親和色譜和超臨界流體色譜演示文稿

親和色譜和超臨界流體色譜演示文稿目前一頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點親和色譜和超臨界流體色譜目前二頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點概述生物分子能夠區(qū)分結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常接近的其他分子，選擇性地與其中某一種分子相結(jié)合，生物分子間的這種特異性相互作用稱為親和作用。靜電作用、氫鍵等多種作用力對親和作用具有影響。生物分子間的親和識別包括抗體-抗原、酶-底物、激素-受體等親和作用。在眾多親和分離技術(shù)中，親和色譜是應(yīng)用最多，分離效果最好的技術(shù)。目前三頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點常見親合作用體系特異性親和體系高特異性抗原-單克隆抗體荷爾蒙－受體蛋白核酸－互補堿基鏈段、核酸結(jié)合蛋白酶－底物、產(chǎn)物、抑制劑群特異性免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白酶－輔酶凝集素－糖、糖蛋白、細胞、細胞表面受體酶、蛋白質(zhì)-肝素酶、蛋白質(zhì)-活性色素（染料）酶、蛋白質(zhì)-過渡金屬離子（銅、鋅等）酶、蛋白質(zhì)－氨基酸（組氨酸等）目前四頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點目前五頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點1、離子強度：一般來說，提高離子強度，親和作用減弱或完成破壞。2、pH：在適當(dāng)?shù)膒H下，親和結(jié)合作用較高，在其它pH下，親和作用減弱或完成破壞。3、抑制氫鍵形成的物質(zhì)：脲和鹽酸胍的存在可減弱親和作用4、溫度：提高溫度，靜電作用、氫鍵、配位鍵減弱；但是，疏水性相互作用增強5、液體離子：SCN-、I-、ClO4-的存在，疏水性相互作用減弱6、螯合劑：影響配位鍵，使親和作用消失影響親和作用的因素目前六頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點利用生物分子之間的專一性識別或特定的相互作用進行分離的技術(shù)為親和分離技術(shù)親和配基是對生物分子具有專一性識別或特定的相互作用的物質(zhì)目前七頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點8找與底物專一可逆結(jié)合的配基；將配基通過共價鍵偶聯(lián)到基質(zhì)；配基與底物吸附；洗脫目標(biāo)物。

目前八頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點9親和純化技術(shù)親和層析(Affinitychromatography)親和過濾（膜分離）親和分配（雙水相萃?。┯H和反膠團萃?。ǚ茨z團萃?。┯H和沉淀（沉淀）親和電泳（電泳）目前九頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點配基生物特異性配基擬生物親和配基親和配基必須具備的條件：1、專一性識別或特異性作用必須是可逆的2、結(jié)合常數(shù)要適當(dāng)3、穩(wěn)定性好，可進行化學(xué)改性目前十頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點專一性和特異性決定著分離純化的產(chǎn)品純度相互作用的強弱決定著吸附和解吸的難易程度目前十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點親和配基的分類單專一性的小分子配基基團專一性的小分子親和配基專一性的大分子親和配基免疫親和配基基團專一性的大分子親和配基目前十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點親和配基的選擇組合化學(xué)肽庫選擇親和配基目標(biāo)肽→反義肽→組合合成→親和篩選→優(yōu)選序列噬菌體展示技術(shù)目標(biāo)蛋白→可結(jié)合噬菌體→擴增→多輪篩選單克隆群體→氨基酸序列SELEX技術(shù)隨機序列→PCR擴增→特異性結(jié)合→重復(fù)篩選目前十三頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點親和洗脫目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫方法有特異性洗脫和非特異性洗脫。特異性洗脫劑含有與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物具有親和結(jié)合作用的小分子化合物，通過與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物的競爭性結(jié)合，洗脫目標(biāo)產(chǎn)物。非特異性洗脫通過調(diào)節(jié)洗脫液的pH、離子強度、離子種類或溫度等降低目標(biāo)產(chǎn)物的親和吸附作用。目前十四頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點親和色譜親和層析(AffinityChromatography，AC)是利用生物大分子具有對一類生物大分子特異識別和可逆結(jié)合的特性而建立起來的一種分離的色譜方法，也叫做生物親和或生物特異性親和色譜。是親和分離技術(shù)中最具優(yōu)勢的方法目前十五頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點含配體溶液收集目的蛋白

洗下未結(jié)合的蛋白混合蛋白樣品平衡液帶有配體的樹脂珠（或膠粒）目前十六頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點目前十七頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點親和層析的基本特點1、純化過程簡單、迅速，且分離效率高2、特別適用于分離純化一些含量低、穩(wěn)定性差的生物大分子3、純化倍數(shù)大，產(chǎn)物純度高4、必須針對某一分離對象制備專一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件5、價格相對較昂貴；6、在洗脫中，交聯(lián)在層析介質(zhì)上的配基可能脫落并進入產(chǎn)品中，從而造成不良影響，如抗體、染料等配基。目前十八頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點基質(zhì)的選擇理想的基質(zhì)應(yīng)符合下面的要求：1．極低的非特異性吸附。2．高度的親水性。3．較好的理化穩(wěn)定性。4．大量的化學(xué)基團能被有效地活化，而且容易和配體結(jié)合。5．適當(dāng)?shù)亩嗫仔浴Ｒ话阌H和吸附劑采用的基質(zhì)有纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、交聯(lián)瓊脂糖、多孔玻璃珠等。親和色譜介質(zhì)的制備目前十九頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點配基的選擇

根據(jù)配體對待分離物質(zhì)的親和性的不同，可以將其分為兩類：特異性配體（specificligand）和通用性配體（generalligand）。特異性配體一般是指只與單一或很少種類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體。如生物素和親和素、抗原和抗體、酶和它的抑制劑、激素－受體等，它們結(jié)合都具有很高的特異性，用這些物質(zhì)作為配體都屬于特異性配體。配體的特異性是保證親和層析高分辨率的重要因素，但尋找特異性配體一般是比較困難的，尤其對于一些性質(zhì)不很了解的生物大分子，要找到合適的特異性配體通常需要大量的實驗。

目前二十頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點

通用性配體一般是指特異性不是很強，能和某一類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體，如各種凝集素（lectine）可以結(jié)合各種糖蛋白，核酸可以結(jié)合RNA的蛋白質(zhì)等。通用性配體對生物大分子的專一性雖然不如特異性配體，但通過選擇合適的洗脫條件也可以得到很高的分辨率。而且這些配體還具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、偶聯(lián)率高、吸附容量高、易于洗脫、價格便宜等優(yōu)點，所以在實驗中得到了廣泛的應(yīng)用。

目前二十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點22配基的濃度

對親和勢比較低的時候（KL≥10-4mol/L），增加配基濃度有利于吸附。增加親和柱的長度來提高吸附率。配基濃度太高使吸附力太強，洗脫困難。理想的配基濃度為1-10μmol/L。目前二十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點23配基偶聯(lián)的位置配基固定化時，其不參與親和結(jié)合的部位與載體進行偶聯(lián)。腺嘌呤N6-氨基接到載體上，對脫氫酶和甘油激酶有吸附力。磷酸基接到載體上，對甘油醛-3-磷酸脫氫酶有吸附力。目前二十三頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點24配基分子的大小

選用大分子配基。小分子物質(zhì)作為配基，載體和配基間插入一個“手臂”以消除空間障礙。目前二十四頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點親和吸附介質(zhì)的配基

（1）酶的抑制劑一些物質(zhì)，它們并不引起酶蛋白變性，但能使酶分子上的某些必需基團（主要是指酶活性中心上的一些基團）發(fā)生變化，因而引起酶活力下降，甚至喪失，致使酶反應(yīng)速度降低，能引起這類抑制作用的物質(zhì)稱為酶的抑制劑（inhibitor）。在生物體內(nèi)蛋白酶的抑制劑可與蛋白酶的活性部位結(jié)合，抑制酶的活性，必要時保護生物組織不受蛋白酶的損害。酶的抑制劑在分子大小和形態(tài)上分布較廣，有天然的生物大分子，也有小分子化合物。目前二十五頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點

（2）抗體利用抗體為配基的親和層析又稱為免疫親和層析（Immunoaffinitychromatography）?？贵w與抗原之間具有高度特異性結(jié)合能力，結(jié)合常數(shù)一般為107～1012L/mol。因此，利用免疫親和層析法，特別是以單抗為配基的免疫親和層析法是高度純化蛋白質(zhì)類生物大分子的有效手段。

目前二十六頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點

（3）A蛋白

A蛋白（proteinA）為分子量約42KD的蛋白質(zhì)，存在于金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的細胞壁中，占該細胞壁構(gòu)成成分約5％。A蛋白在確定其為蛋白質(zhì)之前稱A抗原，與動物免疫球蛋白G(immunogloblinG，IgG)具有很強的親和結(jié)合作用，結(jié)合部位IgG分子的Fc片斷（Y字型IgG分子的主干部分）

A蛋白不僅與抗體（IgG）的抗原結(jié)合部位結(jié)合，而且任何抗體的Fc片斷的結(jié)構(gòu)都非常相似，因此A蛋白可作為各種抗體的親和配基，但不同抗體的結(jié)合常數(shù)有所不同。目前二十七頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點

（4）凝集素

凝集素(lectin)是與糖特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)（酶和抗體除外）的總稱，大部分凝集素為多聚體，含有兩個以上的糖結(jié)合部位，不同的凝集素與糖結(jié)合的特異性不同。例如，常用做親和配基的伴刀豆球蛋白A(concanavalinA，conA)與葡聚糖和甘露糖的親和結(jié)合作用較強，而麥芽糖凝集素（wheatgermagglutinin，WGA）與N-乙酰葡糖胺（N-acetyl-glucosamine）的親和結(jié)合作用較強。

目前二十八頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點

（5）輔酶和磷酸酰苷各種脫氫酶和激酶需要在輔酶（coenzyme）的存在下表現(xiàn)其生物催化活性，即脫氫酶和激酶與輔酶之間具有親和作用。輔酶主要有輔酶Ⅰ（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamideadeninedinucleotide，NAD）、輔酶Ⅱ（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADphosophate，NADP）和三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）等。這些輔酶可用做脫氫酶和激酶的親和配基。此外，磷酸腺苷（adenosine5’-monophosphate，AMP）、二磷酸腺苷（adenosine2’，5’-diphosphate，ADP）的腺苷部分與上述輔酶的結(jié)構(gòu)類似，與脫氫酶和激酶同樣具有親和結(jié)合作用，可用做這些酶的親和配基。目前二十九頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點

（6）過渡金屬離子

Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+等過渡金屬離子可與N、S和O等供電原子（electrondonoratom）產(chǎn)生配位鍵，因此可與蛋白質(zhì)表面的組氨酸（His）的咪唑基、半胱氨酸（Cys）的巰基和色氨酸（Trp）的吲哚基發(fā)生親和結(jié)合作用，其中以His的咪唑基的結(jié)合作用最強。過渡金屬離子與咪唑基的結(jié)合強弱順序是Cu2+＞Ni2+＞Zn2+≥Co2+。目前三十頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點

（7）組氨酸在各種氨基酸中，組氨酸的性質(zhì)比較獨特：具有弱疏水性、咪唑環(huán)為弱電性。因此組氨酸可與蛋白質(zhì)發(fā)生親和結(jié)合作用。雖然這種親和作用的機理尚不十分清楚，但利用固定化組氨酸吸附蛋白質(zhì)以及吸附蛋白的洗脫實驗結(jié)果表明，靜電和疏水性相互作用均有可能參與親和結(jié)合。在鹽濃度較低和pH約等于目標(biāo)蛋白質(zhì)等電點的溶液中，固定化組氨酸的親和吸附作用最強，隨著鹽濃度增大，親和吸附作用降低。因此利用組氨酸為配基可親和分離等電點相差較大的蛋白質(zhì)，洗脫則可采用增大鹽濃度的梯度洗脫法。目前三十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點

（8）肝素

肝素（heparin）是存在于哺乳動物的肝、肺、腸等臟器中的酸性多糖類物質(zhì)，分子量一般為5～30KD，具有抗凝血作用。肝素與脂蛋白、脂肪酶、甾體受體、限制性核酸內(nèi)切酶、抗凝血酶、凝血蛋白質(zhì)等具有親和作用，可用作這些物質(zhì)的親和配基。肝素的親和結(jié)合作用在中性pH和低濃度鹽溶液中較強，隨著鹽濃度的增大結(jié)合作用降低。目前三十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點活化

基質(zhì)的活化是指通過對基質(zhì)進行一定的化學(xué)處理，使基質(zhì)表面上的一些化學(xué)基團轉(zhuǎn)變?yōu)橐子诤吞囟ㄅ潴w結(jié)合的活性基團。

溴化氰活化法

溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化過程主要是生成亞胺碳酸活性基團，它可以和伯氨(NH2)反應(yīng)，主要生成異脲衍生物。反應(yīng)如下：

介質(zhì)活化與耦聯(lián)目前三十三頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點

這種方法的缺點是溴化氰活化法的基質(zhì)和配體偶聯(lián)后生成的異脲衍生物中氨基的pKa＝10.4，所以通常會帶一定的正電荷，從而使基質(zhì)可能有陰離子交換作用，增大了非特異性吸附，影響親和層析的分辨率。另外溴化氰活化的基質(zhì)與配體結(jié)合不夠穩(wěn)定，尤其是當(dāng)與小配體結(jié)合時，可能會出現(xiàn)配體脫落現(xiàn)象。另外溴化氰有劇毒、易揮發(fā)，所以操作不便。

目前三十四頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點環(huán)氧基活化法在熱的濃堿溶液中，多糖類化合物與環(huán)氧氯丙烷作用生成環(huán)氧化合物；在堿性條件下，其環(huán)氧化合物又能與氨基酸或蛋白質(zhì)上氨基偶聯(lián)。目前三十五頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點

這種活化方法的優(yōu)點是活化后不引入電荷基團，而且基質(zhì)與配體形成的N－C、O－C和S－C鍵都很穩(wěn)定，所以配體與基質(zhì)結(jié)合緊密，親和吸附劑使用壽命長，而且便于在親和層析中使用較強烈的洗脫手段，另外這種處理方法沒有溴化氰的毒性。它的缺點是用環(huán)氧氯丙烷活化的基質(zhì)在與配體偶聯(lián)時需要堿性條件，pH為9-13，溫度為20-40℃。這樣的條件對于一些比較敏感的配體可能不適用。上面兩種方法是比較常用的方法。另外還有甲苯磺酰氯法、雙功能試劑法。目前三十六頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點親和配基耦聯(lián)密度測定耦聯(lián)密度決定了介質(zhì)的吸附容量分光光度法量差法分析水解作用分析元素分析法目前三十七頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點間臂分子當(dāng)配基的分子量較小時，將其直接固定在載體上，會由于載體的空間位阻，配基與生物大分子不能發(fā)生有效的親和吸附作用。如果在配基與載體之間連接間隔臂，可以增大配基與載體之間的距離，使其與生物大分子發(fā)生有效的親和結(jié)合。目前三十八頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點加入間臂的長度要恰當(dāng)，太短則效果不明顯；太長則容易由疏水性非特異吸附造成彎曲，反而降低吸附效率。間臂的疏水性也需要考慮，應(yīng)盡量減小對配基的影響。如間臂和配基疏水性較強，則效果不明顯。目前三十九頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點目前四十頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點常見的親和色譜核苷酸及輔酶親和色譜固定化金屬離子親和色譜染料親和色譜免疫親和色譜基團專一性大分子親和色譜目前四十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點核苷酸及輔酶親和色譜指將核苷酸（或輔酶）作為親和配基固定在色譜介質(zhì)上進行親和色譜的技術(shù)，主要利用核苷酸特別是輔酶因子和蛋白質(zhì)之間的專一性識別達到分離純化目的目前四十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點目前四十三頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點介質(zhì)制備碳二亞胺直接法偶聯(lián)溴化氫活化瓊脂糖→連接氨基己酸→加入核苷酸→溶液中保存→洗滌→偶聯(lián)間接偶聯(lián)法間臂分子和核苷酸→活化的介質(zhì)目前四十四頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點吸附和解吸選擇合適的緩沖液條件下吸附一般采用輔酶或鹽溶液進行梯度洗脫目前四十五頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點固定化金屬離子親和色譜蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基，如組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基，有利于蛋白質(zhì)與固定化金屬離子結(jié)合，從而達到分離的目的。金屬離子如鋅和銅。目前四十六頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點47將活化的介質(zhì)與金屬螯合劑偶聯(lián)，再用金屬離子溶液處理制成金屬螯合親和層析柱。金屬螯合劑：亞氨二醋酸、氨基水楊酸、8-羥基喹啉、羧甲基氨基酸等。目前四十七頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點親和作用機理靜電作用配位鍵結(jié)合共價鍵產(chǎn)生π鍵目前四十八頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點吸附采用50mmol/L的金屬鹽溶液通過色譜柱，直至色譜介質(zhì)吸附飽和。平衡緩沖溶液洗去未螯合的金屬離子加入適宜濃度的NaCl和選擇合適pH值有利于減少非特異性吸附。目前四十九頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點解吸吸附蛋白質(zhì)解吸的方法：改變pH值競爭性洗脫采用50-100mmol/L的EDTA洗脫，可將蛋白質(zhì)和金屬離子解吸，洗滌，重新上柱平衡，固定所需的金屬離子。目前五十頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點pH與氯化銨濃度的影響目前五十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點固定化親和離子色譜的應(yīng)用基因修飾蛋白質(zhì)的純化遺傳修飾→具親和尾蛋白→色譜分離→親和尾切除→色譜分離酶切位點親和尾大小目前五十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點53染料親和色譜有機染料具有類似于NAD+的結(jié)構(gòu)。需核苷酸類物質(zhì)為輔酶的酶，對染料具有一定親和力。染料共價偶聯(lián)到瓊脂糖載體上，能制得親和層析柱。染料親和層析已成功的分離純化了多種酶。目前五十三頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點目前五十四頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點染料親和色譜介質(zhì)的制備配基性質(zhì)、染料結(jié)構(gòu)和染料取代度是制備過程中需要考慮的主要因素。以下途徑可以實現(xiàn)制備：采用瓊脂糖凝膠，染料連接在-OH上，該過程可在一定條件下直接完成。染料也可通過活性基團和基質(zhì)偶聯(lián)，該方法可引入高密度的染料。目前五十五頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點吸附蛋白質(zhì)量增多選擇親和作用力較小的染料有利于解吸目前五十六頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點吸附與解吸采用磷酸鹽緩沖液，在條件下吸附常用解吸方法：增加鹽濃度改變pH值采用水溶性高聚物親和洗脫最后對雜蛋白進行變性處理，洗滌、緩沖液平衡再生介質(zhì)。目前五十七頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點免疫親和色譜抗原和抗體的作用具有高度的專一性,并且它們的結(jié)合親和力極強。因此用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒖乖蚩贵w結(jié)合到吸附劑上,便可有效地分離和純化免疫物質(zhì)。特點：分離效率高，成本高，而且蛋白質(zhì)親和配基不穩(wěn)定，容易降解。目前五十八頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點免疫親和色譜過程目標(biāo)蛋白質(zhì)抗體制備上樣與洗脫介質(zhì)制備目前五十九頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點單抗制備復(fù)雜，成本高，但也具有很多優(yōu)點。目前六十頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點色譜介質(zhì)制備：將抗體通過化學(xué)方法結(jié)合在色譜介質(zhì)上抗體之間交聯(lián)形成不溶性衍生物目前六十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點單抗問世后，不少生物技術(shù)公司在研制適宜于培養(yǎng)雜交瘤細胞的生物反應(yīng)器及其培養(yǎng)基。這些大規(guī)模生產(chǎn)單抗技術(shù)的建立和不斷完善，

將降低免疫親和色譜吸附劑的價格。隨著新的合成基質(zhì)和偶聯(lián)化合物的出現(xiàn)以及對免疫親和色譜研究的深入，必將使免疫親和色譜在工業(yè)性生產(chǎn)純化蛋白質(zhì)的應(yīng)用上逐漸得到發(fā)展。目前六十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點解吸特異性解吸——半抗原置換非特異性解吸——調(diào)節(jié)pH值、加入試劑破壞氫鍵、引入離子對、加入表面活性劑、冷蒸餾水洗滌。目前六十三頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點應(yīng)用根據(jù)研究報道,用單克隆抗體親和色譜從人血小板破碎液中純化血小板第4因子(PF4)。將單克隆抗體Sz-95-LgG與溴化氰活化的Spharose4B凝膠連接成親和色譜柱,人血小板破碎液經(jīng)此親和色譜柱上樣后,經(jīng)洗脫獲得PF4。結(jié)果表明,Sz-95-Sepharose4B親和色譜柱的偶聯(lián)率為72%,每1mL血小板破碎液中可以純化到PF418μg。目前六十四頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點基團專一性大分子親和色譜指用對某一類結(jié)構(gòu)相近的物質(zhì)有親和性的大分子作為親和配基偶聯(lián)在色譜介質(zhì)上進行的色譜技術(shù)。蛋白A親和色譜伴刀豆球蛋白A親和色譜肝素親和色譜目前六十五頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點1）分離純化大分子物質(zhì)如：純化糖蛋白用凝集素（能可逆性地結(jié)合碳水化合物的蛋白質(zhì)），Lectin-Sepharose4B2)研究酶的結(jié)構(gòu)與功能：分離有生物活性與失去生物活性的蛋白質(zhì)。親和色譜的應(yīng)用目前六十六頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點樣品目前六十七頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點t-PA的純化—酶的抑制劑為親和配基目前六十八頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點干擾素的純化—免疫親和色譜目前六十九頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點脫氫酶的純化—色素親和色譜目前七十頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點淀粉酶抑制劑的純化—固定化金屬離子親和色譜目前七十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點基因重組融合蛋白的純化目前七十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點超臨界流體色譜法

超臨界流體色譜(SupercricalFluidChromatography,SFC)是以超臨界流體作為流動相的色譜方法，是20世紀80年代以來發(fā)展迅速的一個色譜分支，所謂超臨界流體，是指在高于臨界壓力和臨界溫度時的一種物質(zhì)狀態(tài)。它既不是氣體，也不是液體，但它兼有氣體的低粘度、液體的高密度以及介于氣、液之間較高的擴散系數(shù)等特性。從理論上說SFC既可以分析GC法難以處理的高沸點、不揮發(fā)性樣品，又有比HPLC法更高的柱效和更短的分離時間，且可使用二者常用的檢測器，也可與MS、FT-IR光譜儀等在線聯(lián)接，因而可以方便地進行定性、定量分析。在中藥藥物分析領(lǐng)域已有愈來愈多的應(yīng)用。目前七十三頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點一、超臨界流體色譜的特點與原理

Principleandcharacterofsupercriticalfluidchromatography1．超臨界流體的特性對于某些純物質(zhì)來說，具有三相點和臨界點，如圖所示，從圖中可以看出，物質(zhì)在三相點，氣、液、固三態(tài)處于平衡狀態(tài)，當(dāng)處于臨界溫度和臨界壓力以上時，則不論施加多大壓力，氣體也不會液化，此時即非氣體，也非液體，而是以超臨界流體形式存在。目前七十四頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點

超臨界流體對于分離具有極其有用的物理性質(zhì)，這些性質(zhì)恰好介于氣體和液體之間。表對氣體、液體、和超臨界流體的有關(guān)物理性質(zhì)進行了比較。

氣體、液體、超臨界流體物理性質(zhì)的比較流動相密度（g/ml）擴散系數(shù)（cm2/s）粘度（g/cm.s）氣體超臨界流體液體約10-30.2-0.90.8-1.01-10-210-3-10-4＜10-510-410-4-10-310-2目前七十五頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點2.原理

SFC的流動相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3

SFC的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細管壁）上的高聚物；可使用液相色譜的柱填料。填充柱SFC和毛細管柱SFC；

分離機理：吸附與脫附。組分在兩相間的分配系數(shù)不同而被分離；通過調(diào)節(jié)流動相的壓力（調(diào)節(jié)流動相的密度），調(diào)整組分保留值；目前七十六頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點壓力效應(yīng)：SFC的柱壓降大（比毛細管色譜大30倍），對分離有影響（柱前端與柱尾端分配系數(shù)相差很大，產(chǎn)生壓力效應(yīng)）；超臨界流體的密度受壓力在臨界壓力處最大，超過該點影響小，超過臨界壓力20%，柱壓降對分離的影響小；壓力效應(yīng)：在SFC中，壓力變化對容量因子產(chǎn)生顯著影響，超流體的密度隨壓力增加而增加，密度增加提高溶劑效率，淋洗時間縮短。

CO2流動相，當(dāng)壓力改變：7.0→9.0×106Pa，則：

C16H34的保留時間25min→5min。目前七十七頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點程

序

升

壓目前七十八頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點HPLC與SFC比較目前七十九頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點與GC法和HPLC法比較，因超臨界流體的粘度接近于氣相色譜的流動相，對溶質(zhì)的傳質(zhì)阻力小，可以使用更高的流速洗脫，因此SFC的分離速度快于HPLC而與GC相當(dāng)；超臨界流體的擴散率介于GC和LC之間，因而峰展寬小于在氣體中。SFC中的流動相不是惰性的傳輸介質(zhì)，這不同于GC而與LC一樣，溶質(zhì)與流動相間有相互作用，利用此點可調(diào)控選擇因子α當(dāng)考慮溶質(zhì)分壓時，也可利用SFC的兩重性，即被測物質(zhì)在超臨界流體中的溶解性非常接近其揮發(fā)性，而發(fā)生溫度卻較低，因此，在一定壓力下，超臨界流體溶解的分子的分壓比在氣體中高幾個數(shù)量級，這就可以實現(xiàn)對大分子、熱不穩(wěn)定性化合物、高聚物等的有效分離。目前八十頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點二、超臨界流體色譜儀的結(jié)構(gòu)與流程1.結(jié)構(gòu)流程

目前八十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點2.主要部件（1）SFC的高壓泵

無脈沖的注射泵；通過電子壓力傳感器和流量檢測器，計算機控制流動相的密度和流量；

（2）SFC的色譜柱和固定相

可以采用液相色譜柱和交聯(lián)毛細管柱；

SFC的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細管壁）上的高聚物；專用的毛細管柱SFC；目前八十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點色譜柱①填充柱填充柱與HPLC柱相似，基于分配平衡實現(xiàn)分離，柱長可達25cm，分離柱內(nèi)徑。使用粒徑為3-10μm的填料填充。如硅膠、-NH2、-CN及C18、C8等化學(xué)鍵合相均可用于SFC。其中以極性填料的分離效果更好。SFC在手性化合物的分離上效果優(yōu)于HPLC。在實際操作中，往往會因壓力變化而產(chǎn)生較大的柱壓降，使柱入、出口處的保留時間有很大差異，所以一般采用高于超臨界壓力20%左右的壓力以減小影響。在填料的選擇上也要注意與所分析的樣品相適應(yīng)，如分析極性或堿性化合物時，填料覆蓋度小，會產(chǎn)生不對稱峰。若使用“封端”填料則會得到改善。目前八十三頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點填充柱在重現(xiàn)性、載樣量等方面要優(yōu)于毛細管柱，操作簡便，也有用微填充柱的，將3-10μm的填料填充到內(nèi)徑幾個毫米或更小的毛細管柱中。②毛細管柱較長用的填充毛細管柱內(nèi)徑≤0.5mm，柱長為10-30mm；開管毛細管柱主要是內(nèi)徑為50-100μm化學(xué)交連的各種硅氧烷柱或其它類型的交連柱。SFC色譜柱必須借助柱箱以實現(xiàn)精確的溫度控制，范圍可以從室溫至450°C，同時配低溫控制系統(tǒng)，可在-50℃以下工作。目前八十四頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點主要部件（3）流動相

SFC的流動相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3

CO2應(yīng)用最廣泛；無色、無味、無毒、易得、對各類有機物溶解性好，在紫外光區(qū)無吸收；缺點：極性太弱；加少量甲醇等改性；（4）檢測器

可采用液相色譜檢測器，也可采用氣相色譜的FID檢測器目前八十五頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點①使用氣相色譜檢測器，以FID為多用，應(yīng)用時可將色譜柱的流出物分流，部分流出物通過限流器變?yōu)闅鈶B(tài)進入檢測器，若用FID檢測時，流動相中不能加入改進劑，否則改進劑本身將給出信號干擾測定，F(xiàn)ID對小分子量化合物可得到很好的結(jié)果，對分子量大的化合物常得不到單峰，而是一簇峰。如把檢測器加熱可使分子量大于2000的化合物獲得滿意的分離。在SFC中也可以使用氮磷檢測器（NPD）、火焰光度檢測器（FPD）等。目前八十六頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點②使用液相色譜檢測器。在進入檢測器之前應(yīng)將超臨界狀態(tài)轉(zhuǎn)為液態(tài)，可增加檢測的靈敏度，使譜帶變窄，而且可以在室溫下操作，UVD是用改性劑流動相的填充柱SFC的最常用的檢測方法。要求檢測器必須耐高壓。如使用毛細管柱，UVD的流通池可由一段熔融石英毛細管構(gòu)成，內(nèi)容積在200nl左右，這樣不會影響柱效；熒光檢測器（FD）也可以如此應(yīng)用。對于填充柱，蒸發(fā)光散射檢測器也是一種常用的通用檢測器。目前八十七頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點三、超臨界流體色譜的流動相和改性劑（一）流動相SFC的流動相為超臨界流體。超臨界流體的主要特點是在不同壓力下對各種樣品有不同的溶解能力。其溶解度隨超臨界流體密度的增加而增加。當(dāng)兩組分的溶解度常數(shù)越接近時，，其互溶性就越好。有人研究認為，幾種常用的超臨界流體的溶解能力在相同的壓力條件下順序是乙烷<二氧化碳<氧化亞氮<三氟甲烷，在相同條件下其分離能力是：二氧化碳＜氧化亞氮＜三氟甲烷≈乙烷。對于SFC流動相的選擇應(yīng)綜合考慮。除溶解性能外，還要與檢測器相適應(yīng)，CO2是最常用的流動相。其臨界溫度低、壓力適中，容易操作，相對便宜，無毒無嗅，安全性好，且在190nm以上無紫外吸收。目前八十八頁\總數(shù)九十一頁\編于十一點（二）改性劑在SFC中，弱極性或非極性超臨界流體流動相如CO2，對于一些極性化合物的溶解能力較