實(shí)驗(yàn)二酵母菌種子液的制備

Y(°Bx)xY(°Bx)x實(shí)驗(yàn)二酵母菌種子液的制備-實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）了解酵母菌活化方法（2）了解果汁的簡單制作（3）明確血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的原理（4）掌握測定酵母細(xì)胞總數(shù)、出芽率和死亡率的方法二實(shí)驗(yàn)原理酵母菌通過乙醇發(fā)酵將水果原料中可發(fā)酵的糖轉(zhuǎn)化為乙醇，酵母菌種子液的制備及種子液質(zhì)量對發(fā)酵至關(guān)重要。酵母細(xì)胞總數(shù)、出芽率和死亡率的測定是衡量酵母菌種子液的質(zhì)量指標(biāo)之一。三實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備釀酒酵母；蘋果；白砂糖；手持糖度儀；電磁爐；榨汁機(jī)；血球計(jì)數(shù)板；顯微鏡四試驗(yàn)步驟1果汁（酵母活化培養(yǎng)基）的制備（1）選料：原料要求新鮮，無病蟲害，八成熟以上為宜（2）去皮、核：蘋果的果皮和果核帶有苦味，且果核較小堅(jiān)硬，在破碎打漿時(shí)容易被破碎而進(jìn)入果漿，使酒產(chǎn)生不良風(fēng)味，故應(yīng)去除。（3）打漿（每組制作兩部分：1.5L用于釀酒的果漿和50mL活化酵母菌的果汁）：用于釀果酒的1.5L的果漿制備：蘋果富含多酚氧化酶，為抑制雜菌繁殖和酶促褐變與非酶促褐變的發(fā)生，打漿時(shí)添加偏重亞硫酸鈉護(hù)色，并幫助澄清。添加量為破碎果實(shí)重量的0.15%，將果實(shí)切碎，按照果實(shí)碎塊：水=1:1的比例添加水（榨出的果漿大概為水體積的兩倍），使果肉充分打成糊狀，即充分破壞果肉組織，使其中的可溶性物質(zhì)能從果肉細(xì)胞中游離出來（榨出的果肉不用紗布過濾），之后放入2.5L發(fā)酵瓶中各1.5L。用于活化酵母菌的果汁培養(yǎng)基250ml（供6組用）：按照果實(shí)碎塊：水=2:1的比例添加水（過濾出的果汁大約為加入水的兩倍），使果肉充分打成糊狀，即充分破壞果肉組織，用三層紗布將汁液過濾入燒杯中。（4）接種酵母菌：將燒杯中的果汁培養(yǎng)基加熱至沸騰滅菌，分裝入6個(gè)100mL的錐形瓶中各40mL，待溫度冷卻到30°C左右時(shí)，將斜面上酵母菌挑取接入40mL果汁中，搖勻后用錫紙封上瓶口置于28C生化培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。（5）加果膠酶（加入到裝有1.5L果漿的發(fā)酵瓶中）：蘋果中含有果膠，打漿后黏度大，流動(dòng)性差，加入果膠酶可使?jié){液中的可溶性固形物增加，提高出汁率，果膠酶的添加量為100mL添加0.06g，常溫下酶解24h。（6）調(diào)整成分（第二天1.5L果汁澄清過濾后調(diào)整）：1.7g的糖可以發(fā)酵成1°的酒，要釀成12°的蘋果酒，必須保證果汁中糖的濃度為22°Bx左右，而蘋果汁中糖的濃度約為7%左右，所以添加蔗糖調(diào)節(jié)可溶性固形物至22%左右加糖量1.7x12xX(果汁體積)(g)=100X（果汁體積）1^0（7）加入活化后酵母菌液：每組將活化24h的40mL酵母菌懸液直接加入1.5L經(jīng)過澄清過濾并調(diào)整過成分的果汁中。細(xì)胞數(shù)/mL=(100小格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)/100)X400X整過成分的果汁中。2酵母菌活性測定2.1出芽率和死亡率測定分別滴加一滴0.1%的呂氏堿性美藍(lán)和酵母菌種子液在載玻片上混合，放置10min在顯微鏡下觀察酵母菌，選擇兩三個(gè)視野取平均值，測酵母菌的死亡率和出芽率，酵母菌自身的氧化還原性能把美藍(lán)還原為無色，而死細(xì)胞則沒有還原性。2.2酵母菌總數(shù)測定鏡檢計(jì)數(shù)室：在加樣前，先對計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)加樣品：將清潔干燥的血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的細(xì)口滴管將酵母菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴(不宜過多)，使菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自行進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。注意不可有氣泡產(chǎn)生。靜置5—10分鐘即可計(jì)數(shù)。顯微鏡計(jì)數(shù)：將血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用10倍物鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成40倍物鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5—10個(gè)菌體為宜，若選用16X25規(guī)格的計(jì)數(shù)板，則數(shù)四個(gè)角：左上、右上、左下、右下的四個(gè)中方格，(即100小格)中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。25X16的計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：細(xì)胞數(shù)/mL=(80小格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)/80)X400X10000X稀釋倍數(shù)=A/5X25X104XB16X25的計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：10000X稀釋倍數(shù)=A/4X16X104XB五注意事項(xiàng)配制適當(dāng)濃度的酵母菌懸液，保證血球計(jì)數(shù)板中的每小格中有5-10個(gè)酵母菌調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強(qiáng)弱適當(dāng)，對于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易看清楚計(jì)數(shù)室方格線，或只見豎線或只見橫線。血球計(jì)數(shù)板使用后，用自來水沖洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干如果酵母菌的芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的值來計(jì)算樣品的含菌量。實(shí)驗(yàn)三蘋果酒的釀制1實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私夤频闹谱髟?，學(xué)習(xí)果酒的制作工藝。2實(shí)驗(yàn)原理果酒釀造是利用酵母菌將果汁中的糖分經(jīng)酒精發(fā)酵轉(zhuǎn)變?yōu)榫凭犬a(chǎn)物，再在陳釀、澄清過程中經(jīng)酯化、氧化及沉淀等作用，使之成為酒質(zhì)澄清、色澤美觀、醇和芳香的產(chǎn)品。果酒釀造要經(jīng)歷酒精發(fā)酵和陳釀等兩個(gè)階段。在這兩個(gè)階段中發(fā)生著不同的生物化學(xué)反應(yīng)，對果汁的質(zhì)量起著不同的作用。3實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備釀酒酵母；蘋果；偏重亞硫酸鈉；白砂糖；果膠酶手持糖度儀；電爐；榨汁機(jī)；數(shù)顯電熱恒溫水菌接入，搖動(dòng)果汁使之分散。在28°C培養(yǎng)48h即為浴鍋；pH計(jì)酵母菌種子液。4實(shí)驗(yàn)過程(7)主發(fā)酵：發(fā)酵溫度為18?25C發(fā)酵2d后，1工藝流程表面產(chǎn)出泡沫，并形成一層由果肉碎屑、蛋白質(zhì)、原料挑選清洗去皮、核破碎打漿果膠等物質(zhì)組成的泡蓋，當(dāng)泡蓋開始下沉^面逐加果膠■酶過濾調(diào)整成分加熱消毒一漸澄清，說明發(fā)酵速度變緩f發(fā)酵結(jié)束。這一階接種^酵f發(fā)酵后發(fā)酵過濾陳釀澄清調(diào)配冷處理2操作要點(diǎn)選料：原料要求新鮮，無病蟲害，八成熟以上為宜去皮、核：蘋果的果皮和果核帶有苦味，且果核較小堅(jiān)硬，在破碎打漿時(shí)容易被破碎而進(jìn)入果漿，使酒產(chǎn)生不良風(fēng)味，故應(yīng)去除。打漿：蘋果果肉不僅含有豐富的糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，還富含多酚氧化酶，為抑制雜菌繁殖和酶促褐變與非酶促褐變的發(fā)生，打漿時(shí)添加偏重亞硫酸鈉護(hù)色，添加量為破碎果實(shí)的0.15%,加果膠酶：蘋果中含有果膠，打漿后黏度大，流動(dòng)性差，需加水進(jìn)行稀釋，果漿：水=2:1，加入果膠酶可使?jié){液中的可溶性固形物增加，提高出汁率，果膠酶的添加量為0.06%，酶解溫度為50C，酶解時(shí)間為2h。調(diào)整成分：要發(fā)酵成酒精含量為12%(v/v)的果酒，需要果汁含糖量為17%?22%，因此應(yīng)添加蔗糖調(diào)節(jié)可溶性糖含量至22%，使酵母菌適宜生長。酵母菌活化：將制備好的果汁煮沸，裝入段12?15d。在主發(fā)酵過程注意控制醪液溫度在30C以下，保證發(fā)酵正常進(jìn)行。后發(fā)酵：將上層發(fā)酵液轉(zhuǎn)入新發(fā)酵罐中繼續(xù)發(fā)酵，酵母菌仍對殘?zhí)沁M(jìn)行緩慢發(fā)酵，控制后發(fā)酵溫度為20?25C經(jīng)過15?20d后，發(fā)酵基本停止，發(fā)酵醪中顆粒物質(zhì)凝聚沉淀下來。陳釀：發(fā)酵完畢的酒液分離出酒糟，將酒液放在18?25C下保存90d，通過酒液