《生物制藥》第六章 核酸類藥物

“珍奧核酸”的爭論1998年4月，大連珍奧核酸科技發(fā)展有限公司在大連開發(fā)區(qū)建成一期工程。珍奧核酸說明書摘錄增強基因自我修復能力，顯著改善腦機能，促進新陳代謝及細胞分裂，提高免疫力，美容養(yǎng)顏潤膚。核酸具有抗病毒，抑腫瘤，抗衰老，健腦益智的功效。在臨床實驗中，令醫(yī)學界十分驚奇的是：在糖尿病及并發(fā)癥，肝臟疾病，高脂血癥，腦血栓后遺癥等心腦血管疾病，老年癡呆癥，肢體震顫麻痹（帕金森氏?。?，關節(jié)炎，白細胞減少癥，神經系統疾病，性功能減退，肝腎受損等諸多方面，核酸都顯現出獨特的保健功效。在廣告中加入38位因研究核酸而獲得諾貝爾獎的科學家的材料

“珍奧核酸”被列入“98年國家級火炬計劃”，成為大連的重點推薦產品。在兩年的時間里，“珍奧核酸”獲得：“全國第十二屆發(fā)明展覽金獎”中國保健科技協會“向消費者推薦產品”衛(wèi)生部“2000年中老年保健國際學術論壇暨中國保健品國際博覽會金獎”遼寧省政府“醫(yī)藥行業(yè)科技進步一等獎”方舟子：“核酸營養(yǎng)是個商業(yè)大騙局”/s/blog_499232d2010004vg.html中國“人類基因組計劃”項目負責人楊煥明：“所謂核酸食品在營養(yǎng)價值上和米粉沒有太大的差別”加州理工學院院長戴維·巴爾的摩（1975年諾貝爾醫(yī)學獎）：“據我所知，沒有證據表明核酸是一種營養(yǎng)物或有益健康。在我看來它不可能有任何益處?！钡诹潞怂犷愃幬锏谝还?jié)核酸類藥物概述第二節(jié)重要核酸類藥物的制備第一節(jié)核酸類藥物概述一、發(fā)展歷程在1869年，F.Mischer從細胞核中分離得到一種酸性物質，即現在被稱為核酸的物質。1939年，E.Knapp等第一次用實驗方法證實核酸是生命遺傳的基礎物質。核酸不僅攜帶有各種生物所特有的遺傳信息而且影響生物的蛋白質合成和脂肪、糖類的代謝。核酸類藥物概述核酸是一種多聚體大分子，它的組成單元是核苷酸，將核苷酸中的磷酸基團去掉，剩余部分稱核苷，核苷進一步分解可生成戊糖和堿基。胰核酸酶胰、腸核苷酸酶核苷酶返回核酸類藥物概述核苷及其衍生物干擾病毒DNA的合成，治療病毒疾病。腺苷、肌苷、尿苷、核苷酸、脫氧核苷酸、雙丁酰環(huán)腺苷酸、胞二磷膽堿、核苷三磷酸等核酸組分及衍生物，是天然的代謝激活劑，有助于改善機體的物質代謝和能量代謝，加速受損組織的修復。臨床廣泛用于放射病、血小板減少、急慢性肝炎、血細胞減少、心血管疾病等。輔酶A是調節(jié)糖、脂肪及蛋白質代謝的重要因子，用于治療動脈硬化、脂肪肝、各種肝炎等。返回目錄嘌呤核苷酸GMPAMP嘧啶核苷酸的結構返回目錄二、核酸類藥物分類－具有天然結構的核酸類物質如：ATP、GTP、CTP、UTP、IMP、CoA、CoI(NAD+)

、CoII(NADP+)

。這類藥物有助于改善物質代謝和能量平衡，修復受損組織，促使缺氧組織恢復正常生理機能。臨床上廣泛用于放射病、血小板減少癥、白細胞減少癥、急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎縮等的治療。這些藥物多數是生物體自身能夠合成的物質，在具有一定臨床功能的前提下，毒副作用小，它們的生產基本上都可以經微生物發(fā)酵或從生物資源中提取。ATP：用于心肌炎、心肌梗死、心力衰竭、及動脈或冠狀動脈硬化、肝炎等的治療或輔助治療。肌苷：用于急慢性肝炎、肝硬化、白細胞減少、血小板減少等。核酸類藥物分類－自然結構核酸類物質的類似物和

聚合物它們是當今人類治療病毒、腫瘤、艾滋病的重要藥物，也是產生干擾素、免疫抑制的臨床藥物。主要有疊氮胸苷、阿糖腺苷、阿糖胞苷、聚肌胞等。它們大部分通過由自然結構的核酸類物質進行半合成為結構改造物，或者采用化學一酶合成法。三、生產方法1、直接提取法從生物材料中直接提取。2、水解法從相應的生物材料中水解而得。（1）酶水解法（2）堿水解法（3）酸水解法3、化學合成法4、酶合成法5、發(fā)酵法

第二節(jié)重要核酸類藥物的制備

一、RNA的提取與制備

在工業(yè)上主要由RNA生產5’-核苷酸。RNA經桔青酶作用可得鮮厚味強的5-’呈味核苷酸；在醫(yī)藥上，可治肝炎、心臟病、關節(jié)炎、抗癌和抗病毒；RNA還可應用于洗滌劑、乳化劑、奶液和雪花膏等，在日用化妝品中，有潤膚養(yǎng)顏的效果；在農業(yè)生產中，RNA的使用可使農作物早熟和增產。（一）RNA的提取與制備1.RNA的工業(yè)來源從微生物中提取RNA，是工業(yè)上最實際和有效的方法，一些最常見的菌體含有豐富的核酸資源。通常在細菌中RNA占5％-25％，在酵母中占2.7％～15％，在霉菌中占0.7%~28%,面包酵母含RNA4.1％～7.2％。

2.高RNA含量酵母菌體的篩選酵母菌體收率高，易于提取RNA?？梢詮淖匀唤绾Y選并可用誘變育種的方法提高酵母的RNA含量。

（一）RNA的提取與制備發(fā)酵法生產高含量RNA酵母及其RNA提取工藝流程。（一）RNA的提取與制備3．用工業(yè)廢水培養(yǎng)高含量RNA酵母使用工業(yè)廢水培養(yǎng)高含量RNA酵母減少環(huán)境污染，降低糧食消耗，如味精生產廢水中的成份基本上可供酵母生長。4.RNA提取實例返回目錄（二）DNA的提取與制備

DNA，可以促進細胞的活化，調節(jié)新陳代謝，延緩機體衰老，維護正常免疫功能有積極的作用。1．工業(yè)用DNA的提取纖維狀DNA沉淀（二）DNA的提取與制備2．具有生物活性DNA的制備可從動物內臟（肝、脾、胸腺）中提取制備，操作條件0～3℃。

動物內臟加4倍量生理鹽水經組織搗碎機搗碎1分鐘，勻漿于2500rpm離心30分鐘，沉淀用同樣體積的生理鹽水洗滌3次，每次洗滌后離心，將沉淀懸浮于20倍量的冷生理鹽水中，再搗碎3分鐘，加入2倍量5％十二烷基磺酸鈉，并攪拌2～3小時，在0℃2500rpm離心，在上層液中加入等體積的冷乙醇，離心即可得纖維狀DNA，再用冷乙醇和丙酮洗滌，減壓低溫干燥得粗品DNA。酶解法1.酶解法制備脫氧核苷酸2.酶解法制備戊糖核苷酸3．雙酶法生產肌苷酸和鳥苷酸（I+G）。呈味核苷酸的主要品種是肌苷酸鈉和鳥苷酸鈉，商品名稱為（I+G），用核酸酶P1降解RNA可獲得GMP和AMP，其中AMP經脫氨生成IMP。雙酶法生產肌苷酸和鳥苷酸的工藝流程4．菌體自溶法生產核苷酸

磷酸二酯酶在合適的條件下降解細胞內的RNA可產生5′-核苷酸。在國內用谷氨酸產生菌體自溶法生產5′-核苷酸。工藝流程如下：5．堿水解法生產2'、3'-混合核苷酸。用酶法降解RNA得到的是5’-核苷酸，可用于生產呈味核苷酸。2’、3’-混合核苷酸在醫(yī)藥上有它的特殊用途。對血小板減少，白血球減少癥和癌癥化療后升白血球均有較好療效。用堿水解RNA可產生2’、3’-混合核苷酸。實際上，是由于稀堿水解過程中，先形成一個中間環(huán)狀物2’、3’–環(huán)狀核苷酸，它很不穩(wěn)定，進一步水解生成2’，3’–核苷酸。（三）發(fā)酵法生產肌苷酸IMP生成總反應過程肌苷酸的應用國內生產企業(yè)一步法（發(fā)酵法）

1.肌苷酸生產菌選育（1）解除微生物自身的反饋調節(jié)a.解除AMP、GMP對PRPP轉酰胺酶的反饋抑制。b.切斷5‘-IMP繼續(xù)代謝生成GMP和AMP的途徑。

因此，選擇可能產生核苷酸的產氨短桿菌（Brevibacteriumammoniagene）為出發(fā)菌株，誘變?yōu)橄汆堰嗜毕菪屯蛔冎辏僬T變?yōu)轼B嘌呤缺陷型突變株。IMP的阻遏如何解決？（2）改變核苷酸對細胞膜的滲透性

核苷或堿基容易透過細胞膜，而核苷酸難于透過細胞膜。日本科學家發(fā)現，Mn2+對于產氨短桿菌核苷酸的膜透性起著關鍵作用，Mn2+限量的情況下，菌體產生膨脹異?，F象，細胞膜允許IMP滲透到胞外，積累IMP。

Mn2+限量與生物素亞適量結果相同，但機制不同。Mn2+亞適量：培養(yǎng)后期，細胞形態(tài)異常（伸長、膨脹、不規(guī)則）生物素亞適量：為乙酰CoA羧化酶的輔基，影響脂肪酸生物合成，間接影響細胞膜磷脂合成，從而影響細胞膜透性。發(fā)酵法生產肌苷工藝要點：1、菌株選育：變異芽孢桿菌2、一級種子培養(yǎng)葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母浸膏1％，玉米漿0.5％尿素0.5％，氯化鈉0.25％；pH值7溫度：32度左右，轉速100r/min，18h3、二級種子培養(yǎng)（50L發(fā)酵罐，定容25L）培養(yǎng)基：一級種子培養(yǎng)基接種量：3％溫度：32度左右，轉速320r/min，12～15h通風量：1：0.25V/(V.min)菌體濃度：OD650nm＝0.784、發(fā)酵（50L發(fā)酵罐，定容35L）培養(yǎng)基：淀粉水解糖10％，干酵母水解液1.5％，豆餅水解液0.5％，硫酸鎂0.1％，氯化鉀0.2％，磷酸氫二鈉0.5％，尿素0.4％，硫酸銨1.5％，消泡劑0.5mL/L，pH7接種量：0.9％溫度：32度左右，轉速320r/min，93h通風量：1：0.5V/(V.min)5、提取精制

工藝討論：1、發(fā)酵液采用葡萄糖，產品質量最好；培養(yǎng)基中要

保證充足氮源，最好用氨氣。2、提取工藝改進直接上柱3、溫度對提取的影響

冬夏低春秋高，32度放置15h后進行洗脫，收率降10％，48h后洗脫，收率降30％左右；室溫20度放置48h后洗脫，收率降低5％左右。（四）疊氮胸苷（AZT）商品名：Refrovir，中文商品名齊多夫定。是第一種被美國FDA批準用于臨床的治療艾滋病的新藥。藥理作用：在體內經磷酸化后生成疊氮胸苷酸，取代了正常的胸嘧啶核苷酸（TMP）參與病毒DNA合成，而含AZT成分的DNA不能繼續(xù)復制，從而阻止病毒增殖。（一）疊氮胸苷（AZT）化學合成，起始原料是胸苷，成本高。（一）疊氮胸苷（AZT）AZT的常見付作用為貧血、白血球減少，有32%的患者服藥后引起骨髓壞死癥，破壞人體造血功能。1990年5月《新英格蘭醫(yī)學雜志》發(fā)表了第2個治療愛滋病的藥物，稱雙脫氧肌苷（DDI），商品名稱Videx，由美國國立癌癥研究所于1985年發(fā)現的。（一）疊氮胸苷（AZT）DDI的化學結構和藥理活性與AZT相似，治療艾滋病的效果與AZT相同。DDI的抗病毒作用，是通過減慢HIV在人體細胞中的復制（或繁殖）速度和在免疫系統