分子生物學分子克隆技術

參考書目資料《分子克隆實驗指南》（第三版）：美J.薩姆布魯克等著,黃培堂等譯，科學出版社，2008.《GeneIX》：BenjaminLewin編著.《基因工程原理》：吳乃虎，科學出版社，1998.《分子生物學實驗指導》：郜金榮，葉林柏，武漢大學出版社，2007.《基因工程》：張惠展，華東理工大學出版社，2005.目前一頁\總數(shù)八十一頁\編于三點分子克隆目前二頁\總數(shù)八十一頁\編于三點目前三頁\總數(shù)八十一頁\編于三點基因工程是指在微觀領域（分子水平）中，根據(jù)分子生物學和遺傳學原理，設計并實施一項把一個生物體中有用的目的DNA(遺傳信息)轉入另一個生物體中，使后者獲得新的需要的遺傳性狀或表達所需要的產物，最終實現(xiàn)該技術的商業(yè)價值?；蚬こ痰幕咎攸c是，分子水平操作，細胞水平表達?；蚬こ袒蚬こ膛c建筑工程目前四頁\總數(shù)八十一頁\編于三點重組DNA技術的重大突破帶動了現(xiàn)代生物技術的興起，并很快產生了許多生命科學的高技術產業(yè)。重組DNA技術，又稱為基因或分子克隆技術，是基因工程的核心技術。該技術包括了一系列的分子生物學操作步驟。基因工程的核心技術是DNA重組技術目前五頁\總數(shù)八十一頁\編于三點分子克隆技術

又稱為重組DNA技術，是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體）內，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產物或新性狀的DNA體外操作程序。供體、受體、載體是重組DNA技術的三大基本元件。目前六頁\總數(shù)八十一頁\編于三點重組DNA操作一般步驟：（1）獲得目的基因；（2）與克隆載體連接，形成新的重組DNA分子；（3）用重組DNA分子轉化受體細胞，并能在受體細胞中復制和遺傳；（4）對轉化子篩選和鑒定；（5）對獲得外源基因的細胞或生物體通過培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達出所需要的產物。目前七頁\總數(shù)八十一頁\編于三點獲得需要的目的基因（外源基因）獲得需要的目的基因常用的方法：（1）直接從生物體中提取總DNA，構建基因文庫(genelibrary)，從中調用目的基因；（2）以mRNA為模板，反轉錄合成互補的DNA片段；（3）利用聚合酶鏈式反應（PCR）特異性地擴增所需要的目的基因片段，等等。目前八頁\總數(shù)八十一頁\編于三點細胞內總DNA的提取分離與基因文庫的構建細胞內總DNA的提取分離程序目前九頁\總數(shù)八十一頁\編于三點紫外分光光度計測定DNA溶液的純度和濃度。目前十頁\總數(shù)八十一頁\編于三點基因工程的工具酶“手術刀”專司切割之職，內切酶“縫紉針”具有連接之功，連接酶“復印機”行使復制之責，DNA聚合酶目前十一頁\總數(shù)八十一頁\編于三點(“交通工具車子”)——載體有了切割與縫合（ligase）基因DNA的工具，還得有一個“車子”將重組DNA送到宿主細胞中去。

目前十二頁\總數(shù)八十一頁\編于三點逆轉錄酶使真核基因的制備成為可能。

（1）真核基因組龐大而復雜，不易制得基因圖譜。（2）即使有了基因圖譜，因為真核基因有內含子，不能在原核表達系統(tǒng)剪接出mRNA，沒有成熟的mRNA就不能得到相應得產物。（3）經過逆轉錄mRNA→cDNA(complementoryDNA)得到的cDNA文庫要比基因組文庫小得多，所以篩選陽性克隆就方便得多。

目前十三頁\總數(shù)八十一頁\編于三點四、分子克隆的技術支撐核酸凝膠電泳技術核酸分子連接技術細菌轉化技術DNA序列分析技術寡核苷酸合成技術基因定點突變技術聚合酶鏈反應（PCR）技術DNA序列測定技術目前十四頁\總數(shù)八十一頁\編于三點核酸凝膠電泳目前十五頁\總數(shù)八十一頁\編于三點細菌轉化技術（包括感受態(tài)細胞制備）目前十六頁\總數(shù)八十一頁\編于三點聚合酶鏈反應（PCR）技術目前十七頁\總數(shù)八十一頁\編于三點大規(guī)模生產生物活性物質野生細胞野生細胞分離工程酶分離工程基因工程蛋白質工程途徑工程

工程細胞發(fā)酵工程酶工程細胞工程生物活性物質目前十八頁\總數(shù)八十一頁\編于三點目前十九頁\總數(shù)八十一頁\編于三點

用攜帶了外源基因的農桿菌Ti質粒轉化植物原生質體，發(fā)育成具有新性狀的完整植株——轉基因植物。

目前二十頁\總數(shù)八十一頁\編于三點基因工程的工具酶“手術刀”專司切割之職“縫紉針”具有連接之功“復印機”行使復制之責內切酶連接酶聚合酶目前二十一頁\總數(shù)八十一頁\編于三點內切酶“手術刀”專司切割之職“縫紉針”具有連接之功“復印機”行使復制之責內切酶連接酶聚合酶目前二十二頁\總數(shù)八十一頁\編于三點內切酶目前二十三頁\總數(shù)八十一頁\編于三點同裂酶(Isoschizomers）目前二十四頁\總數(shù)八十一頁\編于三點同尾酶目前二十五頁\總數(shù)八十一頁\編于三點星活性*所謂星活性又稱Star活性。是指由于反應條件不同而產生的切斷與原來認識序列不同的位點的現(xiàn)象，也就是說產生Star活性后，不但可以切斷特異性的識別位點，還可以切斷非特異性的位點。產生Star活性的結果是酶切條帶增多。Differenceswhichcanleadtostaractivityincludelowionicstrength,highpH,andhigh(>5%v/v)glycerolconcentrations.HighFidelity(HF)RestrictionEnzymescanbeusedtoreducestaractivity.目前二十六頁\總數(shù)八十一頁\編于三點目前二十七頁\總數(shù)八十一頁\編于三點DNA聚合酶Taq酶 用Taq酶擴增DNA時常使片段3‘端凸出一個A。Pfu酶 產生平末端產物。目前二十八頁\總數(shù)八十一頁\編于三點連接酶T4DNALigase(invitrogen)16°C過夜或者室溫1-2個小時了連接即可。目前二十九頁\總數(shù)八十一頁\編于三點基因工程的載體---用于擴增目前三十頁\總數(shù)八十一頁\編于三點克隆載體必備條件（1）具有復制起點（2）具有抗菌素抗性基因（3）具有若干限制酶單一識別位點（4）具有較小的相對分子質量和較高的拷貝數(shù)。目前三十一頁\總數(shù)八十一頁\編于三點表達型基因工程的載體----以PET32為例目前三十二頁\總數(shù)八十一頁\編于三點多克隆位點目前三十三頁\總數(shù)八十一頁\編于三點宿主要考慮宿主菌對密碼子的偏愛性大腸桿菌不同密碼子的偏愛性問題，將64組密碼子分為強、中、弱密碼子目前三十四頁\總數(shù)八十一頁\編于三點目的產物目的基因不溶性的高效表達過程：目的基因編碼的真核蛋白質與宿主基因編碼的原核多肽或或其它基因編碼的具有其它功能的多肽和結合在一起，這種結合在一起的形成的不溶性無活性的包涵體，又叫為融合蛋白。舉例：胰島素與β-半乳糖苷酶形成包涵體優(yōu)點：避免細菌蛋白酶破壞，提高目的基因表達產物產量。缺點：需要經過溶解和復性才能獲得有活性的適合：不需要翻譯后修飾的蛋白質產物目前三十五頁\總數(shù)八十一頁\編于三點目的基因的高效分泌表達概念：目的蛋白分泌到細胞周質和目的蛋白轉運到細胞周質后再分泌到細胞外優(yōu)點：①防止宿主菌對表達產物的降解；②有利于蛋白質正確折疊，形成天然構象③減輕宿主細胞代謝負荷④有利于分離需要在質粒設計時加入一段信號肽基因目前三十六頁\總數(shù)八十一頁\編于三點基因克隆操作過程目前三十七頁\總數(shù)八十一頁\編于三點克隆示意圖目前三十八頁\總數(shù)八十一頁\編于三點克隆示意圖目前三十九頁\總數(shù)八十一頁\編于三點克隆技術流程分切連轉篩目前四十頁\總數(shù)八十一頁\編于三點分分離（來自生物組織）、擴增（設計引物，PCR擴增）mRNA-------DNA------擴增目前四十一頁\總數(shù)八十一頁\編于三點引物設計與訂購酶切位點雙酶切、保護堿基、最合適的緩沖液。引物訂購目前四十二頁\總數(shù)八十一頁\編于三點保護堿基目前四十三頁\總數(shù)八十一頁\編于三點1.用限制性酶消化

DNA樣品目前四十四頁\總數(shù)八十一頁\編于三點單酶切目前四十五頁\總數(shù)八十一頁\編于三點雙酶切目前四十六頁\總數(shù)八十一頁\編于三點選擇合適的雙酶切緩沖液目前四十七頁\總數(shù)八十一頁\編于三點2.用限制性內切酶消化質粒DNA目前四十八頁\總數(shù)八十一頁\編于三點3.連接樣品DNA和質粒DNA的消化產物目前四十九頁\總數(shù)八十一頁\編于三點連接前最好要定量連接比例摩爾比例為： 插入片度：質粒=10:1---5:1為佳。質粒幾十個ng為佳。目前五十頁\總數(shù)八十一頁\編于三點雙酶切EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。目前五十一頁\總數(shù)八十一頁\編于三點冷循環(huán)器目前五十二頁\總數(shù)八十一頁\編于三點4.用連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞轉化細菌有兩個基本方法。一是

化學法，即用CaCl2

處理并加熱激以促進DNA進入菌體；二是電激法，即

施加短脈沖的電荷以促進DNA吸收。目前五十三頁\總數(shù)八十一頁\編于三點用氯化鈣化學轉化目前五十四頁\總數(shù)八十一頁\編于三點用氯化鈣化學轉化目前五十五頁\總數(shù)八十一頁\編于三點電激轉化目前五十六頁\總數(shù)八十一頁\編于三點一個電激轉化程序加50-200ngDNA到40ul電激感受態(tài)細菌中將混合物放入一個預冷的電激杯中施以脈沖電處理，脈沖長度預期值為8to12ms立即加1mlLB培養(yǎng)液，在室溫下振蕩2-4小時。

分別取10ul和100ul涂布在到兩個加有抗菌素的LB瓊脂平板上，保溫培養(yǎng)1天。目前五十七頁\總數(shù)八十一頁\編于三點5.

細菌在加有Amp+X-Gal的培養(yǎng)基上生長以進行篩選連接會有三種結果，一是要插入的序列自連；二是切開的質粒重連；三是要插入的序列與質粒相連。第一種連接結果沒有菌落形成。第二種連接結果表現(xiàn)為藍色菌落。只有后一種結果是符合需要的，產生白色的抗氨芐青霉素菌落。目前五十八頁\總數(shù)八十一頁\編于三點滅菌器目前五十九頁\總數(shù)八十一頁\編于三點加IPTG和X-GAL目前六十頁\總數(shù)八十一頁\編于三點倒平板目前六十一頁\總數(shù)八十一頁\編于三點

α互補利用α互補原理篩選重組體pUC18目前六十二頁\總數(shù)八十一頁\編于三點篩選結果藍菌落代表含有質粒的耐藥菌，表達出由完好的α

LacZ序列編碼的功能性的

α

片段。白菌落代表含有質粒的耐氨芐青霉素菌，質粒上α

LacZ序列上有插入片段。目前六十三頁\總數(shù)八十一頁\編于三點乳糖和誘導物IPTG的化學結構isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside目前六十四頁\總數(shù)八十一頁\編于三點X-galX-Gal是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的顯色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下會產生藍色產物。常用于β-半乳糖苷酶的原位染色檢測以及藍白斑篩選。

目前六十五頁\總數(shù)八十一頁\編于三點X-gal水解目前六十六頁\總數(shù)八十一頁\編于三點篩選結果模式圖目前六十七頁\總數(shù)八十一頁\編于三點藍菌落建議用DH5α做宿主菌。

目前六十八頁\總數(shù)八十一頁\編于三點藍白菌落目前六十九頁\總數(shù)八十一頁\編于三點電泳儀目前七十頁\總數(shù)八十一頁\編于三點經過雙酶切、PCR等鑒定，送陽性克隆測序。提取正確的克隆菌中的質粒，轉入表達型的菌株，如BL21等。誘導表達蛋白目前七十一頁\總數(shù)八十一頁\編于三點鑒定方法目前七十二頁\總數(shù)八十一頁\編于三點

PCR鑒定目前七十三頁\總數(shù)八十一頁\編于三點

原位雜交目前七十四頁\總數(shù)八十一頁\編于三點雞的β肌球蛋白的克隆和檢出免疫學方法目前七十五頁\總數(shù)八十一頁\編于三點蛋白質的純化目前七十六頁\總數(shù)八十一頁\編于三點謝 謝！目前