玻璃容器，運(yùn)輸中易碎。4）溫度計(jì)：-20℃~100℃，溫度間隔1℃。最好使用金屬或電子溫度計(jì)。使用前在70%~75%乙醇溶液或次氯酸鈉（濃度不小于100mg/L）中浸泡消毒（不小于30s）。第5頁(yè)/共42頁(yè)5)消毒劑：70%~75%乙醇溶液、中等濃度（100mg/L）次氯酸鈉溶液等。6）標(biāo)記工具：標(biāo)簽紙（不干膠標(biāo)簽紙）、油性或不可擦拭記號(hào)筆。7）樣品運(yùn)輸工具：便攜式冰箱或保溫箱。8）天平：最大量程為2000g，感量為0.1g。9）攪拌器和混合器：必要時(shí)配備帶有滅菌灌的攪拌器或混合器。10）稀釋液：滅菌的磷酸鹽緩沖液、0.1%蛋白胨水、生理鹽水以及其他稀釋液如腦心浸液肉湯、M肉湯、LB肉湯等。11）防護(hù)用品：對(duì)樣品的防護(hù)。即保護(hù)生產(chǎn)環(huán)境、原料和成品等不會(huì)在取樣過(guò)程中被污染，同樣也保護(hù)樣品不被污染。工作服、工作帽、口罩、雨鞋、手套等。事先消毒滅菌（或使用一次性無(wú)菌物品)。第6頁(yè)/共42頁(yè)應(yīng)根據(jù)不同的樣品特征和采樣環(huán)境，對(duì)采樣物品和試劑進(jìn)行事先準(zhǔn)備和滅菌等工作。實(shí)驗(yàn)室的工作人員進(jìn)入車間采樣時(shí)，必須更換工作服，避免將實(shí)驗(yàn)室的菌體帶入加工環(huán)境，造成加工過(guò)程的污染。第7頁(yè)/共42頁(yè)2.采樣方案

微生物檢驗(yàn)的特點(diǎn)是一個(gè)以小份樣品的檢測(cè)結(jié)果來(lái)說(shuō)明一大批食品衛(wèi)生質(zhì)量，因此，用于分析的樣品的代表性至關(guān)重要，也即樣品的數(shù)量、大小和性質(zhì)對(duì)結(jié)果判定產(chǎn)生重大影響。要保證樣品的代表性首先要有一套科學(xué)的采樣方案，其次使用正確的采樣技術(shù)，并在樣品的保存和運(yùn)輸過(guò)程中保持樣品的原有狀態(tài)。一般說(shuō)來(lái)，進(jìn)出口貿(mào)易合同對(duì)食品采樣量有明確規(guī)定的，按合同規(guī)定采樣；進(jìn)出口貿(mào)易合同沒(méi)有具體采樣規(guī)定的，可根據(jù)檢驗(yàn)的目的，產(chǎn)品及被抽樣品批的性質(zhì)和分析方法的性質(zhì)確定采樣方案。目前的采樣方案多為ICMSF推薦的采樣方案和隨機(jī)采樣方案。無(wú)論采取何種方法采樣，每批貨物的采樣數(shù)量不得少于5件。對(duì)于需要檢驗(yàn)沙門氏菌的食品，采樣數(shù)量應(yīng)適當(dāng)增加，最低不少于8件。第8頁(yè)/共42頁(yè)1)采樣的術(shù)語(yǔ)批量貨物：數(shù)量確定的貨物，品質(zhì)必須均勻一致。抽檢貨物：從批量貨中的一個(gè)位置取出的少量貨物?；旌县洏樱簵l件允許，從某一特定批量采樣、混合，即為混合貨樣，亦即大樣。樣品單位：從監(jiān)督總體中抽取用于檢驗(yàn)的樣品中的單位產(chǎn)品。樣品量：樣品中所包含的樣品單位數(shù)。合格判定數(shù)：在計(jì)數(shù)采樣檢查中，對(duì)接收批的樣品允許出現(xiàn)的缺陷數(shù)或不合格品數(shù)的上限值，合格判定數(shù)又稱可接受數(shù)。批：一批產(chǎn)品中或特定階段或時(shí)間內(nèi)代表相同質(zhì)量樣品的單元數(shù)。第9頁(yè)/共42頁(yè)隨機(jī)采樣：在一批產(chǎn)品中，每個(gè)樣品或單元都有同樣被選擇的機(jī)會(huì)。這種采樣方法被稱為隨機(jī)采樣。采樣時(shí)常需要查閱隨機(jī)數(shù)字表。代表性樣品：廣義上講是指能夠代表一個(gè)批的樣品，而不是僅代表其中的一部分。要獲得代表性樣品需要以下四個(gè)條件：確定整批產(chǎn)品的采樣點(diǎn)；建立能夠代表整個(gè)產(chǎn)品特征的采樣方法；選擇樣品大小；規(guī)定采樣的頻率。第10頁(yè)/共42頁(yè)2）采樣原則(1)根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康?、食品特點(diǎn)、批量、檢驗(yàn)方法、微生物的危害程度等確定采樣方案;(2)應(yīng)采用隨機(jī)原則進(jìn)行采樣，確保所采集的樣品具有代表性;(3)采樣過(guò)程遵循無(wú)菌操作程序，防止一切可能的外來(lái)污染；(4)樣品在保存和運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中，應(yīng)采取必要的措施防止樣品中原有微生物的數(shù)量變化，保持樣品的原有狀態(tài)。

第11頁(yè)/共42頁(yè)3）采樣方案的類型依據(jù)GB4789.1-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則》(1)類型采樣方案分為二級(jí)和三級(jí)采樣方案。二級(jí)采樣方案設(shè)有n、c和m值，三級(jí)采樣方案設(shè)有n、c、m和M值。第12頁(yè)/共42頁(yè)

n：同一批次產(chǎn)品應(yīng)采集的樣品件數(shù)；

c：最大可允許超出m值的樣品數(shù)；

m：微生物指標(biāo)可接受水平的限量值；

M：微生物指標(biāo)的最高安全限量值。

注1：按照二級(jí)采樣方案設(shè)定的指標(biāo)，在n個(gè)樣品中，允許有≤c個(gè)樣品其相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗(yàn)值大于m值。

注2：按照三級(jí)采樣方案設(shè)定的指標(biāo)，在n個(gè)樣品中，允許全部樣品中相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗(yàn)值小于或等于m值；允許有≤c個(gè)樣品其相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗(yàn)值在m值和M值之間；不允許有樣品相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗(yàn)值大于M值。第13頁(yè)/共42頁(yè)

例如：n=5，c=2，m=100CFU/g，M=1000CFU/g。含義是從一批產(chǎn)品中采集5個(gè)樣品，若5個(gè)樣品的檢驗(yàn)結(jié)果均小于或等于m值（≤100CFU/g），則這種情況是允許的；若≤2個(gè)樣品的結(jié)果（X）位于m值和M值之間（100CFU/g<X≤1000CFU/g），則這種情況也是允許的；若有3個(gè)及以上樣品的檢驗(yàn)結(jié)果位于m值和M值之間，則這種情況是不允許的；若有任一樣品的檢驗(yàn)結(jié)果大于M值（>1000CFU/g），則這種情況也是不允許的。第14頁(yè)/共42頁(yè)（2）各類食品的采樣方案

按相應(yīng)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)定執(zhí)行。（3）食源性疾病及食品安全事件中食品樣品的采集

由工業(yè)化批量生產(chǎn)加工的食品污染導(dǎo)致的食源性疾病或食品安全事件，食品樣品的采集和判定原則按以上的（1）和（2）執(zhí)行。同時(shí)，確保采集現(xiàn)場(chǎng)剩余食品樣品。由餐飲單位或家庭烹調(diào)加工的食品導(dǎo)致的食源性疾病或食品安全事件，食品樣品的采集按GB14938中衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)的要求，以滿足食源性疾病或食品安全事件病因判定和病原確證的要求。

第15頁(yè)/共42頁(yè)4）ICMSF采樣方案簡(jiǎn)介國(guó)際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（ICMSF）所建議的采樣計(jì)劃是目前世界各國(guó)在食品微生物工作中常用的采樣方案。ICMSF提出的采樣基本原則根據(jù)：

a)各種微生物本身對(duì)人的危害程度各有不同。

b）食品經(jīng)不同條件處理后，其危害度變化情況：①降低危害度；②危害度未變；③增加危害度，來(lái)設(shè)定采樣方案并規(guī)定其不同采樣數(shù)。第16頁(yè)/共42頁(yè)ICMSF的采樣方法

有些實(shí)驗(yàn)室在每批產(chǎn)品中，僅采一個(gè)檢樣進(jìn)行檢驗(yàn)，該批產(chǎn)品是否合格，全憑這個(gè)檢樣來(lái)決定。ICMSF方法與此不同，它是從統(tǒng)計(jì)學(xué)原理來(lái)考慮，對(duì)一批產(chǎn)品，檢查多少檢樣，才能夠有代表性，才能客觀地反映出該產(chǎn)品的質(zhì)量而設(shè)定的。

ICMSF方法中包括二級(jí)法及三級(jí)法兩種。二級(jí)法只設(shè)有n、с及m值，三級(jí)法則有n、c、m及M值。M即附加條件后判定合格的菌數(shù)限量。第17頁(yè)/共42頁(yè)（1）二級(jí)采樣方案自然界中材料的分布曲線一般是正態(tài)分布，以其一點(diǎn)作為食品微生物的限量值，只設(shè)合格判定標(biāo)準(zhǔn)m值，超過(guò)m值的，則為不合格品。檢查在檢樣是否有超過(guò)m值的，來(lái)判定該批是否合格。例如生食海產(chǎn)品魚(yú)的副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)為n=5，c=0，m=102，n=5即采樣5個(gè)，c=0即意味著在該批檢樣中，未見(jiàn)到有菌落數(shù)超過(guò)m值的檢樣，此批貨物為合格品。第18頁(yè)/共42頁(yè)（2）三級(jí)采樣方案設(shè)有微生物標(biāo)準(zhǔn)m及M值兩個(gè)限量如同二級(jí)法，超過(guò)m值的檢樣，即算為不合格品。其中以m值到M值的范圍內(nèi)的檢樣數(shù)，作為c值，如果在此范圍內(nèi)，即為附加條件合格，超過(guò)M值者，則為不合格。例如：冷凍生蝦的細(xì)菌總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)n=5，c=3，m=101，M=102，其意義是從一批產(chǎn)品中，取5個(gè)檢樣，經(jīng)檢樣結(jié)果允許≤3個(gè)檢樣的菌落數(shù)是在m和M值之間。如果有3個(gè)以上檢樣的菌落數(shù)是在m和M值之間或一個(gè)檢樣菌落數(shù)超過(guò)M值者，則判定該批產(chǎn)品為不合格品。第19頁(yè)/共42頁(yè)（3）ICMSF對(duì)食品中微生物的危害度分類與采樣方案說(shuō)明為了強(qiáng)調(diào)采樣與檢樣之間的關(guān)系，ICMSF已經(jīng)闡述了把嚴(yán)格的采樣方案與食品危害程度相聯(lián)系的概念（ICMSF，1986）。在中等或嚴(yán)重危害的情況下使用二級(jí)采樣方案，對(duì)健康危害低的則建議使用三級(jí)采樣方案。

ICMSF是將微生物的危害度、食品的特性及處理?xiàng)l件三者綜合在一起進(jìn)行食品中微生物危害度分類的。這個(gè)設(shè)想是很科學(xué)的，符合實(shí)際情況的，對(duì)生產(chǎn)廠及消費(fèi)者來(lái)說(shuō)都是比較合理的。下面結(jié)合表1加以說(shuō)明。第20頁(yè)/共42頁(yè)表1、ICMSF按微生物的危害度及食品處理進(jìn)行情況分類

級(jí)別危害程度對(duì)象微生物食品經(jīng)不同處理后的危害度減少（加熱）無(wú)變化（冷凍品立刻進(jìn)食）增加危害度（未加熱吃到吃前還有一段時(shí)間）

三級(jí)方案1.食品的保藏2.輕度間接指標(biāo)菌3.中度程度局部傳播菌落總數(shù)大腸菌群、大腸桿菌金黃色葡萄球菌（指標(biāo)菌）金黃色葡萄球菌蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)氣莢膜梭菌例1n=5c=3例4n=5c=3

例7n=5c=2例2n=5c=2例5n=5c=2

例8n=5c=1例3n=5c=1例6n=5c=1

例9n=10c=1二級(jí)方案4.中度程度廣泛傳播5.嚴(yán)重程度沙門氏菌副溶血性弧菌致病性大腸桿菌肉毒梭菌、霍亂弧菌傷寒沙門氏菌副傷寒沙門氏菌例10n=5c=0例13n=15c=0例11n=10c=0例14n=30c=0例12n=20c=0例15n=60c=0注：1.表中“減少”系指食品經(jīng)加熱殺死污染的細(xì)菌。

2.“無(wú)變化”系指微生物數(shù)不增減例如冷凍食品或干燥食品。

3.“增加”系指將食品保存在不良環(huán)境中使微生物易于繁殖和產(chǎn)毒。

4.n：一批產(chǎn)品采樣個(gè)數(shù)。c：該批產(chǎn)品的樣品菌落數(shù)中，超過(guò)限量的檢樣數(shù)。第21頁(yè)/共42頁(yè)

根據(jù)表1中15種情況的舉例，1-3可用三級(jí)法，4-5可用二級(jí)法來(lái)判定是否合格。

考慮到以上15種情況，分別設(shè)定不同的取樣數(shù)及檢樣污染數(shù)，在1-9例中檢樣需采5個(gè)（n=5），而污染檢樣數(shù)設(shè)定為c=3，2，1。在10-15例用二級(jí)法則不得檢出該致病菌c=0。例如冷凍食品，細(xì)菌數(shù)按例2，大腸菌按例5，金黃色葡萄球菌按例8，沙門氏菌按例11的二級(jí)法判定。

對(duì)食品處理應(yīng)酌情考慮，例如生肉火腿中的金黃色葡萄球菌，被腐敗菌所抑制，不易發(fā)生食物中毒，適用例7和例8。烹調(diào)加工后的熟肉，對(duì)腐敗菌沒(méi)有抵抗力，則易發(fā)生食物中毒，適用例9。加熱鹽腌的火腿，水分活性為0.86以下，金黃色葡萄球菌有增殖的可能性，因此適用例9。沙門氏菌水活性在0、94以下不能繁殖，適用例11，如上所述，應(yīng)根據(jù)各種食品的危害度進(jìn)行設(shè)定。第22頁(yè)/共42頁(yè)

ICMSF方法是以二級(jí)法、三級(jí)法和抽樣的概念為基礎(chǔ)，再將微生物的知識(shí)加進(jìn)來(lái)，則可以提出各種食品的微生物標(biāo)準(zhǔn)。如表2。為了安全，冷凍生蝦加熱吃，減少危害度適用例1、4、10。冷凍加工蝦，為了不加熱就食，在解凍中有增強(qiáng)危害度的可能性，適用例3、6、9、12，對(duì)象微生物特別指定金黃色葡萄球菌腸毒素，兩者雖菌數(shù)限量是相同的，但情況有所不同，分別適用c=3，c=1，因此不依靠菌數(shù)限量，而用合格率來(lái)控制。第23頁(yè)/共42頁(yè)表2、ICMSF蝦的微生物標(biāo)準(zhǔn)食品名稱檢查項(xiàng)目例級(jí)別nc菌數(shù)限量/gmM冷凍生蝦

冷凍烹調(diào)蝦細(xì)菌數(shù)大腸菌群金黃色葡萄球菌副溶血性弧菌細(xì)菌數(shù)大腸菌群金黃色葡萄球菌副溶血性弧菌144103691233323332555555553330111010641031021064103102

1074002×103—1074002×103—注：n：一批產(chǎn)品采樣個(gè)數(shù)。

c：該批產(chǎn)品的檢樣菌數(shù)中，超過(guò)限量的檢樣數(shù)，即結(jié)果超過(guò)合格菌數(shù)限量的最大允許數(shù)。

m：合格菌數(shù)限量，將可接受與不可接受的數(shù)量區(qū)別開(kāi)。

M：附加條件，判定為合格的菌數(shù)限量，表示邊緣的可接受數(shù)與邊緣的不可接受數(shù)之間的界限。第24頁(yè)/共42頁(yè)5）隨機(jī)采樣方案在現(xiàn)場(chǎng)采樣時(shí)，可利用隨機(jī)采樣表進(jìn)行隨機(jī)采樣。隨機(jī)采樣表（SN0330-1994《出口食品中微生物檢驗(yàn)通則》系用計(jì)算機(jī)隨機(jī)編制而成，包括一萬(wàn)個(gè)數(shù)字。其使用方法如下：

a.先將一批產(chǎn)品的各單位產(chǎn)品（如箱、包、盒等）按順序編號(hào)。如將一批600包的產(chǎn)品編為1、2……600。

b.隨意在表上點(diǎn)出一個(gè)數(shù)。查看該數(shù)字所在的行和列。如點(diǎn)在第48行、第10列的數(shù)字上。

c.根據(jù)單位產(chǎn)品編號(hào)的最大位數(shù)（如A1，最大為三位數(shù)），查出所在行的連續(xù)列數(shù)字（如A2所點(diǎn)數(shù)為第48行、第10、11和12列，其數(shù)字為245），則編號(hào)與該數(shù)相同的那一份單位產(chǎn)品，即為一件應(yīng)抽取的樣品。

d.繼續(xù)查下一行的相同連續(xù)列數(shù)字（如按A3、即第49行的第10、11和12列的數(shù)字，為608）。該數(shù)字所代表的單位產(chǎn)品為另一件應(yīng)抽取的樣品。

e.依次按A4所述方法查下去。當(dāng)遇到所查數(shù)超過(guò)最大編號(hào)數(shù)量（如第50行的第10、11和12列的數(shù)字為931、大于600）則舍去此數(shù)，繼續(xù)查下一行相同列數(shù)，直到完成應(yīng)抽樣品件數(shù)為止。第25頁(yè)/共42頁(yè)3.1.2采樣方法

確定了采樣方案以后，采樣方法對(duì)采樣方案的有效執(zhí)行和保證樣品的有效性代表性至關(guān)重要。采樣必須遵循無(wú)菌操作程序，采樣工具如整套不銹鋼勺子、鑷子、剪刀等應(yīng)當(dāng)高壓滅菌，防止一切可能的外來(lái)污染。容器必需清潔、干燥、防漏、廣口、滅菌，大小適合盛放檢樣。采樣全過(guò)程中，應(yīng)采取必要的措施防止食品中固有微生物的數(shù)量和生長(zhǎng)能力發(fā)生變化。確定檢驗(yàn)批，應(yīng)注意產(chǎn)品的均質(zhì)性和來(lái)源，確保檢樣的代表性。第26頁(yè)/共42頁(yè)各類食品的采樣方法采樣應(yīng)遵循無(wú)菌操作程序，采樣工具和容器應(yīng)無(wú)菌、干燥、防漏，形狀及大小適宜。1．即食類預(yù)包裝食品：取相同批次的最小零售原包裝，檢驗(yàn)前要保持包裝的完整，避免污染。2．非即食類預(yù)包裝食品

：原包裝小于500g的固態(tài)食品或小于500mL的液態(tài)食品，取相同批次的最小零售原包裝；大于500mL的液態(tài)食品，應(yīng)在采樣前搖動(dòng)或用無(wú)菌棒攪拌液體，使其達(dá)到均質(zhì)后分別從相同批次的n個(gè)容器中采集5倍或以上檢驗(yàn)單位的樣品；大于500g的固態(tài)食品，應(yīng)用無(wú)菌采樣器從同一包裝的幾個(gè)不同部位分別采取適量樣品，放入同一個(gè)無(wú)菌采樣容器內(nèi),采樣總量應(yīng)滿足微生物指標(biāo)檢驗(yàn)的要求。第27頁(yè)/共42頁(yè)3．散裝食品或現(xiàn)場(chǎng)制作食品：

根據(jù)不同食品的種類和狀態(tài)及相應(yīng)檢驗(yàn)方法中規(guī)定的檢驗(yàn)單位，用無(wú)菌采樣器現(xiàn)場(chǎng)采集5倍或以上檢驗(yàn)單位的樣品，放入無(wú)菌采樣容器內(nèi),采樣總量應(yīng)滿足微生物指標(biāo)檢驗(yàn)的要求。4．食源性疾病及食品安全事件的食品樣品

采樣量應(yīng)滿足食源性疾病診斷和食品安全事件病因判定的檢驗(yàn)要求。第28頁(yè)/共42頁(yè)3.2樣品的標(biāo)記和運(yùn)輸應(yīng)對(duì)采集的樣品進(jìn)行及時(shí)、準(zhǔn)確的記錄和標(biāo)記，采樣人應(yīng)清晰填寫(xiě)采樣單（包括采樣人、采樣地點(diǎn)、時(shí)間、樣品名稱、來(lái)源、批號(hào)、數(shù)量、保存條件等信息）。3.2.1樣品的標(biāo)記

（1）所有盛樣容器必須有和樣品一致的標(biāo)記。在標(biāo)記上應(yīng)記明產(chǎn)品標(biāo)志與號(hào)碼和樣品順序號(hào)以及其他需要說(shuō)明的情況。標(biāo)記應(yīng)牢固，具防水性，字跡不會(huì)被擦掉或脫色。（2）當(dāng)樣品需要托運(yùn)或由非專職采樣人員運(yùn)送時(shí)，必須封識(shí)樣品容器。第29頁(yè)/共42頁(yè)3.2.2樣品的保存和運(yùn)送

（1）采樣后，應(yīng)將樣品在接近原有貯存溫度條件下盡快送往實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。運(yùn)輸時(shí)應(yīng)保持樣品完整。如不能及時(shí)運(yùn)送，應(yīng)在接近原有貯存溫度條件下貯存。例如冷凍樣品應(yīng)存放在-15℃以下冰箱或冷藏庫(kù)內(nèi)；冷卻和易腐食品存放在0-4℃冰箱或冷卻庫(kù)內(nèi)；其他食品可放在常溫冷暗處。（2）運(yùn)送冷凍和易腐食品應(yīng)在包裝容器內(nèi)加適量的冷卻劑或冷凍劑。保證途中樣品不升溫或不融化。必要時(shí)可于途中補(bǔ)加冷卻劑或冷凍劑。（3）如不能由專人攜帶送樣時(shí)，也可托運(yùn)。托運(yùn)前必須將樣品包裝好，應(yīng)能防破損，防凍結(jié)或防易腐和冷凍樣品升溫或融化。在包裝上應(yīng)注明“防碎”、“易腐”、“冷藏”等字樣。（4）作好樣品運(yùn)送記錄，寫(xiě)明運(yùn)送條件、日期、到達(dá)地點(diǎn)及其他需要說(shuō)明的情況，并由運(yùn)送人簽字。3.2.3.2保存方法聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)推薦的樣品保存方式可作參考。第30頁(yè)/共42頁(yè)3樣品的制備3.3.1樣品檢驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)室樣品的制備是微生物檢驗(yàn)的重要環(huán)節(jié)，是獲得較高準(zhǔn)確性和良好檢驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)。3.3.1.1樣品處理

1）實(shí)驗(yàn)室接到送檢樣品后，應(yīng)認(rèn)真核對(duì)登記，確保樣品的相關(guān)信息完整并符合檢驗(yàn)要求。

2）實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按要求盡快檢驗(yàn)。若不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)采取必要的措施保持樣品的原有狀態(tài)，防止樣品中目標(biāo)微生物因客觀條件的干擾而發(fā)生變化。

3）冷凍食品應(yīng)在45℃以下不超過(guò)15min，或2℃~5℃不超過(guò)18h解凍后進(jìn)行檢驗(yàn)。第31頁(yè)/共42頁(yè)3.3.1.2檢驗(yàn)方法的選擇

GB4789.1-2010要求:1）應(yīng)選擇現(xiàn)行有效的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法。

2）食品微生物檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)同一檢驗(yàn)項(xiàng)目有兩個(gè)及兩個(gè)以上定性檢驗(yàn)方法時(shí)，應(yīng)以常規(guī)培養(yǎng)方法為基準(zhǔn)方法。

3）食品微生物檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)同一檢驗(yàn)項(xiàng)目有兩個(gè)及兩個(gè)以上定量檢驗(yàn)方法時(shí)，應(yīng)以平板計(jì)數(shù)法為基準(zhǔn)方法。第32頁(yè)/共42頁(yè)GB/T4789.17~25-2003中分別規(guī)定了肉與肉制品、乳與乳制品、蛋與蛋制品、水產(chǎn)食品、清涼飲料、調(diào)味品、冷食菜和豆制品、糖果和糕點(diǎn)及果脯、酒類的樣品的制備方法。以上標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定使用的稀釋劑均為無(wú)菌蒸餾水或生理鹽水，大多數(shù)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)也主要使用這兩種稀釋劑，而且對(duì)待檢樣品的制備方式相當(dāng)單一。反映出我國(guó)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)比較滯后，缺乏先進(jìn)性，微生物樣品制備的方法在實(shí)際應(yīng)用中針對(duì)性差，操作性不強(qiáng)。第33頁(yè)/共42頁(yè)

由于食品種類繁多，在實(shí)際微生物檢驗(yàn)中盡可能采用統(tǒng)一的樣品制備方法。對(duì)于許多特殊產(chǎn)品，由于產(chǎn)品本身的物理狀態(tài)（如干品、粘稠度高的產(chǎn)品等）、樣品中抑制劑存在（如大蒜制品、洋蔥制品、咸魚(yú)等）或酸性等原因，需要采用特殊的樣品制備方法。包括：

1）調(diào)整食品稀釋液的pH至中性；

2）對(duì)于含高抑制物質(zhì)（成分）的產(chǎn)品（如大蒜制品、洋蔥制品等）或所含微生物受損的產(chǎn)品（如酸性食品、鹽漬食品、干制食品等），使用緩沖蛋白胨水或其他稀釋劑（如D/E中和肉湯、腦心浸液肉湯等）；

3）對(duì)于低水分活度的食物，需要采取特殊復(fù)水程序；第34頁(yè)/共42頁(yè)4）調(diào)整適當(dāng)溫度和靜置時(shí)間，以利于可可粉、明膠、奶粉等樣品的懸浮；5）對(duì)于來(lái)自食物加工或貯存過(guò)程中的受損微生物，需要采取特殊復(fù)蘇程序；6）某些產(chǎn)品（如谷物）和（或）目標(biāo)菌（如酵母菌和霉菌）的特殊均質(zhì)程序及均質(zhì)時(shí)間；7）對(duì)于高脂肪食品，使用表面活性劑（如1g/L到10g/L聚山梨醇酯80），促進(jìn)懸浮過(guò)程中的乳化作用。第35頁(yè)/共42頁(yè)3.3.2稀釋液的選擇3.3.2.1常用和特殊稀釋液常用稀釋液包括：0.85%生理鹽水、緩沖蛋白胨水（BPW）、0.1%蛋白胨水、磷酸鹽緩沖溶液、無(wú)菌蒸餾水等。特殊稀釋液包括：D/E中和肉湯、LB肉湯、M肉湯等。最合適的稀釋液應(yīng)該通過(guò)一系列的試驗(yàn)得到，所選擇的稀釋液應(yīng)該具有最高的復(fù)蘇率。第36頁(yè)/共42頁(yè)3.3.2.2厭氧微生物的稀釋液應(yīng)使用具有抗氧化作用的培養(yǎng)基作為稀釋液。制備樣品懸液時(shí)應(yīng)盡量避免氧氣進(jìn)入，使用袋式拍擊式均質(zhì)器。配備一些特殊的樣品防護(hù)措施，如厭氧工作站等。3.3.2.3嗜滲菌和嗜鹽菌的稀釋液