第八章 蛋白表達(dá)系

第八章蛋白表達(dá)系第1頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三

基因工程意味著重要的植物或動物蛋白基因可以從宿主中分離出來，插入載體，“carriers”將運(yùn)載外源基因到宿主細(xì)胞中，然后被轉(zhuǎn)化成蛋白。經(jīng)過許多年的發(fā)展，蛋白生產(chǎn)能力的提高已經(jīng)在進(jìn)一步理解基因的功能和所編碼蛋白的功用和相互作用等方面起到了積極作用。第2頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三8.1大腸桿菌中表達(dá)系統(tǒng)

如果將外源基因插入標(biāo)準(zhǔn)的克隆載體，不可能合成重組蛋白，因為基因的表達(dá)依賴于基因周圍的一組信號，這些信號必須能被細(xì)菌識別。這些信號都是一些短的核苷酸序列，為轉(zhuǎn)錄和翻譯提供信號：

第3頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三8.1.1外源基因在大腸桿菌中

高效表達(dá)的原理第4頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三三個最重要的信號：

1）promoter:是轉(zhuǎn)錄起始信號，在E.coli中，啟動子必須能被RNA聚合酶的sigma亞基所識別。2）Teminator：轉(zhuǎn)錄結(jié)束的位點，終止子一般是可以自我配對形成stem-loop的核苷酸序列。3）核糖體結(jié)合位點：能被核糖體識別的位點，轉(zhuǎn)錄成mRNA分子后，核糖體在這一位點上結(jié)合。

第5頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三圖8-1基因表達(dá)的信號

第6頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三1.啟動子

啟動子是表達(dá)載體的最重要的組成成分，這是因為啟動子控制了基因表達(dá)的第一個階段，決定了mRNA合成的速度。獲得重組蛋白的數(shù)量很大程度上取決于表達(dá)載體所攜帶的啟動子。第7頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三第8頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三幾種使用頻率最高的啟動子：

1)lac啟動子：控制編碼β-乳糖苷酶的lacZ基因轉(zhuǎn)錄的序列，可以被IPTG所誘導(dǎo)，所以加入誘導(dǎo)物后，可以誘導(dǎo)啟動子下游的外源基因的表達(dá)。2)trp啟動子：色氨酸啟動子可以被色氨酸抑制，也可以很容易的被3-β-吲哚丙烯酸誘導(dǎo)。

第9頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三幾種使用頻率最高的啟動子：3)tac啟動子：是lac和trp啟動子的雜交分子，比兩者都要強(qiáng)，同樣可以被IPTG所誘導(dǎo)。4)λPL啟動子：是負(fù)責(zé)λDNA分子轉(zhuǎn)錄的啟動子之一。第10頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三2.終止子外源基因在強(qiáng)啟動子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，即RNA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列，形成長短不一的mRNA混合物。第11頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子來自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2T7噬菌體DNA上的Tφ第12頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三3.核糖體結(jié)合位點外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。mRNA翻譯的起始效率主要由其5‘

端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點（RBS）第13頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三Shine-Dalgarno（SD）序列位于翻譯起始密碼子上游的6-8個核苷酸序列5’UAAGGAGG3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結(jié)合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯。第14頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三8.1.2E.coli中重組蛋白的問題

在E.coli中生產(chǎn)蛋白仍然存在許多問題這些問題可以分為兩大類：外源基因的序列；E.coli合成重組蛋白存在限制。

第15頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三1.外源基因序列導(dǎo)致的問題

有三種方式可能導(dǎo)致核苷酸序列阻止外源基因在E.coli中的高效表達(dá)：1）外源基因可能含有內(nèi)元。E.coli缺乏切除內(nèi)元的機(jī)制。2）外源基因可能含有在E.coli作為終止子的序列。3）基因的密碼子可能不適合于E.coli中翻譯。第16頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三解決方法：如果克隆的基因含有內(nèi)元，可以使用mRNA定點突變的方法改變可能的終止序列。用E.coli偏愛的密碼子。另外一個方法，對于小于2kb的基因可以利用化學(xué)合成的片段來代替，利用氨基酸序列作為參考，使用E.coli偏愛的密碼子，并保證不會有提前存在的終止序列。

第17頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三偏愛密碼子的問題

第18頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三2.E.coli合成重組蛋白的限制

利用E.coli作為寄主細(xì)胞合成重組蛋白可能遇到的問題與細(xì)菌的遺傳特性有關(guān)1）E.coli不能加工成正確的重組蛋白。2）E.coli不能正確的折疊蛋白，形成無活性蛋白。3）E.coli可能降解重組蛋白。

第19頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三解決方法最主要的問題是糖基化的問題，到目前為止仍然是無法解決的問題正確折疊也可以通過選擇特異的寄主品系來解決。重組蛋白降解的問題可以使用一個或多個蛋白酶突變E.coli來解決。第20頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三8.1.3真核基因在原核生物中表達(dá)

可能遇到以下幾個問題：①細(xì)菌的RNA聚合酶不識別真核啟動子；②真核基因轉(zhuǎn)錄出mRNA無與原核核糖體結(jié)合的S-D序列；③真核基因產(chǎn)生的mRNA有內(nèi)含子，細(xì)菌無剪接機(jī)制；④真核基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)加工，糖基化，而原核生物無；⑤真核基因產(chǎn)物被原核蛋白酶識別降解。第21頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三解決的辦法：①將真核生物的基因放在原核生物強(qiáng)啟動子之下；②在接S-D序列；③克隆cDNA；④在細(xì)菌中合成無活性蛋白，在體外加工；⑤用特定的變種宿主減少降解。

第22頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三8.2真核生物表達(dá)系統(tǒng)

8.2.1酵母菌表達(dá)系統(tǒng)8.2.2昆蟲表達(dá)系統(tǒng)8.2.3哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)第23頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三8.2.1酵母菌表達(dá)系統(tǒng)

酵母表達(dá)系統(tǒng)擁有轉(zhuǎn)錄后加工修飾功能，操作簡便，成本低廉，適合于穩(wěn)定表達(dá)有功能的外源蛋白質(zhì)，而且可大規(guī)模發(fā)酵，是最理想的重組真核蛋白質(zhì)生產(chǎn)制備用工具。第24頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三1.酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點

酵母是一種單細(xì)胞低等真核生物，培養(yǎng)條件普通，生長繁殖速度迅速，用于表達(dá)基因工程產(chǎn)品時，可以大規(guī)模生產(chǎn)，有效降低了生產(chǎn)成本。第25頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三1.酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點酵母表達(dá)外源基因具有一定的翻譯后加工能力，收獲的外源蛋白質(zhì)具有一定程度上的折疊加工和糖基化修飾，性質(zhì)較原核表達(dá)的蛋白質(zhì)更加穩(wěn)定，特別適合于表達(dá)真核生物基因和制備有功能的表達(dá)蛋白質(zhì)。第26頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三1.酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點某些酵母表達(dá)系統(tǒng)具有外分泌信號序列，能夠?qū)⑺磉_(dá)的外源蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外，因此很容易純化。第27頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三1.酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點應(yīng)用酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)外源基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物時也有不足之處，如產(chǎn)物蛋白質(zhì)的不均一、信號肽加工不完全、內(nèi)部降解、多聚體形成等，造成表達(dá)蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上的不一致。另外，還時常遇到表達(dá)產(chǎn)物的過度糖基化情況。第28頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三解決內(nèi)部降解的方法有三：一是在培養(yǎng)基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物，通過增加酶作用底物來緩解蛋白水解作用；二是將培養(yǎng)基的pH值調(diào)成酸性(酵母可在pH3.0~8.0的范圍內(nèi)生長)，以抑制中性蛋白酶的活性；三是利用蛋白酶缺失酵母突變體進(jìn)行外源基因的表達(dá)。第29頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三2.常用酵母表達(dá)系統(tǒng)(宿主-載體系統(tǒng))

（1）釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表達(dá)系統(tǒng)（2）甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)

（3）裂殖酵母(Schizogenesispombe)表達(dá)系統(tǒng)第30頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三（1）釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)釀酒酵母本身含有質(zhì)粒，其表達(dá)載體可以有自主復(fù)制型和整合型兩種。第31頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三自主復(fù)制型質(zhì)粒自主復(fù)制型質(zhì)粒通常有30個或更多的拷貝，含有自動復(fù)制序列(automaticreplicatingsequence，ARS)，能夠獨立于酵母染色體外進(jìn)行復(fù)制，這些質(zhì)粒往往不穩(wěn)定。第32頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三整合型質(zhì)粒不含ARS整合型質(zhì)粒不含ARS，必需整合到染色體上，隨染色體復(fù)制而復(fù)制。整合過程是高特異性的，但是拷貝數(shù)很低。為此，人們設(shè)計了pMIRY2(formultipleintegrationintoribosomalDNinyeast)質(zhì)粒，旨在將目的基因靶向整合到rDNA簇上(rDNA簇為酵母基因組中串聯(lián)存在的150個重復(fù)序列)，因此利用pMIRY2質(zhì)?？梢缘玫?00個以上的拷貝。第33頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三釀酒酵母表達(dá)的外源蛋白質(zhì)往往被高度糖基化，糖鏈上可以帶有40個以上的甘露糖殘基，產(chǎn)物的抗原性明顯增強(qiáng)。所以，釀酒酵母常常用來制備亞單位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。第34頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三（2）甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)甲醇營養(yǎng)型酵母包括漢森酵母屬(Hansenula)畢赤酵母屬(Pichia)球擬酵母屬(Torulopsis)等能在以甲醇為唯一能源和碳源的培養(yǎng)基上生長，甲醇可以誘導(dǎo)它們表達(dá)甲醇代謝所需的酶，如醇氧化酶I(AOX1)，二羥丙酮合成酶(DHAS)、甲酸脫氫酶(FMD)等。第35頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)以巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)最為常用，它由野生型石油酵母Y11430突變而來，常用的3株宿主菌是GS115，KM71和MCIO0-3。第36頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三GS115和KM71是Y11430的組氨醇脫氫酶基因(histidinoldehydrogenasegene，h/s4)缺失突變體，不能合成H/s4，因此質(zhì)粒載體需攜帶h/s4，轉(zhuǎn)染后的陽性重組子可以用h/s4缺陷(h/s4-)平板進(jìn)行篩選。第37頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三巴斯德畢赤酵母包括自我復(fù)制型游離載體和整合型載體，前者極不穩(wěn)定，因此一般采用整合型載體。整合型載體含有一個啟動子、相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄終止密碼、篩選標(biāo)記、抗生素抗性基因、在細(xì)菌中進(jìn)行拷貝增殖所必需的序列以及3‘AOX1非編碼區(qū)序列P。第38頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三巴斯德畢赤酵母具有翻譯后修飾功能，如信號肽加工、蛋白質(zhì)折疊、二硫鍵形成和糖基化作用等其與糖基化位點其他哺乳動物細(xì)胞相同，一般只有8~14個甘露糖殘基，特別適合于生產(chǎn)醫(yī)藥用重組蛋白質(zhì)。第39頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三（3）裂殖酵母表達(dá)系統(tǒng)裂殖酵母不同于其他酵母菌株，它具有許多與高等真核細(xì)胞相似的特性，它所表達(dá)的外源基因產(chǎn)物具有相應(yīng)天然蛋白質(zhì)的構(gòu)象和活性。第40頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三3.利用酵母菌表達(dá)外源基因的步驟以巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因為例，包括如下步驟：將目的基因克隆入畢赤酵母表達(dá)載體，收獲陽性重組表達(dá)質(zhì)粒用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化陽性重組質(zhì)粒，使之線性化將線性化的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化人巴斯德畢赤酵母菌株(如GS115，KM71)將轉(zhuǎn)化物接種HIS4缺陷平板進(jìn)行第一輪篩選用不同濃度的G418（一種氨基糖苷類抗生素）平板進(jìn)行第二輪篩選挑選10~20個克隆進(jìn)行小規(guī)模誘導(dǎo)培養(yǎng)，鑒定外源基因的表達(dá)量挑選高水平表達(dá)菌株進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)培養(yǎng)以制備外源基因的表達(dá)蛋白質(zhì)。第41頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三4.在酵母表達(dá)載體中高效表達(dá)外源基因的策略（1）增加整合在酵母染色體上的目的基因劑量適當(dāng)增加目的基因整合到酵母染色體上的拷貝數(shù)(即基因劑量)是有效提高外源基因表達(dá)量的基本策略。第42頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三Clare等在利用畢赤酵母表達(dá)破傷風(fēng)毒素片段時發(fā)現(xiàn)，重組蛋白質(zhì)的表達(dá)量與外源基因片段表達(dá)單元整合到酵母染色體上的拷貝數(shù)直接相關(guān)。表達(dá)單元拷貝數(shù)越多，酵母分泌的重組蛋白質(zhì)量越高。Vassi|eva等叫在利用畢赤酵母研究乙肝表面抗原的表達(dá)時報道，基因劑量與表達(dá)水平呈明顯的依賴性關(guān)系，4個拷貝的基因劑量可以使表達(dá)水平提高4倍。第43頁，共48頁，2023年，2月20日，星期三（2）控制外源基因中的AT含量研究發(fā)現(xiàn)外源基因的AT含量直接影響其整合表達(dá)。Score等在研究HIV-1外殼蛋白的酵母表達(dá)時發(fā)現(xiàn)，A含量過高可以提前終止轉(zhuǎn)錄，得不到全長蛋白