產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌檢驗(yàn)

產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)

食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)MicrobiologicalexaminationoffoodhygieneExaminationofClostridiumperfringens（魏氏梭菌）目前一頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)目錄1、概述2、生物學(xué)特性（菌體形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)特性和抵抗力）3、毒素與分型4、培養(yǎng)基和試劑5、檢驗(yàn)程序6、說明

目前二頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)1、概述

產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌又稱魏/衛(wèi)氏梭菌分布：自然界廣泛存在(創(chuàng)傷感染）。易污染食品：動(dòng)物性食品原料食品加熱后未及時(shí)冷卻，所含耐高溫而殘余的產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢會(huì)迅速發(fā)芽，大量繁殖，菌數(shù)可達(dá)數(shù)10萬/g，食用前又未加熱，則有可能引起產(chǎn)氣莢膜梭菌食物中毒。食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)的主要目標(biāo)是檢驗(yàn)食品被該菌污染的程度，其重點(diǎn)項(xiàng)目是活菌數(shù)測定及證實(shí)試驗(yàn)。目前三頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)2、生物學(xué)特性1)形態(tài)與染色

G+(陳舊培養(yǎng)物陰性菌）無鞭毛可形成莢膜和芽胞的大桿菌大小：為(1－2)μmX(2－10)μm。芽孢：卵圓形位于菌體中央或近端，直徑大于菌體的直徑，有的菌株難形成芽胞。莢膜：在人和動(dòng)物活體組織內(nèi)，或在含血清的培養(yǎng)基內(nèi)生長時(shí)可形成莢膜。Clostridiumperfringens/research/Images/SarkerSlide.jpg目前四頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)圖片資料/產(chǎn)氣莢膜梭菌.jpg目前五頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)2)培養(yǎng)特性*不嚴(yán)格的厭氧*普通營養(yǎng)瓊脂上可生長，若加入葡萄糖、血液則生長更好。

*適宜生長溫度為37—47℃。*生長和繁殖速度極快，在適宜條件下8min/代。*在45℃高溫下可進(jìn)行快速分離純培養(yǎng)，每培養(yǎng)3—4h傳種1次，較易分離純化。

ClostridiumPerfringensToxin目前六頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)肝片肉湯培養(yǎng)：－－大量產(chǎn)氣，培養(yǎng)5h-6h變渾濁；牛奶培養(yǎng)基中生長：－－能夠分解乳糖產(chǎn)酸，將酪蛋白凝固產(chǎn)生大量氣體，沖散酪蛋白，使其成海綿狀。庖肉培養(yǎng)基中培養(yǎng)：－－產(chǎn)生大量氣體，肉渣或肉塊略帶粉紅，但不消化。普通瓊脂平板上培養(yǎng)：－－15h－24h形成S型菌落，在營養(yǎng)不足或瓊脂濃度高的平板上可形成鋸齒狀帶放射條紋的R型菌落。

at45C，ClostridiumperfringensisvirtuallytheonlyorganismthatwillproducetheStormyFermentation

。目前七頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)鮮血瓊脂平板生長：

－－菌落周圍出現(xiàn)雙層溶血環(huán)，內(nèi)層溶血完全，外層溶血不完全，好似靶狀，菌落本身略帶灰黃色至淺灰褐色，與空氣接觸30min后，有時(shí)可能逐漸變?yōu)榛揖G色、甚至鮮綠色，這是本菌的特征之一。

ClostridiumperfringensbacteriaonabloodagarplateCourtesyGlennSonger,The

University.ofArizonaCollegeofAgricultureandLifeSciences.

：/articles/01_02/Clostridium_seq.shtmlClostridiumperfringensshowsdouble-zonehemolysisonbloodagar.Notethesmallareaofbetahemolysis(completelysisofredbloodcells)surroundedbyalargerzoneofalphahemolysis(partialhemolysis).Theplateissittingonablacklabbench目前八頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)ClostridiumperfringensGrowingonBloodAgar目前九頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)

菌落周圍出現(xiàn)乳光渾濁帶，此反應(yīng)能被本菌的α抗毒素抑制。

*由于發(fā)酵乳糖，菌落周圍的培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化

*本菌不消化牛奶，不分解游離脂肪，菌落周圍不出現(xiàn)透明環(huán)及虹彩層（肉毒梭菌可形成）。乳糖牛奶卵黃瓊脂平板上培養(yǎng)：目前十頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)3)生化特性

*發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖及蔗糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，*液化明膠*還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。*能將亞硫酸鹽還原為硫化物，在含亞硫酸鹽及鐵鹽的瓊脂中形成黑色菌落目前十一頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)*發(fā)酵牛奶中的乳糖，使牛奶凝固，同時(shí)大量產(chǎn)氣，凝塊碎裂，即所謂‘‘暴風(fēng)雨式發(fā)酵”，這是本菌的重要生化特征之一，也是鑒別的主要指標(biāo)。目前十二頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)

4）抵抗力

A型與C型菌株的芽胞：耐熱性強(qiáng)，煮沸1－3h，繁殖型菌體不耐熱。目前十三頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)3、毒素、酶與分型

毒素：產(chǎn)氣莢膜梭菌能產(chǎn)生外毒素和腸毒素。

外毒素：致死毒素、壞死毒素和溶血毒素，毒性不強(qiáng)不耐熱。腸毒素：不耐熱，60℃經(jīng)10min即可破壞不耐酸，對堿有抵抗性，對胰蛋白酶等蛋白分解酶比較穩(wěn)定。

酶：纖維蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、膠原酶等這些毒素和酶促使組織分解、壞死、產(chǎn)氣、水腫及病變擴(kuò)散和全身中毒等。目前十四頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)分型：

根據(jù)毒素和抗血清中和試驗(yàn)將此菌分成A，B，C，D，E和F六個(gè)型。

A型：最常見，引起氣性壞疽和食物中毒；A型最早由WelchandNuttal(1892)分離，所以叫衛(wèi)氏/魏氏梭菌

C型：可引起腸炎。

*對人致病的主要是A、C和F型

*引起食物中毒的主要是A型

目前十五頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)4、培養(yǎng)基和試劑4.1庖肉培養(yǎng)基－－產(chǎn)生大量氣體，肉渣或肉塊略帶粉紅，但不消化4.2亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂（SPS）--能將亞硫酸鹽還原為硫化物，在含亞硫酸鹽及

鐵鹽(含有檸檬酸鐵胺)的瓊脂中形成黑色菌落；前面分離培養(yǎng)和計(jì)數(shù)用

（SPS）目前十六頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)4.3液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（FT）－－大量培養(yǎng)該菌用4.4動(dòng)力—硝酸鹽培養(yǎng)基--無鞭毛，不運(yùn)動(dòng)；還原硝酸鹽為亞硝酸鹽目前十七頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)4.5含鐵牛奶培養(yǎng)基

--發(fā)酵牛奶中的乳糖，使牛奶凝固，同時(shí)大量產(chǎn)氣，凝塊碎裂，即所謂‘‘暴風(fēng)雨式發(fā)酵”/“暴烈發(fā)酵”，這是本菌的重要生化特征之一，也是鑒別的主要指標(biāo)。觀察2h，5h不發(fā)酵為陰性IronMilkMedium.ItisamediumusedinMostProbableNumberanalysisofClostridiumperfringens.Whenplacedat45C,CPisvirtuallytheonlyorganismthatwillproducetheStormyFermentation(seenintherighttube).Thecoagulationofmilkfatformsaplugtherebyrestrictingoxygen(whichisnecessaryforthisstrictanaerobe).Stormyfermenationusuallyoccurswithin6to8hours目前十八頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)4.6卵黃瓊脂培養(yǎng)基

－－檢查卵磷脂酶，本菌卵磷脂酶陽性，接種點(diǎn)（每個(gè)平板接種10點(diǎn)以上）的底部及其周圍形成乳白色的渾濁帶。4.70.1％蛋白胨水稀釋劑；4.8硝酸鹽還原試劑:甲萘胺液和對氨基苯磺酸液；4.9革蘭氏染色液。html肉毒梭菌對比目前十九頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)5、檢驗(yàn)程序

計(jì)數(shù)30～300個(gè)菌落的稀釋倍數(shù)活菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)目前二十頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)檢驗(yàn)程序—續(xù)36℃，18～24h36℃，24h＋46℃,2～5h爆發(fā)酵無目前二十一頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)6、說明

1．活菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)：1：10稀釋的樣品用蛋白胨水依次稀釋至10-2－10-6倍，取1ml放入2個(gè)平板，分別加15mlSPS瓊脂，于36℃培養(yǎng)24h，選取長有30—300個(gè)黑色菌落的平板，計(jì)數(shù)黑色菌落數(shù)。

目前二十二頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)2、證實(shí)試驗(yàn)

(1)純培養(yǎng)：由平板上任取10個(gè)黑色菌落，分別接種FT培養(yǎng)基，于(36±1)℃培養(yǎng)18－24h，大量繁殖。

(2)菌體形態(tài)和染色檢驗(yàn)：用培養(yǎng)液涂片，革蘭氏染色鏡檢。產(chǎn)氣莢膜梭菌為革蘭氏陽性粗大桿菌，其耐熱株有卵形芽孢，位于菌體中央或近端。目前二十三頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)(3)檢查動(dòng)力和硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)：

用接種環(huán)(針)穿刺接種動(dòng)力—硝酸鹽培養(yǎng)基，于(36±1)℃培養(yǎng)24h.--判斷有無動(dòng)力--產(chǎn)氣莢膜梭菌無動(dòng)力；

--滴加硝酸鹽還原試劑“甲萘胺液和對氨基苯磺酸液”各0.5ml，觀察硝酸鹽是否被還原--產(chǎn)氣莢膜梭菌，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。＋（紅色）

目前二十四頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)(4)牛乳乳糖發(fā)酵產(chǎn)氣“暴發(fā)酵”試驗(yàn)：

取生長旺盛的FT培養(yǎng)液1ml接種于含鐵牛乳培養(yǎng)基，在46℃水浴中培養(yǎng)2h后觀察有無“暴發(fā)酵”現(xiàn)象。5h內(nèi)不發(fā)酵者為陰性。－－產(chǎn)氣莢膜梭菌發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸凝固酪蛋白并大量產(chǎn)氣，呈“暴風(fēng)雨式發(fā)酵”現(xiàn)象，但培養(yǎng)基不變黑。目前二十五頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)(5)卵磷脂酶檢查試驗(yàn)：用接種環(huán)取FT培養(yǎng)液點(diǎn)種于卵黃瓊脂平板(每塊平板至少可接種10點(diǎn))，于厭氧培養(yǎng)，觀察接種點(diǎn)的變化。產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生卵磷脂酶，分解卵黃中的卵磷脂，接種點(diǎn)的底部及周圍乳白色的混濁帶。目前二十六頁\總數(shù)二十八頁\編于一點(diǎn)3、菌數(shù)計(jì)算