基因表達及分析技術

基因表達及其分析技術生命現(xiàn)象的奧秘隱藏在基因組中，對基因組的解碼一直是現(xiàn)代生命科學的主流?；蚪M學研究可以說是當今生命科學領域炙手可熱的方向。從DNA測序到SNP、拷貝數(shù)變異(copynumbervariation，CNV)等DNA多態(tài)性分析，到DNA甲基化修飾等表觀遺傳學研究，生命過程的遺傳基礎不斷被解析?；蚪M研究的重要性自然不言而喻。應該說，DNA測序技術在基因組研究中功不可沒，從Sanger測序技術到目前盛行的新一代測序技術(NextGenerationSequencing，NGS)到即將走到前臺的單分子測序技術，測序技術是基因組解析最重要的主流技術。而基因組測序、基因組多態(tài)性分析、DNA甲基化修飾等表觀遺傳分析等在基因組研究中是最前沿的課題。但是基因組研究終究類似“基因算命”，再清晰的序列信息也無法真正說明一個基因的功能，基因功能的最后鑒定還得依賴轉(zhuǎn)錄組學和蛋白組學，而轉(zhuǎn)錄作為基因發(fā)揮功能的第一步，對基因功能解析就變得至關重要。聲稱特定基因、特定SNP、特定CNV、特定DNA修飾等與某種表型有關，最終需要轉(zhuǎn)基因、基因敲除、突變、RNAi、中和抗體等技術驗證，并必不可少要結合基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白修飾等數(shù)據(jù)?；?qū)崿F(xiàn)功能的第一步就是轉(zhuǎn)錄為mRNA或非編碼RNA，轉(zhuǎn)錄組學主要研究基因轉(zhuǎn)錄為RNA的過程。在轉(zhuǎn)錄研究中，下面幾點是必須考慮的：1，基因是否轉(zhuǎn)錄(基因是否表達)及基因表達水平高低(基因是低豐度表達還是中、高豐度表達)。特定基因有時候在一個細胞中只有一個拷貝的表達，而表達量會隨細胞類型不同或發(fā)育、生長階段不同或生理、病理狀態(tài)不同而改變。因此任何基因表達檢測技術，其是否科學，就是要看能否檢測到低豐度表達基因，能否檢測到基因豐度的變化尤其是微弱變化，線性范圍是否寬廣等。這方面的誤區(qū)在于，很多人過分強調(diào)特定技術能否檢測到低豐度基因的表達，忽視了特定技術能否檢測到基因表達豐度微弱的改變。如果關注全基因組表達信息，那么目前最經(jīng)典的技術就是全基因組表達譜芯片技術，這種基因芯片設計了數(shù)據(jù)庫中所有已知基因、EST和預測基因、EST的已知轉(zhuǎn)錄本的探針，用來分析全基因組中已知基因、預測基因的已知轉(zhuǎn)錄本的表達信息。在利用基因芯片進行轉(zhuǎn)錄研究時，應該選擇能檢測低豐度表達基因的芯片技術，選擇可以反映基因表達微弱變化并且線性范圍廣的技術，比如Affymetrix公司的轉(zhuǎn)錄研究方面的芯片。以GeneChip?HumanGenomeU133Plus2.0Array為例，該芯片可以分析多達38500個基因的47400個轉(zhuǎn)錄本(而GeneChip?HumanGenomeU133A2.0Array是對其中14500個well-characterizedhumangenes的18400個轉(zhuǎn)錄本進行分析的)。從精確度、重復性、性價比等角度來講，芯片技術仍然是基因表達研究的首選技術。除人全基因組表達譜芯片外，Affymetrix公司還可以提供以下物種的全基因組表達譜芯片：大鼠，小鼠，擬南芥，大麥，牛，線蟲，狗，雞，柑橘，棉花，果蠅，大腸桿菌，玉米，苜蓿，綠膿桿菌，蚊子/瘧原蟲、楊樹，豬，恒河猴，水稻，金黃色葡萄球菌，大豆，甘蔗，西紅柿，葡萄，小麥，爪蟾，酵母，斑馬魚等。2，對mRNA表達而言，更重要的問題是，每個基因的編碼區(qū)域由若干外顯子組成，而特定基因在不同細胞類型中或不同發(fā)育、生長階段或不同生理、病理狀態(tài)下，夕卜顯子存在選擇性剪接(alternativesplicing)，因而會出現(xiàn)不同轉(zhuǎn)錄本。不同轉(zhuǎn)錄本正是解釋同一基因具有不同功能甚至相反功能遺傳基礎。因此分析基因表達，不僅要知道基因是否表達與表達水平高低，更重要的是需要知道特定基因表達的轉(zhuǎn)錄本是什么。如果關注全基因組所有外顯子表達并希望預測每個基因選擇性剪接，那么基因芯片仍然是該方面研究的經(jīng)典技術。以Affymetrix公司的GeneChipHumanExon1.0STArray為例，該芯片可以分析已知的及預測的轉(zhuǎn)錄區(qū)域內(nèi)的超過1百萬個外顯子簇的表達，分析選擇性剪接。這是迄今為止最全面的、唯一的同時可以研究基因表達與選擇性剪接的基因芯片。Affymetrix公司也可以提供小鼠、大鼠的此類芯片，分別分析小鼠的1百萬個外顯子或大鼠的85萬個外顯子。3，基因調(diào)節(jié)分析。任何基因表達都是受到嚴格調(diào)控的，包括轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控和表觀遺傳修飾等。如果關注特定轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的所有基因，那么ChIPonchip技術是必須的。以Affymetrix公司的GeneChipHumanPromoter1.0RArray為例，該芯片可以分析任何特定蛋白質(zhì)如轉(zhuǎn)錄因子與超過25500個啟動子的相互作用。每個啟動子覆蓋10-12.5kb(轉(zhuǎn)錄起始位點下游2.5炒+上游7.5kb，對1300個癌基因而言，上游延長至10kb)。如果分析特定轉(zhuǎn)錄因子在特定細胞類型的特定生長、發(fā)育階段或特定生理、病理下調(diào)控基因表達的特點，該芯片是很好的工具。該芯片也覆蓋了UCSCinNCBIhumangenomeassembly(Build34)中注解的59%的CpG島，該芯片同時可以用于DNA甲基化修飾的分析。Affymetrix公司也可以提供小鼠的此類芯片，分析轉(zhuǎn)錄因子與28000個啟動子的相互作用。非編碼RNA也是轉(zhuǎn)錄組學研究的熱點，Affymetrix公司的GeneChipmiRNAArray可以分析71個物種的數(shù)以千計的microRNA與SmallnucleolarRNAs(snoRNAs)的表達。4,樣本問題。最科學的樣本應該是同質(zhì)細胞。不同細胞類型，其基因表達是有差異的，建立細胞類型特異的基因表達數(shù)據(jù)，才能真正揭示特定細胞類型基因表達的真實面貌。對于組織，制作組織切片，利用（免疫）組織化學技術對特定細胞類型進行鑒定，進而利用激光顯微切割技術分離特定細胞類型，這是目前從組織中獲得同質(zhì)細胞的關鍵技術。問題在于組織切片制備和（免疫）組織化學等環(huán)節(jié)可能造成RNA的降解，針對這種情況，Affymetrix公司有專門分析福爾馬林固定的、石蠟包埋的組織的全基因組表達的芯片GeneChip（R）HumanX3PArray，該芯片設計的每個基因的探針，都更靠近mRNA3'端位置，因為mRNA越靠近3'端越穩(wěn)定。對于醫(yī)學樣品的分組，臨床上對疾病、行為等的診斷、分類的公認標準是轉(zhuǎn)錄分析中對樣本分組的必不可少的參考，比如腫瘤樣本的病理學判讀、血液分析中的各種參數(shù)、心腦血管分析中的各種參數(shù)、精神類疾病診斷中的行為學參數(shù)等。優(yōu)秀的高級別的科學論文，往往在樣本分組分類上非常嚴格，描述很清晰，篇幅很大。沒有合格樣本及沒有合格樣本分組，任