食品化驗員微生物檢測知識培訓

微生物(microorganism，microbe)是一群個體微小、結(jié)構(gòu)簡單的低等生物的統(tǒng)稱。通常人的肉眼看不見，必須借助于光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到。概念目前一頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點原核微生物微生物的分類非細胞型真核微生物無細胞結(jié)構(gòu)，無產(chǎn)生能量的酶系統(tǒng)，由單一核酸和蛋白質(zhì)衣殼組成，必須在活細胞內(nèi)增殖，病毒屬于此類微生物。細胞核的分化程度高，有核膜、核仁和染色體，能進行有絲分裂，如真菌、藻類細胞分化程度低，只有DNA盤繞而成的擬核，無核仁和核膜,包括細菌、衣原體、支原體、立克次體、螺旋體和放線菌。目前二頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點微生物的主要特點“短”——個體微?。海?.1mm，需借助顯微鏡觀察“平”——構(gòu)造簡單：單細胞，簡單多細胞或非細胞“快”——繁殖快速：20分鐘一代，一天內(nèi)1個10億“多”——各類多樣：細菌、真菌、病毒、原生動物“廣”——分布廣泛：土壤、空氣、水和極端環(huán)境中目前三頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點細菌細菌的群體形態(tài)在固體培養(yǎng)基上（內(nèi)）的群體形態(tài)——菌落單個或少數(shù)的細胞在固體培養(yǎng)基上（內(nèi)）會形成的以母細胞為中心的一堆肉眼可見的，有一定形態(tài)、構(gòu)造特征的子細胞集合。細菌菌落常表現(xiàn)為濕潤、粘稠、光滑、較透明、易挑取、質(zhì)地均勻以及菌落正反面或邊緣與中央部位顏色一致等。單位:CFU目前四頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點任務一:微生物培養(yǎng)基目前五頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點任務分析一、檢測意義

培養(yǎng)基是供微生物、動植物組織生長和維持用的人工配制的養(yǎng)料。要制作培養(yǎng)基，就需要了解微生物的營養(yǎng)物質(zhì)吸收方式以及常用的培養(yǎng)基配制技術(shù)。二、檢測方法GB\T4789.28-2003食品微生物學檢驗染色法、培養(yǎng)基和試劑

目前六頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點學習目標知識目標1、微生物生長所需要的基本營養(yǎng)及運輸方式。2、培養(yǎng)基的概念、分類及配制原則技能目標1、正確進行培養(yǎng)基的分裝和無菌檢驗2、正確配制實驗室常用培養(yǎng)基目前七頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點相關(guān)知識一、微生物的營養(yǎng)1.微生物的細胞化學構(gòu)成微生物細胞水（70%-90%）干物質(zhì)無機物（鹽）有機物蛋白質(zhì)、多糖、脂、核酸、維生素、有機酸等及其降解產(chǎn)物目前八頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點微生物的營養(yǎng)構(gòu)成

微生物的營養(yǎng)物質(zhì)按照在機體的生理作用不同可分為：碳源、氮源、能源、無機鹽、水和生長因子微生物、動物、植物之間存在營養(yǎng)上的統(tǒng)一性目前九頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點二、培養(yǎng)基的定義

培養(yǎng)基提供微生物生長繁殖和生物合成名種代謝產(chǎn)物所需要的、按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物，提供微生物所需能量，包括碳源、氮源、無機元素、生長因子及水、氧氣等三、培養(yǎng)基的分類

(1)按成分分類天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基復合（半合成）培養(yǎng)基（2）按物理狀態(tài)分類半固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基目前十頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點目前十一頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點目前十二頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點任務二:消毒與滅菌技術(shù)目前十三頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點任務分析一、檢測意義

在進行微生物檢驗前，可以通過消毒和滅菌技術(shù)，不同程度的將實驗物品和實驗環(huán)境中的微生物減少甚至完全殺滅，從而減少或消除外來微生物對試驗結(jié)果的影響，生物檢測結(jié)果的真實性和準確性二、檢測方法（1）加熱滅菌干熱滅菌濕熱滅菌（2)輻射滅菌—紫外線滅菌目前十四頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點干熱滅菌法原理：干熱滅菌是在電熱干燥箱內(nèi)利用高溫干燥空氣（160℃~170℃）進行滅菌，它是利用高溫使微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌目的。此法適用于玻璃器皿如移液管、試管和培養(yǎng)皿的滅菌。培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品不能采用干熱滅菌。細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時，當環(huán)境和細胞內(nèi)含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。干熱滅菌所需溫度要高，時間長1-2h，但干熱滅菌溫度不能超過180℃，否則，包器皿的報紙或棉塞就會燒焦，甚至引起燃燒。目前十五頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點干熱滅菌法1、將培養(yǎng)皿、吸管等下班器皿洗凈干燥后，用舊報紙包好，或裝入特制的鐵筒中2將包裝好的玻璃儀器擺入烤箱中，彼此間留有一定的空隙以便流通空氣。3、關(guān)緊箱門，接上電源4、設定溫度。滅菌溫度一般在160℃-170℃保持1-2個小時5、待自然降溫冷卻后才能開門取出玻璃器皿，避免由于溫度突然下降引起玻璃器皿碎裂。目前十六頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點濕熱滅菌法

高壓蒸氣滅菌法主要是指將物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸氣，待水蒸氣急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時由于蒸氣不能溢出，而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力，從而使沸點增高，得到高于100℃的溫度，導致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大。因為在濕熱情況下，菌體吸收水分，使蛋白質(zhì)易于凝固；同時濕熱的穿透力強，可增加滅菌效力。討論：干熱滅菌法和濕熱滅菌法哪個殺菌效力大?目前十七頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點濕熱滅菌法一般培養(yǎng)基用0.1MPa，121.5℃，15—30min可達到徹底滅菌的目的。滅菌的溫度及維持時間隨滅菌物品的性質(zhì)和容量等具體性況而有所改變。打開鍋蓋加水放入待滅菌的物品密封設定溫度時間通電加熱滅菌斷電開蓋目前十八頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點紫外線滅菌法紫外線滅菌是用紫外燈進行的，波長為200-300nm的紫外線都有殺菌能力，其中以260nm的殺菌能力最強，它的殺菌效率與殺菌時間是成正比的，它的原理主要是抑制了DNA的復制，另一方面，由于輻射能使空所中的氧電離成【0】，再使氧氣生成臭氧或使水氧化生成過氧化氫。臭氧和過氧化氫均有殺菌的作用。紫外線的穿透力不大，所以只適用于無菌室的空氣及物體及物體表面的滅菌。紫外線燈距照射物不超過1.2m為宜。為了加強紫外線滅菌效果，在打開紫外燈前；可在無菌室內(nèi)噴灑石炭酸溶液，一方面使空氣中附著有微生物的塵埃降落，另一方面也可以殺死一部分細菌，無菌室內(nèi)的桌面、凳子可用2%-3%的來蘇樂擦洗，然后再打開紫外燈照射0.5-1h，即可增強殺菌效果，達到滅菌目的.目前十九頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點任務三:食品中菌落總數(shù)的檢驗目前二十頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點任務分析一、檢測意義菌落總數(shù)主要作為判別食品被污染程度的標志判定細菌在食品中繁殖的動態(tài)二、檢測方法

GB4789.2-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》目前二十一頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點

菌落總數(shù)指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得1ml（或1g）被檢樣品中所含細胞菌落的總數(shù)，以CFU\g(ml)。菌落總數(shù)并不表示實際中的所有細菌總數(shù)，也不能區(qū)分其中細菌的種類，只包括一群在計數(shù)平板瓊脂中生長發(fā)育、嗜中溫的需氧和兼性厭氧的細菌菌落總數(shù)，所以有時被稱為雜菌數(shù)，需氧菌數(shù)等。食品中細菌菌落總數(shù)越多，則食品含有致病菌的可能性越大，食品質(zhì)量越差；菌落總數(shù)越小，則食品含有致病菌的可能性越小。須配合大腸菌群和致病菌的檢驗，才能對食品做出較全面的評價。目前二十二頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點檢驗程序檢樣25g(mL)樣品+225mL稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋選擇2個~3個適宜稀釋度樣品勻液，各取1mL分別加入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)每個培養(yǎng)皿中加入15~20mL平板計數(shù)培養(yǎng)基，混勻36℃±1℃48h±2h計算各平板菌落數(shù)計算菌落總數(shù)報告目前二十三頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點培養(yǎng)基與試劑:平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基

無菌生理鹽水目前二十四頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點操作前，用鑷子取酒精棉消毒桌子、消毒手。目前二十五頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點從培養(yǎng)皿筒中取出培養(yǎng)皿。培養(yǎng)皿筒取出培養(yǎng)皿目前二十六頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點在培養(yǎng)皿上編號提示：培養(yǎng)皿上的標記為稀釋倍數(shù)。固體樣品\半固體樣品：稀釋倍數(shù)為10-1、10-2、10-3液體樣品：稀釋倍數(shù)為100、10-1、10-2-1-1-2-2-3-3空白空白00-1-1-2-2空白空白目前二十七頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點固體\半固體樣品稱量用鑷子取酒精棉擦手，點燃酒精燈；取25g(ml)樣品加入225ml生理鹽水中（對樣品進行10倍稀釋）目前二十八頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點25g+225mL生理鹽水10-1-1-1-2-2-3-3空白空白

10-2

10-3滅菌生理鹽水固體\半固體樣品1mL1mL1mL1mL1mL目前二十九頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點在培養(yǎng)皿中加入平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（15~20mL），輕搖培養(yǎng)皿，使試樣與培養(yǎng)基混勻。提示：倒培養(yǎng)基時，培養(yǎng)皿的開口盡量要??；同時，開口對著酒精燈。提示：搖動培養(yǎng)皿時，切勿使培養(yǎng)基濺到培養(yǎng)皿蓋上。目前三十頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點待培養(yǎng)基凝固后，將培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱。提示：培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱時要倒置。注意選擇設置為36℃±1℃的培養(yǎng)箱。目前三十一頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點任務四:食品中大腸菌群的檢驗目前三十二頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點任務分析一、檢測意義大腸菌群是作為糞便污染的判定指標大腸菌群是評價食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標之一二、檢測方法

GB4789.3-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》目前三十三頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點大腸菌群系指一群在32～37℃下24hr內(nèi)，能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌群主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標，來評價食品衛(wèi)生質(zhì)量，具有廣泛的衛(wèi)生學意義。目前三十四頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點大腸菌群的檢測第一法大腸菌群MPN計數(shù)法第二法大腸菌群平板計數(shù)法目前三十五頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點第一法：大腸菌群MPN計數(shù)法目前三十六頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點培養(yǎng)基與試劑:月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉湯

煌綠乳糖膽鹽（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉湯無菌生理鹽水無菌1mol/LNaOH

無菌1mol/LHCl目前三十七頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點初發(fā)酵試驗每個樣品，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯），36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24h±2h產(chǎn)氣者進行復發(fā)酵試驗，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h，產(chǎn)氣者進行復發(fā)酵試驗。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。目前三十八頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點LST判定結(jié)果大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時，可以用手輕輕打動試管。目前三十九頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點復發(fā)酵試驗用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管。目前四十頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報告確證的大腸菌群LST陽性管數(shù)，檢索MPN表（見附錄B），報告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值目前四十一頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點第二法：大腸菌群平板計數(shù)法目前四十二頁\總數(shù)四十四頁\編于二十三點實驗步驟及操作要點：1）樣品的稀釋：如第一法2）平板計數(shù)選取2個～3個適宜的連續(xù)稀釋度,每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1mL。同時取1mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對照。3）