第六章植物原生質(zhì)體融合技術(shù)黃秀梅

植物原生質(zhì)體融合基本過程目前一頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前二頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)◆Why技術(shù)應(yīng)用植物原生質(zhì)體融合的意義：◆克服種、屬以上植物有性雜交不親和性障礙◆為攜帶外源遺傳物質(zhì)的大分子滲入細(xì)胞創(chuàng)造條件目前三頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)◆How植物原生質(zhì)體融合技術(shù)方法植物原生質(zhì)體的制備植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)植物原生質(zhì)體的融合目前四頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)1、原生質(zhì)體的概念及培養(yǎng)的意義2、原生質(zhì)體材料來源3、原生質(zhì)體的分離4、原生質(zhì)體的純化目前五頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)概念：除去植物細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞，稱為原生質(zhì)體目前六頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)★植物葉片－取材容易－比較容易用酶解法分離★植物根尖組織－可由各種植物的種子萌發(fā)后取得★植物花粉－產(chǎn)生單倍體原生質(zhì)體★愈傷組織、懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞－細(xì)胞壁容易解離目前七頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前八頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前九頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前十頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前十一頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)例:煙草葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的分離1).材料的準(zhǔn)備與消毒：2).酶解：3).純化：4).原生質(zhì)體的活力測(cè)定目前十二頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)1).材料的準(zhǔn)備與消毒選取在溫室中生長(zhǎng)兩個(gè)月左右的煙草植株從生長(zhǎng)健康的植株上摘取充分展開的嫩葉片經(jīng)自來水沖洗干凈后放入70%乙醇中進(jìn)行表面消毒然后再放入2%次氯酸鈉溶液中處理10分鐘接著用無菌水洗滌3～4次，以充分除去消毒劑目前十三頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)2).酶解

用一把尖鑷子，小心撕去葉片的下表皮，將葉片切成2cm長(zhǎng)的小片，然后放入含酶溶液中處理。（注意：使撕去表皮的一面朝下，溫度25～28℃下經(jīng)3-4小時(shí)的酶解反應(yīng)，其間輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿若干次）目前十四頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)3).純化

將酶解懸浮液通過300-400目網(wǎng)，以除去大的未消化的碎片 然后將含有原生質(zhì)體的酶液收集在離心管中，低速離心，使原生質(zhì)體沉于管底，傾去上清液 在離心管中加入適量洗滌液，再離心；重復(fù)此步驟3次，使酶解液充分除去； 最后用原生質(zhì)體培養(yǎng)液離心一次目前十五頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)分離、洗滌、純化原生質(zhì)體的試劑試劑分離洗滌純化KH2PO427.2mgKNO3101mgCaCl2.2H2O1480mgMgSO4.7H2O240mgKI0.16mgCuSO4.5H2O0.025mg甘露醇13%纖維素酶4%果膠酶0.4%蔗糖----21%pH5.65.65.6與分離試劑相同與分離試劑相同目前十六頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)4).原生質(zhì)體的活力測(cè)定

形態(tài)： 把形態(tài)上完整，富含細(xì)胞質(zhì)，顏色新鮮的原生質(zhì)體釋放到降低滲透壓濃度的洗滌液或培養(yǎng)基中，即可見到分離后縮小的原生質(zhì)體會(huì)恢復(fù)原態(tài)，成為正常膨大的一般是有活力的原生質(zhì)體。 染色法： 用0.1%酚藏花紅液染色，活的原生質(zhì)體能著紅色 用熒光素雙醋酸酯（FDA）染色，在熒光顯微鏡下觀察到帶有熒光的是有活力的原生質(zhì)體目前十七頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)FDA法的原理FDA本身不具有極性，不能發(fā)出熒光，可以自由出入細(xì)胞膜。在活細(xì)胞中，F(xiàn)DA被酯酶裂解，釋放出有極性的熒光素。熒光素不能自由穿越質(zhì)膜，在活細(xì)胞中積累。熒光素在死細(xì)胞中不能積累。在UV照射下，活細(xì)胞中的熒光素發(fā)出綠色熒光。目前十八頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)FDA熒光素活細(xì)胞死細(xì)胞請(qǐng)思考活細(xì)胞死細(xì)胞FDA先用丙酮配成0.5%的母液，終濃度為0.01%目前十九頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)原生質(zhì)體分離純化流程圖目前二十頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)淺層液體培養(yǎng)法：

在培養(yǎng)皿或三角瓶中注入3~4ml原生質(zhì)體培養(yǎng)液，然后將純凈的原生質(zhì)體，按一定的細(xì)胞密度注入并進(jìn)行培養(yǎng)固體培養(yǎng)法 原生質(zhì)體按照一定細(xì)胞起始密度，均勻分布于薄層固體培養(yǎng)基中 此法優(yōu)點(diǎn)有利于對(duì)單個(gè)原生質(zhì)體的胞壁再生和對(duì)細(xì)胞團(tuán)形成的全過程進(jìn)行定點(diǎn)觀察雙層培養(yǎng)法

在固體培養(yǎng)基上，加入適宜原生質(zhì)體胞壁再生和細(xì)胞分裂的液體培養(yǎng)基目前二十一頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前二十二頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)

細(xì)胞壁再生： 體積膨大，葉綠體重新排列，新的細(xì)胞壁開始合成，細(xì)胞由球形變成橢圓形。 細(xì)胞分裂形成細(xì)胞團(tuán)： 一般在培養(yǎng)2-3天后細(xì)胞質(zhì)增加，細(xì)胞器增殖，DNA、蛋白質(zhì)等合成增加，細(xì)胞分裂，形成小的細(xì)胞團(tuán)，發(fā)育成愈傷組織或胚狀體。 器官形成植株再生： 從愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)生 胚狀體發(fā)育目前二十三頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前二十四頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)原生質(zhì)體的活力 影響因素：制備原生質(zhì)體的方法，滲透壓穩(wěn)定劑種類、濃度，質(zhì)膜穩(wěn)定劑種類、濃度，溫度和保溫時(shí)間原生質(zhì)體密度 起始密度一般為104-105個(gè)/mL細(xì)胞壁再生速度 植物種類和取材的生理狀態(tài)；培養(yǎng)細(xì)胞所處的時(shí)期；酶解時(shí)所用質(zhì)膜穩(wěn)定劑種類原生質(zhì)體培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境 培養(yǎng)基 原生質(zhì)體培養(yǎng)的環(huán)境：光照、溫度、濕度目前二十五頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)細(xì)胞融合(cellfusion)概念： 又稱細(xì)胞雜交(cellhybridizaion)：離體條件下用人工的方法把不同的細(xì)胞通過無性方式融合成一個(gè)雜合細(xì)胞的技術(shù)。細(xì)胞融合的意義： 克服種、屬以上植物有性雜交不親和性障礙 為攜帶外源遺傳物質(zhì)的大分子滲入細(xì)胞創(chuàng)造條件目前二十六頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前二十七頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前二十八頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)植物原生質(zhì)體融合基本過程目前二十九頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)◆鹽類融合法◆高Ca2+和高pH值融合◆聚乙二醇（PEG）融合法◆PEG與高Ca2+和高pH值結(jié)合融合法◆電融合法目前三十頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)A.鹽類融合法鹽類融合劑種類硝酸鹽類：NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2氯化物類：NaCl、CaCl2、MgCl2、BaCl2葡聚糖硫酸鹽類：葡聚糖硫酸鉀、葡聚糖硫酸鈉鹽類融合的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：鹽類融合劑對(duì)原生質(zhì)體的活力破壞力小缺點(diǎn)：融合頻率低，對(duì)液泡化發(fā)達(dá)的原生質(zhì)體不易誘發(fā)融合目前三十一頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)B.高Ca2+和高pH值融合Ca2+濃度0.05mol/L目前三十二頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)具體做法(以煙草為例)取分離、純化好的兩種親本原生質(zhì)體以1:1的比例混合;加入0.05mol/LCaCl2.2H2O和0.4mol/L甘露醇;再用甘氨酸鈉緩沖pH值到10.5，成為融合液，同時(shí)在37℃下保溫0.5h;用0.4mol/L甘露醇洗凈高CaCl2和高pH值；兩種原生質(zhì)體的融合率達(dá)到10%。目前三十三頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)C.聚乙二醇（PEG）融合法Polyethyleneglycol(PEG)是一種多聚化合物,分子式H(OHCH2-CH2)nOH,平均相對(duì)分子量200-20000之間融合機(jī)制：可能是由于帶有大量負(fù)電荷的PEG分子和原生質(zhì)體表面的負(fù)電荷間在鈣離子的連接下形成靜電鍵，促使異源的原生質(zhì)體間的粘著結(jié)合用相對(duì)分子質(zhì)量為1540的PEG處理40-50min；再用培養(yǎng)液緩慢稀釋PEG最后洗去PEG，得到10%的異核體目前三十四頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)D.PEG與高Ca2+和高pH值結(jié)合融合法先用PEG處理30min；（PEG是相鄰原生質(zhì)體表面間的分子橋）然后用高Ca2+和高pH值液，稀釋PEG；（引起原生質(zhì)體表面電荷的紊亂和再分布，從而促進(jìn)了融合）再用培養(yǎng)液洗去高Ca2+和高pH值目前三十五頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合過程目前三十六頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)E.電融合法原理： 改變?cè)|(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜形成融合體。優(yōu)點(diǎn)： 對(duì)原生質(zhì)體的損害小，融合率高，重復(fù)性強(qiáng)；裝置精巧、方便簡(jiǎn)單，可在顯微鏡下觀察或錄像融合過程，免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程，誘導(dǎo)過程可控性強(qiáng)。目前三十七頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前三十八頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)電融合基本過程將制備好的親本原生質(zhì)體均勻混合放入融合小室，微電極型只有一個(gè)小室，平行電極型有4個(gè)小室，兩電極間隔3mm，整個(gè)裝置放在一個(gè)培養(yǎng)皿中微電極型：用5-12微安的脈沖電流間斷刺激1-5毫秒，原生質(zhì)體在幾秒到幾十秒鐘的時(shí)間內(nèi)會(huì)發(fā)生暫時(shí)性的收縮，兩層膜之間形成小孔，連接成橋，形成一個(gè)個(gè)泡囊，經(jīng)點(diǎn)連接到面連接，最后形成融合體,整個(gè)過程約10-30分平行多電極融合裝置法：經(jīng)過1兆赫如150V/cm交流電場(chǎng)發(fā)生雙向電脈沖，原生質(zhì)體在電場(chǎng)力的作用下，極化產(chǎn)生偶極子，原生質(zhì)體緊密排開成串珠狀。在適當(dāng)時(shí)間和強(qiáng)度的直流電脈沖(50ms,1.2-2KV/cm)作用下，質(zhì)膜發(fā)生被擊穿，進(jìn)一步形成融合體目前三十九頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)細(xì)胞電融合過程目前四十頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前四十一頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)原生質(zhì)體的融合過程包括3個(gè)主要階段：1)兩個(gè)或多個(gè)原生質(zhì)體的質(zhì)膜彼此靠近；2)局部區(qū)域質(zhì)膜緊密粘連，彼此融合；3)融合完成，形成球形的異核體或同核體。目前四十二頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)PEG誘導(dǎo)法：PEG規(guī)格、純度，作用時(shí)間電誘導(dǎo)法：原生質(zhì)體密度交流電壓交變電場(chǎng)的振幅頻率交變電場(chǎng)的處理時(shí)間直流高頻電壓脈沖寬度脈沖次數(shù)目前四十三頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)A、融合體的類型B、雜種細(xì)胞選擇的方法C、細(xì)胞雜種的鑒定目前四十四頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)A、融合體的類型自體融合：發(fā)生在親本原生質(zhì)體自身異體融合諧和的細(xì)胞雜種：具有雙親全套染色體組的異源兩倍體部分諧和的細(xì)胞雜種：雙親的染色體經(jīng)逐步排斥，便發(fā)生少量染色體的重組，然后進(jìn)入同步分裂，最后形成帶有部分重組染色體的植株異胞質(zhì)體細(xì)胞雜種：親本的染色體全部被排斥，但胞質(zhì)是雙親的嵌合細(xì)胞雜種：不同種的雙親原生質(zhì)體，發(fā)生了膜融合和胞質(zhì)融合，尚未發(fā)生核融合。雙親的細(xì)胞核各自發(fā)生核分裂，接著形成細(xì)胞壁，最終形成嵌合體植物目前四十五頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)B、雜種細(xì)胞選擇的方法互補(bǔ)選擇法(遺傳或抗性)： 選擇一個(gè)葉綠體缺失突變體，這一突變體在限定培養(yǎng)基上，能分裂、分化形成植株。具有正常葉綠素的植株，在上述限定培養(yǎng)基上，則不能分裂形成大細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）可見標(biāo)記法： 凹穴培養(yǎng)皿分離法：根據(jù)融合后異核體和親本原生質(zhì)體的形態(tài)特征之區(qū)別 微吸管分離法：用一種向吸管根據(jù)可見標(biāo)記吸取異核體，進(jìn)行“看護(hù)培養(yǎng)”，以獲得雜種植物目前四十六頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)生長(zhǎng)特性選擇法：利用原生質(zhì)體對(duì)培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細(xì)胞。物理特性選擇法：利用親本原生質(zhì)體大小、顏色、漂浮密度及電脈差異率等差異選擇雜種。其他方法：如采用顯微操作技術(shù)也能把單個(gè)異核體分離出來進(jìn)行培養(yǎng)。目前四十七頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)異硫氰酸熒光素（FITC）和異硫氰酸羅丹明（RITC）分別發(fā)出綠色和紅色◆熒光染料法兩個(gè)親本原生質(zhì)體在融合前用能發(fā)不同顏色熒光的熒光染料進(jìn)行染色。細(xì)胞分類器辨別和收集發(fā)兩種熒光的異核體。但儀器價(jià)格昂貴，不常用。目前四十八頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前四十九頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前五十頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)C、細(xì)胞雜種的鑒定（1）雜種植物形態(tài)特征、特性鑒定（2）雜種植物的核型分析（3）同工酶分析（4)分子標(biāo)記鑒定：RFLP鑒定、RAPD 標(biāo)記鑒定目前五十一頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)18條染色體36條染色體目前五十二頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十七點(diǎn)幾種細(xì)胞融合成功的例子融合生物種類細(xì)胞來源成功年代煙草兩個(gè)種間葉——葉1972甘藍(lán)——青菜葉——根1972大豆——馬唐草愈傷組織——葉1972矮牽牛——龍面花葉——花瓣1973大麥——花生種子